АГЕНТ РЕГУЛИРОВАНИЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ КЛЕТОК КОЖИ, КУЛЬТУРАЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КЛЕТОК ИЛИ ТКАНЕЙ И СПОСОБ РЕГУЛИРОВАНИЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ КЛЕТОК КОЖИ Российский патент 2000 года по МПК A61K7/00 C12N5/00 

Настоящее изобретение относится по существу к применению экдистероида в качестве агента регулирования дифференциации клеток кожи для приготовления косметических или дерматологических композиций, предназначенных особенно для усиления функции водного барьера кожи или для получения питательной среды клеток, кожи, а также к полученным композициям.

Экдистероиды представляют собой группу 2,3,14-тригидрокси- Δ -7-6-кетостероидов. Можно назвать α- экдизон или (2β,3β,14α-22 [R], 25-пентагидрокси-7-холестен-6-он); 2-дезокси-экдизон или (3β,14β, 22 [R], 25-тетрагидрокси-5 β -7-холестен-6-он); экдистерон или β- экдизон или 2β,3β,14α,20β, 22,25-гексагидрокси-7-холестен-6-он; β -экдизон-22-ацетат или 20-гидроксиэкдизон-22-ацетат или 7-холестен -2β,3β, 14, 20, 22 [R], 25-гексол-6-он-22-ацетат; 5-гидроксиэкдистерон или 5β, 7-холестен -2β,3β,5α, 14, 20, 22 [R] , 25-гептагидрокси-6-он; β-2-дезоксиэкдизон или 3β, 14, 20, 22 [R], 25-пентагидрокси -5β, 7-холестен-6-он. Экдистероиды, и в особенности экдистерон (в некоторых случаях называемый как β-экдизон или еще крустэкдизон), хорошо известны в литературе и цитируются в Merck Index, 10-е издание, 1983, с. 505, N 3 470.

Известно, экдистероиды, и в особенности экдистерон, играют важную роль как в мире животных у насекомых, так и в мире растений. У насекомых эти гормоны играют ключевую роль в росте и воспроизводстве. Экдистерон в особенности принимает участие в разных метаморфозах вплоть до появления взрослого насекомого (см. публикацию CNRS: Biologie 1990 "Enqeuxet Problema tiqus" A. Berkaloff и др.).

В случае растений активность этих веществ совершенно не ясна. По-видимому, они воздействуют на цветение (CIENCIА e Cultura (1980), т. 32, N 10, с. 1384-1390).

Заявителем найдено, что экдистероиды, в особенности экдистерон и его ацилированные производные, особенно ацетилированные производные, регулируют дифференциацию кератиноцитов.

Эта дифференциация выражается в частности, на уровне эпидермиса, в большей клеточной когезии, в регуляции трансформации кератиноцитов в корнеоциты за счет потери ядра и в увеличении клеточной ороговелости, в увеличении числа корнеоцитных слоев, обрадующих роговой слой, причем совокупность этих явлений способствует приданию коже более гладкого и более приятного внешнего вида, усилению защитной функции кожи по отношению к внешней среде и усилению водного барьера, препятствующего чрезмерной потере воды эпидермисом; и, на уровне волосяных фолликул, в регуляции, даже в увеличении, синтеза кератиноцитами кератина, основной составляющей стержня волоса.

Более подобно о дифференциации кератиноцитов описано в статье Eckert и Rorke, опубликованной в журнале Environnement Health Perspective 30 (1989), с. 109-116.

Таким образом, основной целью настоящего изобретения является решение технической задачи, заключающейся в том, чтобы регулировать или способствовать дифференциации кератиноцитов и, тем самым, лечить кожные нарушения, сопровождающиеся нарушением дифференциации кератиноцитов, такие как псориаз, восстанавливать, предохранять и/или усиливать защитную функцию эпидермиса, особенно за счет улучшения или усиления рогового слоя, и функцию водного барьера, приводящую таким образом к гидратирующему эффекту за счет препятствования чрезмерной потере воды эпидермисом, причем предпочтительным применением изобретения является лечение зараженной псориазом кожи и улучшение качества волос, придавая таким образом прекрасный внешний вид шевелюре.

Другая цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы благоприятствовать, ускорять и улучшать дифференциацию клеток кожи, в частности, кератиноцитов, во время их культивирования в питательной среде.

Первая из этих технических задач согласно настоящему изобретению впервые решается с помощью косметических или дерматологических композиций или культуральных сред для массового культивирования клеток кожи, включающих экдистероид.

Так, согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к использованию по крайне мере одного экдистероида или по крайней мере одного производного экдистероида или по крайней мере одного растительного или животного экстракта, содержащего вышеуказанный экдистероид или вышеуказанное производное экдистероида, для приготовления косметической или дерматологической композиции, предназначенной для лечения кожных нарушений, сопровождающихся нарушениями дифференциации кератиноцитов, таких как псориаз, для восстановления, предохранения и/или усиления защитной функции кожи, особенно за счет улучшения или усиления рогового слоя, и функции водного барьера, так же как когезии клеток эпидермиса, или улучшения структурного качества волос; или для приготовления среды для культивирования клеток или тканей, особенно для массового культивирования клеток кожи, в особенности кератиноцитов.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления используют комбинацию нескольких экдистероидов или производных экдистероидов, или комбинацию по крайней мере одного экдистероида и содержащего его растительного или животного экстракта.

