СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО БИОКАТАЛИЗАТОРА И БИОКАТАЛИЗАТОР ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА СПИРТОСОДЕРЖАЩИХ НАПИТКОВ Российский патент 2008 года по МПК C12N11/04 C12G1/73 

Изобретение относится к пищевой биотехнологии, конкретно к иммобилизованным биокатализаторам на основе клеток дрожжей, включенных в матрицу гелевого носителя, с помощью которых осуществляют сбраживание различных сред для получения спиртосодержащих напитков.

Использование клеток дрожжей в иммобилизованном состоянии позволяет использовать многократно одни и те же клетки микроорганизмов и, таким образом, избежать необходимости решения проблемы постоянной утилизации накапливающейся биомассы. К тому же, применение клеток дрожжей в иммобилизованном виде позволяет повысить их устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов (высокие концентрации накапливающегося спирта, сильное закисление среды и др.), обеспечить более длительное и эффективное проведение процесса с их участием, упростить удаление дрожжевого осадка и улучшить показатели готовой продукции Willaert R. Fundamentals of cell immobillisation biotechnology. // Kluwer Academic Publishers, 2004, 555 p.; C.Sand, Economical comparative analysis of different bottle fermentation methods. // Proc of Intern conf on Agricultural Economics Rural Development and Informatics New Millenium, Hungary, 1-2 April, 2003].

Главными характеристиками любого способа получения биокатализатора на основе иммобилизованных живых клеток являются длительность и условия подготовки биомассы к иммобилизации и получения самого биокатализатора.

Основными характеристиками любого иммобилизованного биокатализатора для приготовления спиртосодержащих напитков являются его бродильная активность и период полуинактивации в процессе его эксплуатации и хранения. Бродильную активность иммобилизованных клеток оценивают по максимальной концентрации спирта (г/л), которая накапливается в сбраживаемой среде при оптимальной концентрации гранул биокатализатора, при производстве вин и пива, и по максимальному давлению углекислого газа (МПа) - при производстве игристых напитков.

Периодом полуинактивации считается отрезок времени, в течение которого иммобилизованный биокатализатор теряет половину своей исходной метаболической активности при его многократном использовании или длительном хранении.

Эти основные характеристики способов получения биокатализаторов и самих биокатализаторов используются для их сравнительного анализа.

Среди известных способов иммобилизации дрожжей, разработанных с целью получения биокатализаторов для производства спиртосодержащих напитков, наибольшее распространение получили методы включения дрожжей в матрицы гелевых носителей. При этом в качестве носителей чаще всего используются гели природных полимеров: К-каррагинана и Са-альгината.

Согласно способу получения биокатализатора на основе К-каррагинанового геля [патент US № 6,217,916 (2001) Immobilized-cell carrageenan bead production and a brewing process utilizing carrageenan bead immobilized yeast cells; кл. С 12 С 011/07], биомассу дрожжей смешивают с 3% раствором К-каррагинана в 1,5 г/л растворе KCl, полученную смесь нагревают до 40°С при постоянном перемешивание и по каплям вносят в стерильное растительное масло. Далее систему быстро охлаждают до 5°С и добавляют равный объем стерильного раствора KCl (22 г/л), необходимого для затвердевания гранул биокатализатора. Полученную смесь оставляют расслаиваться, а затем верхнюю органическую фазу удаляют и проводят промывку гранул биокатализатора несколько раз тем же раствором KCl до полного отсутствия масла на поверхности гранул. Общее время получения биокатализатора не определено.

Иммобилизованный биокатализатор, полученный согласно этому способу, предназначен для получения пива. При проведении сбраживания пивного сусла в течение 22 ч с использованием этого биокатализатора накапливается максимальная концентрация спирта - 50,9 г/л.

Несмотря на простоту данного способа получения иммобилизованного биокатализатора к его недостаткам следует отнести необходимость применения повышенной температуры (40°С) и последующего резкого охлаждения системы, отрицательно сказывающихся на жизнеспособности дрожжевых клеток. К недостаткам самого биокатализатора согласно данным авторов разработки следует отнести низкую механическую прочность К-каррагинанового геля и постепенное его растворение в отсутствие избытка ионов калия в среде, сопровождающееся существенным увеличением числа выходящих из носителя клеток. Появление свободных клеток в среде и остатков постепенно разрушающегося носителя создают проблему, связанную с необходимостью их удаления из продукта брожения.

Известен способ получения иммобилизованного биокатализатора на основе Са-альгинатного геля [патент UA № 14902 (1997) Спосiб виробництва iгристого вина пляшкоим методом; кл. C12G 1/06], согласно которому дрожжи Saccharomyces cerevisiae раса Шампанская-83 или S.bayanus раса Севастопольская-23 культивируют в аэробных условиях при 16°С в течение 72 ч на шампанском виноматериале с добавлением тиражного ликера, содержащем суммарно 22 г/л сахарозы. Затем биомассу концентрируют и смешивают с 5%-ным водным раствором альгината натрия в пропорции 1:9. Полученную смесь вносят по каплям в 2%-ный раствор CaCl₂, при этом соотношение объема вводимой смеси и осадителя составляет 1:3. Гранулы выдерживают в осадителе как минимум 2 ч, после чего их промывают дистиллированной водой. Общее время получения иммобилизованного биокатализатора составляет 80 ч.

Иммобилизованный биокатализатор, полученный по этому способу, предназначен для получения игристых вин. При проведении сбраживания шампанского виноматериала с добавлением тиражного ликера в течение 40 сут с использованием этого биокатализатора в бутылках накапливается максимальное давление углекислого газа - 0,48 МПа (концентрация спирта неизвестна).

