СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОКАТАЛИЗАТОРА ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА СПИРТОСОДЕРЖАЩИХ ИГРИСТЫХ НАПИТКОВ Российский патент 2004 года по МПК C12N11/04 C12G1/73 

Изобретение относится к пищевой биотехнологии, конкретно к способу получения иммобилизованных биокатализаторов на основе дрожжей, включенных в матрицу гелевого носителя, которые способны эффективно осуществлять брожение исходного материала (солодовое и виноградное сусло, виноматериал, фруктовый сок и т.п.) при получении спиртосодержащих игристых напитков.

Помимо традиционных методов получения спиртосодержащих игристых напитков (игристые виноградные вина, пиво, сидр и др.) с помощью свободных дрожжевых клеток в последнее время большое внимание уделяется разработкам способов проведения бродильного процесса с помощью иммобилизованных клеток, что необходимо для повышения технологичности длительного процесса в целом и, в особенности, стадии ремюажа (удаление дрожжей из конечного напитка). При этом наиболее перспективным считается помещение биомассы в матрицу полимерного геля - так называемая иммобилизация методом включения [Cantarelli С.; Lanzarini G. Biotechnology applications in beverage production // London, New-York: Elsevier, 1989, 257 p.].

Известен способ [пат. Франции №2432045 (1980)] получения биокатализатора для производства игристых вин. Данный биокатализатор получают суспендированием дрожжевых клеток в растворе альгината натрия с последующим дозированием по каплям в раствор хлористого кальция и дальнейшим выдерживанием там образовавшихся гелевых частиц для их уплотнения, после чего следует промывка от соли кальция полученного биокатализатора (клетки, включенные в полимерный гель). Такой биокатализатор обладает хорошей бродильной активностью и легко сводится на тиражную пробку после выдержки в бутылке с вином. В результате значительно сокращается длительность ремюажа. Однако недостатком данного биокатализатора является то, что во время шампанизации вин и в период их выдержки, наблюдается выход клеток из матрицы носителя в вино, вызывая тем самым его помутнение, что ухудшает качество получаемого игристого вина.

Известен способ [Европейский пат. №0173915 (1985)] получения биокатализатора, предназначенного для шампанизации виноматериала бутылочным методом, в котором для предотвращения помутнения игристых вин во время их производства с использованием иммобилизованных дрожжей частицы готового биокатализатора (дрожжи, иммобилизованные в гель альгината кальция по методу, аналогичному описанному выше) покрывают дополнительным слоем альгината кальция, но уже без клеток. Согласно этому способу такой биокатализатор получают суспендированием биомассы дрожжей Saccharomyces bayanus в предварительно проавтоклавированном 3,3%-ном растворе альгината натрия с последующим введением полученной смеси по каплям в 2%-ный раствор хлористого кальция, в результате чего получают сферические гранулы биокатализатора диаметром около 3 мм, которые оставляют в 2%-ном растворе СаСl₂ на 30 минут. После этого биокатализатор многократно промывают проточной водой и затем помещают в 0,2-0,5%-ный раствор альгината натрия и встряхивают на качалке в течение 5 минут. Далее обработанные гранулы биокатализатора промывают проточной водой и помещают на 1 час в 2%-ный раствор CaCl₂. После выдержки биокатализатор промывают проточной водой и используют по назначению. При этом в результате ферментации виноматериала с участием подобного биокатализатора удается получать чистое и прозрачное игристое вино, в котором отсутствуют свободные клетки дрожжей.

Недостатками данного способа получения биокатализатора является то, что при покрытии готовых частиц кальций-альгинатного геля, содержащего дрожжевые клетки, дополнительным слоем альгината кальция в значительной степени затрудняется приток питательных веществ к иммобилизованным клеткам и отвод от них углекислого газа, что отрицательно сказывается на качестве (в первую очередь на органолептических характеристиках) готового продукта. Кроме того, общим недостатком всех систем, использующих гель альгината кальция в качестве носителя иммобилизованных дрожжей для ферментации виноматериала, является постепенное растворение носителя вследствие экстракции ионов кальция из матрицы геля органическими кислотами, присутствующими в среде. В результате этого начинается постепенное помутнение игристого вина теперь уже не только выходящими из геля клетками, но и взвесью солей кальция с этими органическими кислотами, поэтому, если требуется длительная выдержка, то с помощью этого известного биокатализатора не удается получать высококачественные спиртосодержащие игристые напитки - конечный продукт мутный из-за присутствия осадка вышеуказанных солей кальция.