Согласно особому варианту реализации вышеуказанный экдистероид представляет собой экдистерон или производное экдистерона, особенно его ацилированное, гидроксилированное или дезоксилированное производное.

Согласно предпочтительному варианту реализации вышеуказанным ацилированным производным является моно- или полиацетат экдистерона.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения производное экдистерона выбирают в группе, включающей бета-экдизон-2-ацетат, бета-экдизон-3-ацетат, бета-экдизон-2,3-диацетат, бета-экдизон-2,3,22-триацетат, бета-экдизон-2,3,22,25-тетраацетат, 5-гидроксиэкдистерон и 2-дезоксиэкдистерон.

Согласно следующей предпочтительной характеристике изобретения вышеуказанный растительный или животный экстракт, содержащий экдистероид, предпочтительно экдистерон, представляет собой экстракт из Achyranthes bidentata, Parisaxialis, Paris fargrsii, Paris dunniana, Paris vietnamensis, Paris polyphylla, Polypodium vulgare, Cyanotis arachnoidea, Ajuga decumbens, Pfaffia paniculata, Pfaffia iresinoides, Vitex glabrata, Achyranthes aspera, Sesuvium portu Lacstrum, Serratula sogdiana, Rhaponticum integrifolium, Rhaponticum (или Leuzea) carthamoides, Silene tatarica, Silene otites, Silene scabrifolia, Silene nutans, Silene brahuica, Silene traemixta, Silene dioca, Lychnis flos-cuculi, Ajuga iva, Serratula tinctoria, Cyathula officinalis, Cyathula capitata или Bombyx mori.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления предпочтительными экстрактами из растений являются экстракты из Polypodium vulgare, Ajuga decumbens, Cyanotis orachnoidea, Achyranthes bidentata и Rhaponticum (или Leuzea) carthamoides.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления используют комбинацию, состоящую из экдистерона и по крайней мере одного из его моно- или полиацетатов, в особенности 2- или 3-ацетата, или растительный экстракт, содержащий такую комбинацию. В самом деле наблюдают, что ацетатные производные экдистероида в сочетании с экдистероном усиливают вышеуказанные активности согласно изобретению. Эта активность еще усиливается с помощью дополнительной комбинации с ajuga- стероном C, в случае необходимости, в его 2- или 3-моноацетатной форме.

Согласно другой особой характеристике изобретения экдистероид или его производное, или содержащий его растительный или животный экстракт, может быть включен, по крайней мере частично, в липосомы.

Следует заметить, что под выражением "включен по крайней мере частично в липосомы" понимают, что экдистероид или его производное, или содержащий его растительный или животный экстракт, комбинируется с липосомами, какая бы ни была форма этой комбинации. Иными словами, в рамках изобретения экдистероид или его производные или содержащий его растительный или животный экстракт, может быть полностью инкапсулирован, частично инкапсулирован, или может быть просто снаружи в присутствии липосом.

Получение липосом, содержащих частично по крайне мере один экдистероид согласно изобретению, может быть реализовано согласно одному из известных способов введения активных веществ, особенно стероидов, в липосомы.

Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения используют способ атомизации компонентов липидной фазы, позволяющий получать порошок, легко диспергирующийся в водном растворе с образованием липосом, например, согласно способу, описанному в патенте США A-4508703. Таким образом полученная суспензия липосом может быть гомогенизирована с помощью ультразвука, или в случае массового производства, путем гомогенизации под давлением, согласно способу, описанному в патенте США A-4621023.

Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения экдистероид или его производное или содержащий его растительный или животный экстракт внедряют в липидную (жировую) фазу липосом. Таким образом, экдистероид или его производное, или содержащий его экстракт, вместе с составляющими липидной фазы, перед атомизацией, растворяют в органическом растворителе, содержащем по крайней мере один амфифильный липид, такой как лецитин сои, и в случае необходимости липофильное гидрофобное соединение, такое как холестерин или β-ситостерин. Предпочтительно, растворитель выбирают среди дихлорметана, хлороформа или метанола, или их смесей.

Органический раствор предпочтительно может содержать антиокислитель, окислитель, такой как α-токоферол.

Полученный липидный порошок диспергируют в пригодной водной среде, например, в буферном растворе PBS, в растворе глюкозы или в растворе хлорида натрия. Таким образом получают суспензию липосом.

Согласно предпочтительному варианту реализации, особенно случае липосомной композиции, в случае необходимости после гомогенизации полученной композиции, липосомные композиции подвергают застудневанию путем смешения с гелем, таким как гель винилового полимера, в особенности имеющийся в продаже под торговым названием Carbopol^® 940. Эта процедура застудневания также описывает в патенте США A-4508703, в особенности в примерах.

Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения концентрация эндостероида составляет 0,001-30 вес.%, предпочтительно 0,01 - 10 вес.%, в расчете на липидную фазу вышеуказанных липосом.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации изобретения экдистероид или его производное или содержащий его растительный или животный экстракт по крайней мере частично включают в циклодекстрин. Для этой цели можно поступать хорошо известным специалисту образом. Например, циклодекстрин солюбилизируют в водном буфере, например, типа PBS. После этого при перемешивании и при комнатной температуре добавляют экдистероид или его производное или содержащий его растительный или животный экстракт, в эквимолекулярном количестве. Продолжают перемешивание до получения прозрачного раствора. Затем этот раствор используют для приготовления косметической или дерматологической композиции согласно изобретению. Поступают в случае комбинации так же, как описано выше. Благодаря этому включению в циклодекстрин, неожиданно значительно улучшают активность экдистероида или его производного, или содержащего его растительного или животного экстракта. Содержание циклодекстрина и экдистероида или его производного или содержащего его растительного или животного экстракта в растворе от солюбилизации может изменяться в широких пределах. Предпочтительно, эта концентрация для циклодекстрина составляет 0,1 - 5 вес.%, а для экдистероида 0,01 - 2 вес.%.

