СПОСОБ КОРРЕКЦИИ ДИСТРОФИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ СЕТЧАТКИ ПРИ ЕЕ ПАТОЛОГИИ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА Российский патент 2004 года по МПК A61F9/00 C12N5/00 

Изобретение относится к офтальмологии и предназначено для лечения некоторых видов патологии сетчатки (дистрофий различного генеза, посттравматических изменений, поражений сетчатки при общих заболеваниях).

Несмотря на широкий выбор обычно применяемых способов лечения, восстановление структурной организации сетчатки и ее функциональной активности остается актуальной проблемой. Многочисленные медикаментозные средства, физиотерапевтические методы, лазерные и хирургические вмешательства не обладают достаточной эффективностью (Лысенко В.С. Разработка патогенетически ориентированных комплексных методов лечения инволюционных центральных хориоретинальных дистрофий: Диссерт. канд. мед. наук. С.5-25). Поэтому клиническое улучшение оказывается нестойким, патологический процесс продолжает прогрессировать, приводя к значительному снижению зрения. Отсюда понятна необходимость поиска новых современных способов коррекции данной патологии.

Известно использование пептидных биорегуляторов в офтальмологии. В 1985 г. в Военно-Медицинской академии (г. Санкт-Петербург) В.Х. Хавинсон и соавторы из сетчатки глаза крупного рогатого скота выделили комплекс пептидов, стимулирующих функцию сетчатки, который получил название ретилин или ретиналамин (RU 2073518, 20.02.97 - ближайший аналог). Лечение с использованием ретилина проводили больным, страдающим центральной хориоретинальной дистрофией сетчатки, диабетической ретинопатией, пигментной абиотрофией сетчатки, а также в комплексе с микрохирургическим лечением при ранениях и контузиях глаза (Трофимова С.В. Применение пептидных биорегуляторов при лечении диабетической ретинопатиии: Автореф. дис. канд. мед. наук. - СПб., 1999; Максимов И.Б. Комплексная пептидная коррекция при микрохирургическом лечении травм глаза и их последствий: Автореф. дис. д-ра мед. наук. - М., 1996). Механизм действия пептидных биорегуляторов основан на восстановлении и сохранении регуляторных механизмов межклеточного взаимодействия, что проявляется, в частности, восстановлением синтеза тканеспецифических белков.

Однако биорегулирующая терапия направлена на улучшение трофики вообще и эффективна на ранних стадиях патологического процесса.

В связи с этим нами проявлен интерес к вопросу о целесообразности использования культивированных in vitro нейрональных стволовых клеток человека при некоторых видах патологии сетчатки.

Стволовые клетки - это резерв экстренной репарации в случае массивных, аварийных повреждений тканей. На долю стволовых клеток приходится около 0,1-0,01% всей клеточной массы органа. Дисбаланс количества и активности самообновления дифференцированных клонов стволовыми клетками является первопричиной многих поражений на клеточном уровне. Стволовые клетки обладают рядом существенных достоинств: могут обеспечивать регенерацию поврежденных участков через продукцию различных факторов роста и ключевых метаболитов; способны разворачивать программы эмбриогенеза и дифференцировки, восполняя тем самым недостаток активно работающих клеток. Трансплантация стволовых гематогенных клеток широко используется при лечении лейкозов. Заместительная клеточная терапия с использованием нейрональных стволовых клеток апробирована в клинике для лечения больных инсультом. В результате имплантации донорских клеток отмечено клиническое улучшение у большинства больных (Kondziolka D., Wechstler L., Goldstein S et al. // Am. Soc. Neur. Transpl., Repair. - 2000. - Vol.7. - P.28). В офтальмологии возможности использования стволовых клеток изучены мало.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является ускорение репаративной регенерации сетчатки при использования суспензии культивированных in vitro нейрональных стволовых клеток.

Технический результат достигается за счет трансплантации суспензии нейрональных стволовых клеток в ретробульбарное пространство.

Источником донорского материала является ткань мозга эмбрионов человека 1-го триместра гестации (8-12 недель). Абортивный материал получают из лицензированных учреждений МЗ РФ, действующих в рамках законодательстьва РФ об охране здоровья граждан и в соответствии с утвержденным перечнем медицинских показаний (Приказ министра здравоохранения №302 от 28.12.93 "Об утверждении перечня медицинских показаний для искусственного прерывания беременности" и Приложения к этому приказу №3 от 05.04.94). Культивирование осуществляют в бессывороточной среде, состоящей из DMEM (50%), F12 (50%), основного фактора тоста фибробластов (hFGF-b), эпидермального ростового фактора (hEGF) и фактора выживаемости нейрональных клеток (N2-supplement) (C.N. Svendsen, M.G. ter Borg, R.J.E. Armstrong, A.E. Rosser, S. Chandran, T. Ostenfefeld, M.A. Candwell. A new method for rapid and long-term growth of human neural precursor cells // J. Neirosci. Methods. 85 (1998) 141-152).

Непосредственно перед трансплантацией суспензию клеток тщательно отмывают от культуральной среды, подсчитывают количество жизнеспособных клеток с помощью йодида пропидия и трипанового синего и суспензируют в минимальном количестве физиологического раствора. Для лечения используют суспензию нейрональных стволовых клеток с концентрацией 5 млн клеток в 1 мл. Доза вводимых нейрональных стволовых клеток отработана экспериментально. Время пребывания размороженного материала при положительной температуре не должно превышать 2 часа.