Последнего недостатка нет в случае использования в качестве носителей иммобилизованных клеток так называемых криогелей поливинилового спирта (ПВС) [Lozinsky V.I., Plieva F.M. Poly(vinyl alcohol) cryogels employed as matrices for cell immobilization. 3. Overview of recent research and developments. Enzyme Microb. Technol., 23 (3/4) 227-242 (1998)]. Для получения биокатализаторов, представляющих собой клетки микроорганизмов, включенные в матрицу данного гелевого носителя, биомасса смешивается с водным раствором ПВС, содержащим, если требуется, необходимые растворимые вещества, и подвергается операциям замораживания-оттаивания, что приводит к получению целевого продукта - биокатализатора.

Известен способ [пат. Японии №62-146589 (1987)] получения биокатализатора, используемого для приготовления такого спиртосодержащего игристого напитка, как пиво. Согласно этому способу 150 г ПВС растворяют при автоклавировании в 850 мл солодового сусла, полученный раствор охлаждают до комнатной температуры, смешивают со 100 г биомассы пивных дрожжей, а затем трижды замораживают при -20°С и оттаивают при комнатной температуре. В результате получают биокатализатор, который далее обрабатывают солодовым суслом (300 мл солодового сусла на 200 г биокатализатора) при 15°С в течение 4 дней с ежедневной сменой среды. Таким образом, способ получения данного биокатализатора включает не только формирование криогеля ПВС с включенными в его матрицу дрожжевыми клетками, но и дополнительную обработку для того, чтобы, как указано в описании способа, достичь стационарной фазы иммобилизованной биомассы. Лишь после такой обработки биокатализатор используют для ферментации пива, и при этом в нем достигается концентрация этанола 4,8%.

Данное техническое решение, как наиболее близкое к заявляемому по природе используемого носителя иммобилизованных клеток и наличию стадии дополнительной обработки сформированного биокатализатора, принято за прототип.

Несмотря на высокие эксплуатационные характеристики такого биокатализатора, обусловленные стабильностью геля-носителя в ферментационных средах (отсутствие вымывания каких-либо компонентов гелевой матрицы или ее нежелательное размягчение), способ-прототип имеет ряд недостатков:

1. Для формирования криогеля ПВС используется трехкратная криогенная обработка (операции замораживания-оттаивания), что малотехнологично и приводит к большому расходу энергии; кроме того, многократное замораживание-оттаивание живых дрожжевых клеток резко снижает их жизнеспособность и бродильную активность, для восстановления которых приходится применять длительную и многократную обработку биокатализатора дорогим солодовым суслом.

2. Способ-прототип может быть использован для получения биокатализаторов, предназначенных для решения лишь очень ограниченного круга задач, в частности только для непродолжительных бродильных процессов, например на стадии головного брожения пива. Если же требуется более длительное использование биокатализатора, то, как показали специально проведенные испытания с шампанскими дрожжами, включенными в криогель ПВС по методике способа-протипа, уже к концу 1-ой недели процесса наблюдалось помутнение виноматериала, а его химический состав и органолептические показатели свидельствовали о низкой бродильной активности такого биокатализатора (см. пример сравнения в табл.4). Иными словами, способ-прототип не обладает универсальностью в отношении различных типов микроорганизмов, способных осуществлять спиртовое брожение, и не позволяет получать биокатализаторы для производства разнообразных спиртосодержащих игристых напитков высокого качества.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа получения эффективного биокатализатора для производства спиртосодержащих игристых напитков высокого качества.

Поставленная задача решается тем, что проводят наращивание биомассы дрожжей, а иммобилизация клеток осуществляется путем включения биомассы дрожжей в частицы гелевого носителя, выбранного из группы: альгинатный гель, агаровый гель, каррагинановый гель, криогель поливинилового спирта, с последующей обработкой биокатализатора 0,0001-0,001%-ным раствором ауторегуляторного фактора d-1 в течение 1-3 ч при 10-40°С.

После указанной выше обработки готовые биокатализаторы можно использовать по назначению, т.е. для приготовления спиртосодержащих игристых напитков.

Оказалось, что такое ранее неизвестное сочетание технологических операций, т.е. сначала включение биомассы дрожжей в полимерный гель, а затем обработка ауторегуляторным фактором d-1 [Осипов Г.А.; Эль-Регистан Г.И.; Светличный В.А.; Козлова А.Н.; Дуда В.И.; Карпелянц А.С.; Помазанов // Микробиология. Т.54. №2, С.184-190 (1985); Батраков С.Г., Эль-Регистан Г.И., Придачина Н.Н., Ненашева В.А., Козлов А.Н., Грязнова М.И., Золотарев Т.И. // Микробиология. Т.62. №4. С.633-638 (1993)], приводит к получению иммобилизованного биокатализатора, эффективного при приготовлении спиртосодержащих игристых напитков. Такой биокатализатор обладает не только необходимой бродильной активностью, но при этом обеспечивается надежное удерживание клеток в пределах частиц носителя, в результате чего не наблюдается нежелательное помутнение (микробиологическое загрязнение) конечного продукта.