Экдистероиды или их производные, предпочтительно экдистерон или его производные, получают в изолированной форме или в виде экстракта из любых природных доступных источников, или способом химического синтеза. Основными природными источниками экдистероидов являются насекомые и главным образом большое число растений, таких как вышеуказанные растения. Также разработано некоторое число способов синтеза.

Экстракция из насекомых
Количество экдистероида, в особенности α- или β-экдизона, присутствующее в насекомых, крайне незначительно. У бабочки Bombyx mori оно составляет, например, 5 • 10⁶ вес.% в расчете на насекомое (см. A.Butenandt и др., Z. Naturforsch B. 9, 389 (1954)).

Следовательно, экстракция экдистероида из насекомых обычно не может составить промышленный способ получения.

Однако в патенте Швейцарии A-478565 на имя Hunger-Ricci описывается экстракция экдистерона из нимф или куколок, предназначенного назначенного для приготовления косметических композиций.

Экстракция из растений
Концентрация экдистероидов, в особенности экдистеронов, изменяется от одной разновидности растений к другой. Например, концентрация экдистерона составляет 0,025% в зернах Achyranthes aspera и 0,35% в растении Sesuvium portulacastrum. Содержания в процентах представляют собой весовые проценты в расчете на сухое вещество.

Из растений, которые могут быть использованы для экстракции экдистероидов, в особенности экдистерона, можно назвать: Serratula sogdiona и Rhaponticum inlegrifolium, которые обладают тем преимуществом, что их можно культивировать (см. Horticultural ABS OC051-01546 со ссылкой на "Растительные ресурсы" (1980), т. 16, N 2, с. 193-198 (выходящий в России журнал)).

Также можно назвать экстракции из:
- Serratula tinctoria (патент Венгрии HUT-029390);
- Serratula inermic (патент СССР 1146050);
- Achyranthes fauriei (патент Франции 1525385);
- Cyathula (патент Франции 1525385);
- Polypodium vulgare (патент США N 3527777);
- Cyanotis arachnoidea (С.А. 89176352, ссылка на публикацию NienSchui Lin и др., Acta Chimica Sinica, 1978, 36, N 2, с. 137-141);
- Ajuga Decumbens (патент Японии 46-014665);
- Pfaffia iresinoides (Derwent 88-045806) или патент Японии 63002928);
- Pfaffia paniculata (Derwent 84-052423 или патент Японии 59-010600);
- зерна Kaladana (патент ФРГ 2201991);
- Ipomea petaloidia (патент ФРГ 2834703);
- смолевки (патент Венгрии 029390 и патент СССР 924051).

Эти источники экдистероидов даны как не ограничивающие объема охраны изобретения и не являются исчерпывающими.

Некоторые экстракты могут содержать, кроме экдистерона, также ацетилированные производные (С.А. 89-176352).

Также можно получать экдистероиды согласно изобретению путем химического синтеза (см., например, патент США A-3354152; патент США 3354154; патент США 3378549; патент США 3455905; патент Франции 1494371; патент США 3440241; патент Франции 1524924; патент США 3378549 и патент Франции A-1498237).

Пример общего способа экстракции экдистероида, предпочтительно экдистерона, из растений описывается в Chem. Phart. Bull (1969), 17(2), 340-342, S. Imai и сотр.

Мацерируют свежее растение в пятикратном от его веса количестве метанола, гомогенизируют и отфильтровывают. Эту операцию повторяют второй раз. Экстракты концентрируют, добавляют воду до получения 30%-ного раствора метанола в воде.

Этот раствор экстрагируют гексаном, 30%-ную метанольную фракцию снова концентрируют и экстрагируют этилацетатом. Водную фракцию экстрагируют н-бутанолом. Бутанольный экстракт затем концентрируют путем выпаривания, затем обрабатывают остаток путем хроматографии на силикагеле, элюируя смесью хлороформ - метанол. Таким образом получают экдистерон после перекристаллизации из смеси этанола с этилацетатом в виде бесцветных игл.

Также можно получить моноацетилированные производные экдистероидов хорошо известными специалисту химическими путями. Например, экдистероид выделяют в присутствии смеси 1:5 по весу уксусной кислоты и пиридина, при комнатной температуре. Обычно оставляют реагировать в течение от 30 минут до 1 часа. Реакцию затем прекращают путем добавления метанола. Таким образом получают смесь различных моноацетатов экдистероида, которую можно разделять классическим образом с помощью хроматографии. Эти способом можно, например, получать моноацетаты экдистерона, соответственно, содержащие ацетатные группы в положении 2, 3, 22 и 25.

Кроме того, некоторое количество экдистероидов имеется в продаже. Например, экдистерон, 5-гидроксиэкдистерон, 2-дезоксиэкдистерон, экдистерон-22-ацетат, α-экдизон и 2-дезокси -α- экдизол выпускаются в продажу фирмой СИГМА под названием SIGMA H 5142, SIGMA P 9531, SIGMA D 7775, SIGMA H 5267, SIGMA E 9004, SIGMA D 7900.