Способ осуществляют следующим образом. Методом инъекции в ретробульбарное пространство трансплантируют культивированные нейрональные стволовые клетки в виде суспензии в дозе 5 млн клеток в 1 мл физиологического раствора.

Пример 1. В качестве модели дистрофии сетчатки мы взяли экспериментальную токсическую дистрофию сетчатки, вызванную путем внутривенного введения 4% раствора монойодуксусной кислоты (МЙУК) из расчета 10 мг на 1 кг массы кролика по методу Noell W.K. (Noell W.K. Corneal cheuges durind pilocarpine gel theapy // Ameer. J. Ophthalmolm. - 1951. - Vol.101, №l. - P.l3-15; Noell W.K. Monin dected comtal ulcers // Ophthalmology. - 1958. - Vol.14, №1. - P.44-51). Степень повреждения сетчатки оценивали по показателям функционального состояния, а именно по уровню ее биоэлектрической активности, определяемой методом электроретинографии. Указанная доза МЙУК вызывает тяжелую степень повреждения сетчатки. Через 20 мин после введения амплитуда волны "b" составляла в среднем 20% от исходного значения. На следующий день после введения МЙУК методом инъекции в ретробульбарное пространство трансплантировались культивированные нейрональные стволовые клетки в дозе 5 млн клеток в 1 мл физиологического раствора. ЭРГ регистрировали в обеих группах - контрольной и опытной (по 10 глаз в каждой группе) - на 3, 5, 10, 20 сутки от начала эксперимента. Полученные данные показывают, что применение нейрональных стволовых клеток в опытной группе приводит к достоверному повышению волны "b" ЭРГ по сравнению с глазами контрольных животных. Лечебный эффект нейрональных стволовых клеток обнаруживался в среднем на 10 сутки наблюдения. Амплитуда волны "b" ЭРГ у опытных животных к 20 суткам достигала 35% от исходного уровня и почти в 2 раза превышала таковую в контрольной группе.

Таким образом, результаты проведенных исследований позволяют утверждать, что при токсических повреждениях сетчатки нейрональные стволовые клетки обладают выраженным лечебным эффектом.

Пример 2. Изучение влияния трансплантации нейрональных стволовых клеток на репаративные процессы в сетчатке на модели лазерного повреждения. Повреждение сетчатки при сверхпороговом лазерном воздействии характеризуется, как правило, нарушением ультраструктуры клеток ретины вплоть до изменения архитектоники хориоретинальной области и кровоизлияний в сетчатку. Повреждение сетчатки как результат прямого термического воздействия лазерного излучения развивается в пигментном эпителии сетчатки, сопровождается некрозом ядер в наружном зернистом слое, некрозом внутренних и наружных сегментов фоторецепторов. Лазерное повреждение сетчатки кролика (всего 10 животных) проводилось с использованием аргоновой лазерной установки. Сразу после лазерного повреждения в правый (опытный) глаз каждого кролика путем инъекции в ретробульбарное пространство трансплантировались нейрональные стволовые клетки (в виде суспензии в дозе 5 млн клеток в 1 мл физиологического раствора). В левый (контрольный глаз) тем же способом вводили физиологический раствор. При клиническом исследовании переднего отрезка глаза каких-либо признаков воспалительной или аллергической реакции выявлено не было, что свидетельствует об отсутствии иммунного конфликта. При офтальмоскопии отмечено, что в опытной группе появление пигмента в области лазерного повреждения начиналось с 4-5-х суток, в контрольной же группе - с 7-8-х суток. Пигментация коагулятов на фоне применения НСК завершалась к 18-20-м суткам, при введении физраствора - только к 25-м суткам. Результаты гистологического исследования показали, что в контрольных глазах наблюдалось полное разрушение слоев сетчатки в области повреждения, тогда как в опытных глазах к 10-му дню наблюдения структура сетчатки в зоне коагуляции была частично восстановлена, а к 21-му дню имелась почти полная реконструкция поврежденных слоев, что указывает на усиление процессов репаративной регенерации сетчатки при трансплантации нейрональных стволовых клеток.

Учитывая возможность постоянно располагать запасом донорского материала, а также эффективность и простую методику трансплантации, применение нейрональных стволовых клеток представляется перспективным для коррекции дистрофических изменений сетчатки при ее патологии различного генеза.

Изобретение относится к офтальмологии и предназначено для коррекции дистрофических изменений сетчатки при ее патологии различного генеза. Проводят трансплантацию суспензии культивированных нейрональных стволовых клеток человека. Суспензию вводят ретробульбарно в количестве 5 миллионов клеток в 1 мл физиологического раствора. Способ позволяет добиться ускорения процессов репаративной регенерации сетчатки реципиента.

Способ коррекции дистрофических изменений сетчатки при ее патологии различного генеза, отличающийся тем, что в ретробульбарное пространство трансплантируют суспензию культивированных нейрональных стволовых клеток в дозе 5 млн клеток в 1 мл физиологического раствора.