Конкретные варианты реализации заявляемого способа иллюстрируются примерами.

Пример 1. Типичная методика получения иммобилизованного биокатализатора включением биомассы дрожжей в альгинатный гель.

Пивные дрожжи Saccharomyces cerevisiae (carlsbergensis) расы 11 выращивают на круговой качалке в конических колбах на 750 мл с 250 мл солодового сусла с содержанием сухих веществ (СВ) 11% в течение 24 часов. Полученную биомассу отделяют центрифугированием в течение 10 минут при 3000 об/мин, промывают 0,9%-ным раствором NaCl и используют для иммобилизации включением в гель альгината кальция. Иммобилизацию проводят известным методом [Европейский пат. №0173915 (1985)], а именно смешивают биомассу дрожжей с предварительно проавтоклавированным 3,3%-ным раствором альгината натрия, далее полученную смесь по каплям вводят в 2%-ный раствор хлористого кальция. В результате получают гранулы биокатализатора диаметром около 3 мм, которые инкубируют в 2%-ном растворе CaCl₂ в течение 1 ч. После выдержки биокатализатор промывают проточной водой и помещают в 0,001%-ный раствор ауторегуляторного фактора d-1, выделенного из Saccharomyces cerevisiae, и выдерживают в течение 3 часов при 10°С, после чего используют для производства пива. При этом в результате ферментации солодового сусла с концентрацией СВ 12% с участием подобного биокатализатора удается получать чистое и прозрачное пиво с содержанием спирта не менее 4,5 об.%, в котором отсутствуют свободные клетки дрожжей (таблица 1).

Пример 2. Типичная методика получения иммобилизованного биокатализатора включением биомассы дрожжей в агаровый гель.

Сидровые дрожжи Saccharomyces cerevisiae расы Сидровая 101 выращивают на круговой качалке в конических колбах на 750 мл с 250 мл яблочного сока с содержанием сахара 7% в течение 24 часов. Полученную биомассу отделяют центрифугированием в течение 10 минут при 3000 об/мин, промывают 0,9%-ным раствором NaCl и используют для иммобилизации включением в гель агара. Раствор агара готовят путем растворения 1 г агара в 45 мл 0,9%-ного раствора NaCl с последующим его нагреванием до 100°С и охлаждением до 40°С. Иммобилизацию проводят известным методом [Синицын А.П., Райнина Е.И., Лозинский В.И., Спасов С.Д. // Иммобилизованные клетки микроорганизмов. 2-е изд., Москва, МГУ, 1994, с.150], а именно путем смешивания 5 мл суспензии клеток с 45 мл раствора агара при 40°С и быстрого введения по каплям в охлажденное до 5°С растительное масло. После выдержки образовавшихся гранул биокатализатор промывают проточной водой и затем помещают в 0,0001%-ный раствор ауторегуляторного фактора d-1, выделенного из Pseudomonas carboxydofllava, где выдерживают при 40°С в течение 1 ч, после чего полученный биокатализатор используют для производства сидра. При этом в результате бутылочной ферментацпи смеси сидрового материала с ликером (с общим содержанием сахара в смеси 3%) с участием подобного биокатализатора удается получать чистый и прозрачный сидровый напиток с содержанием спирта не менее 7,0 об.%, в котором отсутствуют свободные клетки дрожжей (таблица 2).

Пример 3. Типичная методика получения иммобилизованного биокатализатора включением дрожжевой биомассы в каррагинановый гель.

Шампанские дрожжи Saccharomyces cerevisiae (bayanus) расы Артемовская-7 выращивают на круговой качалке в конических колбах на 750 мл с 250 мл бродильной смеси с содержанием сахара 5% в течение 24 часов. Полученную биомассу отделяют центрифугированием в течение 10 минут при 3000 об/мин, промывают сухим виноматериалом и используют для иммобилизации включением в каррагинановый гель. Иммобилизацию проводят известным методом [“Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы.” Под ред. Дж.Вудворда, М.: Мир, 1988. С.60], для чего готовят раствор гелеобразователя смешиванием 4 г каррагинана и 96 мл физиологического раствора, с последующим нагреванием суспензии при 60°С до полного растворения полисахарида и далее охлаждением до 40°С, смешиванием с биомассой дрожжей (30 мг сухого веса на 100 мл суспензии) и прибавлением полученной суспензии по каплям в 3%-ный раствор КС1, охлажденный до 7°С. После выдержки в течение 50 минут в растворе КС1 биокатализатор промывают проточной водой и затем помещают в 0,007%-ный раствор ауторегуляторного фактора d-1 (химические аналоги C₁-АОБ или С₆-АОБ) и выдерживают в течение 2-х часов при 28°С, после чего полученный биокатализатор используют для сбраживания тиражной смеси с содержанием сахара 20-24 г/л, предварительно прошедшей холодную стерилизацию (например, обеспложивающую фильтрацию). Брожение ведут при температуре 10-14°С. Время операции ремюажа - 2 мин. При этом получают прозрачное шампанское, по основным физико-химическим и органолептическим показателям близкое к шампанскому, приготовленному традиционным способом с продолжительностью ремюажа 3 месяца (таблица 3).