Вышеописанные согласно изобретению композиции, содержащие экдистероид, предпочтительно экдистерон, или его производные, в случае необходимости в форме, по крайней мере частично, включенной в гидратированные липидные ламеллярные фазы или в липосомы, могут находиться в различных формах, используемых в косметике или в дерматологии. Например, эти композиции могут быть гелями, кремами, молочком или лосьонами.

Эти композиции, нанесенные на обрабатываемые участки кожи, обладают эффектом регулирования дифференциации кератиноцитов, благоприятствующим таким образом образованию или восстановлению эпидермиса хорошего качества, особенно на уровне рогового слоя, в особенности в том, что касается его состава и его структурной организации. Это позволяет, с одной стороны, особенно за счет усиленной клеточной когезии, придать эпидермису свойства оптимальной защиты по отношению к окружающим средам, и, с другой стороны, лечить нарушения эпидермиса, сопровождающиеся нарушением дифференции кератиноцитов.

Так, композиции согласно изобретению в особенности позволяют восстанавливать, предохранять и усиливать функцию защитного кожного барьера эпидермиса, в особенности водного барьера, и получать таким образом гидратирующий эффект, препятствуя чрезмерной потере воды эпидермисом. Композиции согласно изобретению, следовательно, предпочтительно можно использовать для обработки (лечения) сухой кожи, какова бы ни была степень сухости, включая туда же ихтиозные кожи, и для лечения пораженной псориазом кожи.

Согласно второму аспекту изобретение также относится к косметической или дерматологической композиции, предназначенной для лечения кожных нарушений, сопровождающихся нарушениями дифференциации кератиноцитов, таких как псориаз, для восстановления, предохранения и/или усиления защитной функции кожи, особенно для усиления или улучшения рогового слоя, и функции водного барьера, так же, как когезии клеток эпидермиса, или еще для улучшения структурного качества волос, отличающейся тем, что она содержит в качестве активного агента экдистероид или производное экдистероида, или растительный или животный экстракт, содержащий вышеуказанный экдистероид или вышеуказанное производное экдистероида, такой (такое) как указанный выше.

Согласно следующему предпочтительному варианту реализации косметическая или дерматологическая композиция согласно изобретению обладает гидратирующей способностью, особенно препятствуя чрезмерной потере воды эпидермисом, и может быть предназначена для обработки сухих кож, особенно ихтиозных кож.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации косметическая и дерматологическая композиция согласно изобретению позволяет восстанавливать нормальную дифференциацию кератиноцитов и может быть предназначена для лечения пораженных псориазом кож.

В рамках настоящего изобретения обычно экдистероид или производное экдистероида включается в косметически или дерматологически приемлемый эксципиент. Также вышеуказанный экдистероид или вышеуказанное производное экдистероида, или экстракт из растения, содержащий его, может быть включен в гидратированные липидные ламеллярные фазы или в липосомы, как это описано в предыдущем первом аспекте.

Согласно третьему аспекту изобретение относится к питательной среде (среде культивирования) клеток или тканей, особенно для массового культивирования клеток кожи, отличающейся тем, что он содержит эффективное количество по крайней мере одного экдистероида или по крайней мере одного производного экдистероида или по крайней мере одного содержащего его растительного или животного экстракта.

Согласно четвертому аспекту изобретение относится к способу ускорения или улучшения дифференциации клеток кожи, в особенности кератиноцитов, особенно при массовом культивировании клеток кожи, для получения искусственной кожи или моделирования восстановленной кожи, отличающемуся тем что используют питательную среду, содержащую экдистероид, или его производное.

Этот способ согласно изобретению, называемый клеточной дифференциацией, представляет большой промышленный интерес, и может быть использован, например, в следующих областях:
- производство биохимических медиаторов, в котором требуется обработка массовой культуры кератиноцитов в биореакторах;
- изготовление искусственной кожи для проведения пересадок кожи, причем способ изобретения особенно предпочтителен в случае аутотрансплантаций больших ожогов, благодаря выигрышу времени, которого достигают при изготовлении искусственной кожи. В особенности ускорение и улучшение дифференциации кератиноцитов выражаются в более быстром образовании рогового слоя хорошего качества;
- моделирование кожи, в том числе восстановленной кожи, предназначенное, например, для оценки кожной пенетрации или токсичности веществ или композиций, наносимых топическим путем, когда они предназначаются для локальной обработки или для системной обработки (особенно чрескожно).

Согласно одному предпочтительному варианту способ культивирования обычно включает приготовление питательной среды для роста человеческих кератиноцитов, содержащей основную питательную среду DMEM (Gibco^®), эпидермический фактор роста ("EGF"), 10% плодной телячьей сыворотки, изопротеренол и/или форсколин, а также гидрокортизон. Согласно изобретению в питательную среду вводят экдистероид или его производное или растительный или животный экстракт, содержащий его, такой как β-экдизон или одно из его производных, в частности ацетат, обычно концентрация его в питательной среде составляет 0,01 - 0,5 вес.%.

Согласно этому способу массовое культивирование клеток кожи осуществляют путем инокуляции кератиноцитов, которые иммобилизуют затем на носителях, таких как полые волокна, микрошарики, или микропористые матрицы, осуществляя это с помощью вышеуказанной питательной среды. Способ позволяет обеспечить перфузию питательной среды, чтобы иметь достаточное количество ее для роста и дифференциации даже тогда, когда биомасса значительная.

В питательной среде согласно предпочтительному варианту изобретения можно использовать 0,01 - 0,5 вес.% экдистероида, его производного или содержащего его экстракта из растений в расчете на общий вес конечной питательной среды.

С другой стороны, согласно особенно предпочтительному варианту реализации в косметическую или дерматологическую композицию можно вводить дополнительное действующее начало, в особенности действующее начало с гидратирующим эффектом, такое как гиалуроновая кислота.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу косметической обработки для восстановления, предохранения и/или усиления защитной функции кожи, включающей функцию водного барьера, для восстановления, предохранения и/или усиления рогового слоя и для улучшения конститутивного качества волос, отличающемуся тем, что на соответствующие участки кожи или волосяной покров соответствующего субъекта наносят косметически эффективное количество композиции, содержащей по крайне мере один экдистероид или по крайней мере одно производное экдистероида или по крайней мере один растительный или животный экстракт, содержащий его, в особенности в концентрации 0,0001 - 5 вес.%, предпочтительно 0,01 - 1 вес.%, в расчете на общий вес композиции.

Предпочтительно в различных предыдущих аспектах изобретения весовая концентрация экдистероида, производных экдистероида или содержащего его экстракта из растения, в косметической или дерматологической конечной композиции составляет 0,0001 - 5 вес.%, предпочтительно еще 0,01 - 1 вес.%, в расчете на общий вес композиции.

Другие цели, характеристики и преимущества изобретения поясняются подробно в нижеследующем описании, ссылаясь на несколько примеров реализации изобретения, данных просто в качестве иллюстрации и которые, следовательно, никоим образом не ограничивают объема охраны изобретения.

В примерах процентные данные указаны как весовые проценты, если не указано ничего другого.

Пример 1
Тест на активность в отношении дифференциации кератиноцитов
Для настоящего исследования используют образец кожи, который отбирают во время осуществления хирургической операции с эстетической целью типа "косметической реставрации" на лица женщин в возрасте 42 года.

В день f = -2,6 чашек Петри засевают с помощью 10⁵ клеток кератиноцитов, выделенных из этого образца, в классической питательной среде для культивирования кератиноцитов, хорошо известной специалисту.

В день f = 0 и в день f = 7, питательную среду обновляют идентичной средой в трех из шести чашек, которые представляют собой необработанные контрольные чашки, а в остальных трех чашках, которые представляют собой обработанные чашки, обновляют с помощью идентичной среды, но в которой растворено 250 мкг/мл экдистерона.

В день f = 12, реализуют подсчет клеток, так же, как включение клеток в эпоксидную смолу, после фиксации и маркировки клеточных структур в уранилацетате.

Делают срез с каждого из таким образом полученных блоков смолы в виде ультратонких слоев, например, с помощью приспособления, известного под названием микротом, и наблюдают в электронный микроскоп с трансмиссией.

В таблице указано это наблюдение для каждой из трех зон контрольной культуры, с одной стороны, и обработанной экдистероном культуры, с другой стороны.

Согласно вышеприведенной таблицы констатируют, что при использовании экдистерона согласно настоящему изобретению, получают культуру, образованную многочисленными очень различными слоями кератиноцитов, что демонстрирует регулирующее воздействие экдистероида, такого, как экдистерон, на дифференциацию кератиноцитов, причем очень значительным образом.

Также в связи с эффектом нормализации дифференциации кератиноцитов, композиции согласно изобретению, содержащие экдистероид, такой, как указанный выше, позволяют поддерживать хорошее состояние эпидермиса, "нормальной" кожи, особенно за счет поддерживания ее мягкости и ее функциональной роли, в особенности ее роли защитного барьера.

Композиции изобретения также можно предпочтительно использовать для гидратации кожи, для предохранения и обработки сухих кож, обладающих различными степенями сухости, включая туда ихтиозные кожи, или для лечения пораженных псориазом кож.

На деле, нужно заметить, что явление сухих кож или пораженных псориазом кож сопровождается нарушением дифференциации кератиноцитов, В особенности псориазные кератиноциты обеднены оболочками и незрелые, число и размер тонофиламентов ухудшены, некоторые клетки рогового слоя содержат еще органеллы, считая и ядро, что показывает, что дифференциация некорректная. Также в случае этих заболеваний наблюдают значительные межклеточные промежутки.

В случае сухих кож, в особенности в случае ихтиоза, дифференциация кератиноцитов несовершенная, сопровождающаяся аномалией (пороком развития) зерен кератогиалина и десмосом. Эпидермис имеет отклоняющуюся от нормы кератинизацию, что вызывает пертурбацию свойств барьера, особенно водного барьера, и потерю эластичности.

Ниже приводятся различные примеры промышленно используемых косметических или дерматологических композиций.

Пример 2
Дерматологическая композиция для восстановления водного барьера эпидермиса
экдистерон - 0,5 г
Cremophor RH40^® - 1 г
Carbomer 980^® - 0,2 г
триэтаноламин - 0,18 г
ПЭГ 6-32 стеарат - 7 г
цетиловый спирт - 2 г
растительные масла - 25 г
ароматизированный водный эксципиент до общего количества - 100 г
Вышеуказанные составляющие смешивают классическим образом для получения обрабатывающей эмульсии, наносимой утром и вечером, слегка массируя обрабатываемые участки. Эта эмульсия используется как дневной и/или ночной крем.