Пример 4. Типичная методика получения иммобилизованного биокатализатора включением в криогель поливинилового спирта.

Шампанские дрожжи Saccharomyces cerevisiae расы Харьковская-39 выращивают на круговой качалке в конических колбах на 750 мл с 250 мл бродильной смеси с содержанием сахара 5% в течение 72 часов. Полученную биомассу отделяют центрифугированием в течение 10 минут при 3000 об/мин, промывают виноматериалом и используют для иммобилизации включением в криогель ПВС. Иммобилизацию дрожжей в гранулы криогеля ПВС проводят известным методом [Lozinsky V.I., Plieva F.M., Poly(vinyl alco-hol) cryogels employed as matrices for cell immobilization. 3. Overview of recent research and developments. Enzyme Microb. Technol. V.23, No 3/4, 227-242 (1998)], а именно 10 г сгущенной цетрифугированием биомассы суспендируют в 90 г 11%-ного водного раствора ПВС и формируют при -20°С замороженные сферические гранулы диаметром 2 мм с помощью известного криогранулятора [пат. РФ №2036095 (1992)]. После выдерживания в замороженном состоянии в течение 12 ч и последующего оттаивания гранулы промывают стерильным физиологическим раствором. Затем гранулы биокатализатора обрабатывают 0,0005%-ным раствором фактора d-1 (либо выделенного из Saccharomyces cerevisiae, либо химического аналога С₆-АОБ), приготовленного на виноматериале (концентрация спирта 9,5-11,0 об.%), в течение 2 ч при 20°С и далее используют для сбраживания тиражной смеси с содержанием сахара 20-24 г/л, предварительно прошедшей холодную стерилизацию (например, обеспложивающую фильтрацию). Брожение ведут при температуре 10-14°С. Длительность операции ремюажа - 1 мин. При этом получают прозрачное шампанское, близкое по основным физико-химическим и органолептическим показателям от шампанского, приготовленного обычным способом (таблица 4), но при длительности стадии ремюажа 3 мес.

Данные, представленные в таблицах 1-4, показывают, что при использовании дрожжей, иммобилизованных в соответствующий гелевый носитель и обработанных фактором d-1 в заявляемых режимах, процесс брожения при получении спиртосодержащих игристых напитков (в частности, пива, сидра, шампанского) проходит практически так же, как и при использовании свободных клеток дрожжей. Однако при этом наблюдается резкое уменьшение количества клеток дрожжей в получаемом игристом напитке при использовании иммобилизованных дрожжей вплоть до их полного исчезновения.

Использование предлагаемых биокатализаторов дает возможность сократить продолжительность ремюажа с 3 месяцев до 1-2 минут, в результате чего резко уменьшаются затраты ручного труда, В частности, экономятся производственные площади на производство шампанского бутылочным способом, что существенно снижает себестоимость процесса в целом.

Изобретение относится к пищевой биотехнологии. Проводят наращивание биомассы дрожжей. Иммобилизацию клеток осуществляют путем включения биомассы дрожжей в частицы гелевого носителя, выбранного из группы: альгинатный гель, агаровый гель, каррагинановый гель, криогель поливинилового спирта, с последующей обработкой биокатализатора 0,0001-0,001%-ным раствором ауторегуляторного фактора d-1 в течение 1-3 ч при 10-40°С. Способ обеспечивает получение эффективного биокатализатора для производства спиртосодержащих игристых напитков высокого качества. 4 табл.

Способ получения биокатализатора для производства спиртосодержащих игристых напитков, включающий наращивание биомассы дрожжей, ее иммобилизацию включением в гелевый носитель и дальнейшую обработку полученного биокатализатора для предупреждения выхода клеток из матрицы носителя, отличающийся тем, что иммобилизацию клеток дрожжей осуществляют путем включения биомассы дрожжей в частицы гелевого носителя, выбранного из группы: альгинатный гель, агаровый гель, каррагинановый гель, криогель поливинилового спирта, с последующей обработкой биокатализатора 0,0001-0,001% раствором ауторегуляторного фактора d-1 в течение 1-3 ч при 10-40°С.