Пример 3
Дерматологическая композиция для лечения пораженных псориазом кож
экдистерон-2-ацетат - 0,3 г
гель Carbopo I 980^®,20%-ный - 35 г
ароматизированный водный эксципиент - до общего количества 100 г
Вводят экдистерон-2-ацетат в водный эксципиент для растворения экдистерон-2-ацетата в этом эксципиенте, затем добавляют гель Carbopo I, получая желатинированную композицию, которую наносят локально на пораженные места в течение 6 недель.

Пример 4
Косметическая композиция для поддерживания в состоянии удовлетворительной гидратации эпидермиса
экдистерон - 0,18 г
α-бисаболол - 0,1 г
гиалуроновая кислота - 1 г
мочевина - 3 г
косметически приемлемый эксципиент в виде молочка для тела - от общего количества 100 г
Молочко наносят на обрабатываемые зоны, в особенности на ноги после эпиляции. Эта композиция в особенности позволяет усиливать кожную функцию водного барьера эпидермиса за счет улучшения эпидермической межклеточной когезии. Она позволяет таким образом сохранять кожу в состоянии удовлетворительной гидратации.

Пример 5
Косметическая липосомная композиция для повторного уравновешивания десквамации рогового слоя эпидермиса и для получения снова гладкого эпидермиса
экдистерон - 0,1 г
соевый лецитин - 2 г
β- ситостерин - 0,2 г
косметическая эмульсия в виде крена на основе сквалана типа масла-в-воде - до общего количества 100 г
На первой стадии готовят водную суспензию липосом при инкапсулировании экдистерона в липидную фазу вышеуказанных липосом. Для этой цели поступают следующим образом:
0,1 г продажного экдистерона, 2 г соевого лецитина и 0,2 г β- ситостерина растворяют в 50 мл смеси 4:1 дихлорметана с метанолом. Этот раствор выпаривают при пониженном давлении (примерно 200 мм рт.ст.) в колбе ротационного испарителя при 45^oC. Полученную липидную пленку обрабатывают с помощью 25 мл водного раствора монокалийфосфата с концентрацией 0,2 г/л и динатрийфосфата с концентрацией 1,44 г/л, при перемешивании, в течение 1 часа.

Таким образом получают примерно 25 мл суспензии липосом, в которые инкапсулирован экдистерон, которую затем подвергают гомогенизации с помощью ультразвука (15 минут, 150 W, 4^oC).

Во второй стадии полученную суспензию липосом классическим образом вводят в эмульгированный эксципиент с целью получения крема согласно изобретению.

Крем можно наносить ежедневно на лицо в случае неровной (бугорчатой) или шелушащейся кожи.

Эта композиция усиливает когезию рогового слоя, регулирует удаление отмерших клеток, придавая таким образом эпидермису более гладкий вид.

Пример 6
Приготовление экстракта из растения Rhaponticum carthamoides
Измельчают в порошок 250 г высушенных корней растения Rhaponticum carthamoides, которые экстрагируют с помощью 2,5 л метанола в течение 2 часов при кипячении с обратным холодильником.

После тщательного отфильтровывания для удаления любой твердой частицы растворитель выпаривают вплоть до получения сухого продукта, называемого "экстракт из растения Rhaponticum carthamoides согласно изобретению" в так называемом сухом состоянии.

Этот неочищенный экстракт может быть использован для приготовления косметических и/или фармацевтических формулировок, так же как для получения питательной среды.

Пример 7
Приготовление экстракта из растения Achyranthes didentata
Поступают как описано в примере 6, если только используют сухие корни растения Achyranthes didentata.

Полученный продукт называется "экстракт из растения Achyranthes didentata согласно изобретению" в сухом состоянии.

Этот неочищенный экстракт можно использовать для приготовления косметических и/или фармацевтических формулировок, так же, как для получения питательных сред.

Пример 8
Косметическая композиция, содержащая экстракт из растения Rhaponticum carthamoides, предназначенная для предохранительной обработки сухих кож
экстракт из Rhaponticum carthamoides, полученный в примере 6 - 0,5 г
эксципиент в виде крем-эмульсии типа масло-в-воде - до общего количества 100 г
Классическим образом экстракт из Rhaponticum carthamoides вводят в эксципиент в виде крем-эмульсии для получения крема согласно изобретению.

Крем можно наносить ежедневно на части тела, которые хотят обработать.

Пример 9
Косметическая композиция, содержащая экстракт из растения Achyrauthes bideutata, предназначенная для обработки ихтиозных кож
глицерин - 3 г
гиалуроновая кислота - 1 г
экстракт из Achyrauthes bideutata, полученный в примере 7 - 0,2 г
эксципиент в виде крем-эмульсии типа масло-в-воде - до общего количества 100 г
Классическим образом экстракт из Achyrauthes bideutata так же, как глицерин и гиалуроновую кислоту, вводят в эксципиент в виде крем-эмульсии для получения крема согласно изобретению.

Этот крем ежедневно наносят на желательные участки кожи вплоть до получения намного более гладкой кожи благодаря воздействию на корнеоциты, что приводит к усилению их роговой оболочки и к лучшей когезии между ними.

Пример 10
Косметическая композиция для повторного уровновешивания состояния кожи, содержащая экдистероидную комбинацию
Предварительно готовят экдистероидную комбинацию следующего состава:
около 85% экдистерона;
около 13% рацемической смеси, содержащей 2- и 3-моноацетат экдистерона;
- около 2% ajuga-стерона C.

Экдистерон имеется в продаже. Его 2- или 3-ацетатные производные могут быть получены химическим путем согласно классическому способу осторожного ацетилирования в присутствии смеси уксусная кислота - пиридин, как это описано выше.

Ajuga-стерон C может быть получен путем экстракции из растения, в особенности из рода Ajuga, например, согласно способу, описанному в патенте Японии 71-028038, из растения Ajuga decumbeus.

Эти продукты растворяют в водно-спиртовой смеси (50%-ной). Раствор затем выпаривают досуха с получением вышеуказанной комбинации в виде порошка.

Затем эту комбинацию вводят в косметически приемлемый эксципиент в виде крем-эмульсии типа масло-в-воде, например, в количестве, достаточном для достижения концентрации 0,05% экдистероида, в расчете на общий вес таким образом полученной косметической композиции.

Пример 11
Косметическая композиция с гидратирующим и регенерирующим действием, содержащая комбинацию экдистероида и циклодекстрина
Экдистероиды в полученной в примере 10 комбинации диспергируют в концентрации 1% в водном растворе, содержащем 2,5% циклодекстрина, при перемешивании, вплоть до получения прозрачного раствора. Экдистероиды таким образом включаются в молекулы циклодекстрина. Этот раствор циклодекстрина, включающего экдистероиды, добавляют к эксципиенту в виде крем-эмульсии типа масло-в-воде, в количестве, достаточном для получения эмульсии, содержащей 0,1 вес.% экдистероида.

Эту композицию можно наносить ежедневно на желательные участки кожи для усиления ее состояния гидратации и получения намного более гладкой кожи.

Пример 12
Получение питательной среды и ее использование для массового культивирования клеток кожи
Для получения этой питательной среды и для ее использования при массовом культивировании клеток кожи специалист может обратиться к статье Philip C. Familletti и др. в Biotechnology, т. 6, январь 1988, с. 41-44 так же, как к цитированным в этой статье ссылкам, в особенности как Arathoon и др., в журнале Science (1986), 232, с. 1390 и другие; статье KU. K и др. в журнале Biotechnology Bioeng (1981), 23, с. 79 и последующие.

Таким образом, получают оптимальную питательную среду для роста человеческих кератиноцитов, включающую основную питательную среду DMEM (bibco), фактор роста EGF, 10% плодной телячьей сыворотки, изопротеренол и/или форсколин, и гидрокортизон.

Эта среда предпочтительно включает 20-гидроксиэкдизон или одно из его производных в концентрации 0,001 - 0,1%
Реализуют массовое культивирование клеток кожи, инокулируя кератиноциты, чтобы иммобилизировать их на носителях, таких как полые волокна, микрошарики, или микропористые матрицы, с помощью вышеописанной питательной среды. Перфузия сред в перфузионной системе типа таковой, описанной Sylvie Guichard-Balestrini в журнале Biofutur, приложение N 56, апрель 1987 г., с. 2-14, обеспечивается для того, чтобы иметь достаточную долю роста и дифференциацию даже тогда, когда биомасса значительная.

По окончании культивирования рекуперируют вещества, выделенные клетками кератиноцитов, содержащие в основном липиды, источники исходных материалов, для составления косметических или фармацевтических композиций для топического нанесения на эпидермис или волосяной покров.

Благодаря продукту изобретения можно обрабатывать восстанавливаемые культуры кожи, в особенности кератиноцитные культуры или культуры эпидермических клеток, культивируемые на соответствующем носителе, таком, как коллагеновый носитель (содержащий или не содержащий фибробласты), например, как описывается в La Rechrche (1987), 185, с. 149-159, и в Br.F. Dermatol, 1986, 114, 91-101, или носитель, образованный вырезанной кожей.

Благодаря использованию композиции согласно изобретению достигают более быстрой или более полной эпидермизации. Это позволяет в более короткие сроки иметь тип биологической повязки в медицине для аутотрансплантации, например, в случае обширных ожогов. Изобретение также позволяет реализовывать в промышленном масштабе восстановленные кожи хорошего качества для осуществления тестов на пенетрацию или толерантность.

Естественно, изобретение включает все способы (средства), образующие технические эквиваленты описанных способов, так же как их различные комбинации.

Изобретение относится к области косметологии и дерматологии. Культуральная среда для клеток содержит экдистероид, производное экдистероида или содержащий его растительный и/или животный экстракт - агент регулирования дифференциации клеток. Культуральная среда может быть предпочтительно использована в способе для массового культивирования кератиноцитов. Способ обеспечивает перфузию питательной среды, обеспечивая достаточное количество ее для роста и дифференциации даже когда биомасса значительная. Агент регулирования дифференциации клеток позволяет улучшить качество косметических и дерматологических композиций. 3 c. и 21 з.п.ф-лы, 1 табл.

1. Применение по меньшей мере одного экдистероида или его производного, и/или по меньшей мере одного растительного или животного экстракта, содержащего указанный экдистероид или его производного в качестве агента регулирования дифференциации кератиноцитов. 2. Применение по п.1 для улучшения когезии клеток эпидермиса, улучшения или усиления рогового слоя. 3. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что используют комбинацию по меньшей мере одного экдистероида и по меньшей мере одного экстракта, выбранного из растительного экстракта и животного экстракта, содержащих по меньшей мере один экдистероид. 4. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что в качестве экдистероида применяют экдистерон или его производное, например ацильное, гидроксилированное или дезоксилированное производное. 5. Применение по одному из пп.1 - 4, отличающееся тем, что ацилированное производное является моно- или полиацетатом экдистерона. 6. Применение по одному из пп.1 - 5, отличающееся тем, что экдистероид является производным экдистерона, выбранным из группы: бета-экдизон-2-ацетат, бета-экдизон-3-ацетат, бета-экдизон-2,3-диацетат, бета-экдизон-2,3,22-триацетат, бета-экдизон-2,3,22,25-тетраацетат, 5-гидроксиэкдистерон и 2-дезоксиэкдистерон. 7. Применение по одному из пп.1 - 6, отличающееся тем, что экстракт, содержащий экдистероид, предпочтительно экдистерон, или его производное, представляет собой экстракт из: Achyrantes bidentata, Paris axialis, Paris forgesii, Paris dunniana, Paris vietnamensis, Paris polyphylla, Polypodium vulgare, Cyanotis arachnoidea, Ajuga decumbens, Pfaffia paniculata, Pfaffia iresinoides, Vitex glabrata, Achyranthes aspera, Sesuvium portn lacastrum, Serratula sogdiana, Rhaponticum integrifolium, Rhaponticum (или Leuzea) carthamoides, Silene tatarica, Silene otites, Silene scabrifolia, Silene nutans, Silene brahuica, Silene traemixta, Silene dioca, Lychnis flos-cuculi, Ajnga iva, Serratula tinctoria, Cyatnula officinalis, Cyatnula capitata, Bombyx mori. 8. Применение по одному из пп.1 - 7, отличающееся тем, что экстракт, содержащий экдистероид, предпочтительно экдистерон, или его производное является экстрактом из: Polypodium vulgare cyanotis arachnoidea, Ajnga decumbens, Achyrantes bidentata и Rhaponticum (или Lenzea) carthamoides. 9. Применение по одному из пп.1 - 8, отличающееся тем, что указанный экдистероид выбирают из экдистерона, экдистеронмоноацетата, экдистеронполиацетата и экстракта, содержащего экдистероид. 10. Применение по п.9, отличающееся тем, что указанный экдистероид также включает вещество, выбранное из ajuga-стерона С и его 2- или 3-моноацетата. 11. Применение по одному из пп.1 - 10, отличающееся тем, что экдистероид или его производное, или содержащий экдистероид растительный или животный экстракт введен, по меньшей мере частично, в липосомы. 12. Применение по одному из пп.1 - 9, отличающееся тем, что экдистероид или его производное, или содержащий экдистероид растительный или животный экстракт включен, по меньшей мере частично, в циклодекстрин. 13. Применение по одному из пп.1 - 12, отличающееся тем, что экдистероид или его производное, или содержащий экдистероид растительный или животный экстракт включен в косметическую или дерматологическую композицию в количестве от 0,0001 до 5 вес.% по отношению к общему весу конечной композиции. 14. Применение по п.13, отличающееся тем, что композиция также содержит дополнительное активное начало. 15. Применение по п.14, отличающееся тем, что дополнительным активным началом является вещество с гидратирующим эффектом. 16. Применение по п.15, отличающееся тем, что дополнительным активным началом с гидратирующим эффектом является гиалуроновая кислота. 17. Применение по одному из пп.13 - 61, отличающееся тем, что косметическая или дерматологическая композиция предназначена для обработки сухой кожи, ихтиозной кожи или псориазной кожи или для улучшения структуры волос. 18. Применение по одному из пп.1 - 11, отличающееся тем, что по меньшей мере один экдистероид включен в культуральную среду для стимуляции дифференциации кератиноцитов при массовом культивировании клеток кожи или для получения искусственных трансплантатов кожи или восстановления кожи. 19. Культуральная среда клеток или тканей для массового культивирования клеток кожи, отличающаяся тем, что она содержит эффективное количестве по меньшей мере одного экдистероида, или по меньшей мере одного производного экдистероида, или по меньшей мере одного содержащего экдистероид растительного или животного экстракта. 20. Культуральная среда по п.19, отличающаяся тем, что содержание в ней экдистероида, или производного экдистероида, или содержащего экдистероид растительного или животного экстракта составляет 0,01 - 0,5% по отношению к общей массе культуральной среды. 21. Культуральная среда по п.19 или 20, отличающаяся тем, что указанный экдистероид выбирают из экдистерона, экдистеронмоноацетата, экдистеронполиацетата, содержащего экдистерон растительного экстракта, бета-экдизон-2-ацетата, бета-экдизон-3-ацетата, бета-экдизон-2,3-диацетата, бета-экдизон-2,3,22-триацетата, бета-экдизон-2,3,22,25-тетраацетата, 5-гидроксиэкдистерона и 2-дезоксиэкдистерона. 22. Способ регулирования дифференциации клеток кожи для массового культивирования клеток кожи, для получения искусственных трансплантатов кожи или для восстановления кожи, отличающийся тем, что инокулируют клетки кожи в культуральной среде по одному из пп.19 - 21. 23. Способ по п.22, отличающийся тем, что используют весовую концентрацию экдистероида, производного экдистероида или содержащего экдистероид растительного или животного экстракта 0,01 - 0,5 вес.% по отношению к общей массе конечной культуральной среды. 24. Способ по п.21 или 23, отличающийся тем, что клетки кожи представляют собой кератиноциты.