Среди ряда очевидных недостатков этого способа получения иммобилизованного биокатализатора следует выделить:

- выбор условий подготовки клеток к иммобилизации, а именно используется питательная среда (шампанский виноматериал), содержащая этиловый спирт, сильно ингибирующий рост дрожжей и, как следствие этого, в способе предусматривается большая продолжительность процесса культивирования клеток с целью накопления необходимой биомассы;

- присутствие фосфат-ионов в сбраживаемом с помощью иммобилизованного биокатализатора виноматериале приводит к выходу ионов Са²⁺ из структуры Са-альгината и образованию нерастворимых осадков фосфатов кальция в среде. Как следствие этого, происходит разрушение матрицы носителя, выход клеток из гранул биокатализатора и помутнение конечного продукта. Необходимость удаления свободных клеток и появляющихся осадков значительно ухудшает технологичность процесса в целом и ведет к его удорожанию.

Для предотвращения выхода клеток из матрицы носителя и помутнений продуктов брожения иммобилизованные биокатализаторы на основе Са-альгинатных гелей покрывают дополнительным слоем того же геля, не содержащим клеток. Так известен способ [US Patent 6,033,887 (2000) Degidrated polysaccharide gel containing microorganisms, a sugar and a polyol for producting fermented drinks; кл C12N 11/10; C12N 1/04; C12G 1/00; С12С 11/00], согласно которому получают иммобилизованный биокатализатор с двойным слоем Са-альгинатного геля. Биомассу дрожжей, полученную при культивировании в течение 96 ч на виноматериале с 50 г/л сахара при 16°С, смешивают с 1,5%-ным раствором альгината натрия, полученную смесь по каплям вводят в раствор 0,2 М CaCl₂ (рН 7). После 45 мин экспозиции гранул в растворе CaCl₂ их промывают дистиллированной водой и вновь помещают в 11,5%-ный раствор альгината натрия, с последующим переносом в водный раствор CaCl₂ (200 г/л). Полученные гранулы выдерживают 15 мин в растворе хлорида кальция, затем промывают водой и помещают на хранение в водный раствор винной кислоты с концентрацией 0,5 г/л при 4°С. Общее время получения биокатализатора составляет 110 ч.

Иммобилизованный биокатализатор, полученный по этому способу, предназначен для получения игристых вин. При проведении сбраживания шампанского виноматериала с добавлением тиражного ликера в течение 42 сут с использованием этого биокатализатора в бутылках накапливается максимальная концентрация спирта - 21 г/л.

Такой способ получения иммобилизованного биокатализатора характеризуется высокими расходами полимера и еще большей длительностью всего процесса получения биокатализатора в целом, чем в предыдущем способе.

Основным недостатком самого биокатализатора, получаемого по этому способу, является то, что второй Са-альгинатный слой, не содержащий клеток, в значительной степени приводит к ухудшению массообменных процессов внутри гранул с иммобилизованными клетками, осложняется доступ субстрата и выход метаболитов, что отрицательно сказывается на жизнеспособности самих клеток, а также на органолептических характеристиках готового продукта.

Следует отметить, что помимо вышеуказанных общим недостатком всех иммобилизованных биокатализаторов на основе гелей природных полимеров является подверженность самой матрицы носителя биодеградации под действием различных микроорганизмов, что требует обязательного использования и хранения таких биокатализаторов в строго стерильных условиях. В связи с этим для иммобилизации дрожжей более привлекательным является использование синтетических носителей, инертных по отношению к продуктам метаболизма дрожжей, к воздействию гидролитических ферментов различных микроорганизмов и характеризующихся более высокой механической прочностью.

Способ получения иммобилизованного биокатализатора на основе полиакриламидного геля (ПААГ) [Patent FRA № 75 24509 (1977) Precede enzymatique utilisant des microorganismes inclus; кл. С12C 11/14, C12D 1/00, 3/00] предполагает суспендирование при 15°С дрожжевой биомассы, полученной в результате культивирования в течение 48 ч на солодовом сусле, содержащей 50 г/л глюкозы, в 50 мМ фосфатном буфере, в 100 мл которого содержится 8,2 г мономеров (акриламида и N, N-метилен-бис-акриламида). В качестве катализатора сополимеризации используют 200 мг персульфата аммония и 40 мкл N, N-N', N'-тетраметилендиамина. Полимеризация проходит также при 15°С в течение 2-5 минут. Далее полученный гелевый блок, содержащий иммобилизованные клетки, отмывают дистиллированной водой от остатков полимеризационной среды и разрезают на гранулы произвольной формы и размером 2-4 мм. Общее время получения биокатализатора составляет 55 ч.

Иммобилизованный биокатализатор, полученный по этому способу, предназначен для получения вина. При проведении сбраживания виноградного сока в течение 50 ч с использованием этого биокатализатора в вине накапливается максимальная концентрация спирта - 35,7 г/л.

Главным недостатком способа получения этого иммобилизованного биокатализатора является токсичность для живых клеток условий формирования полимерной матрицы носителя, так как при инициации сополимеризации одновременно протекает большое число химических реакций как между ингредиентами полимеризационной смеси, так и между компонентами смеси и поверхностью клеток микроорганизмов. В результате модификации подвергается и сама клетка, и свойства гелевой матрицы. Число жизнеспособных клеток в результате такой иммобилизации резко снижается. Гетерогенная пористость матрицы, которая при этом образуется, обеспечивает неравномерное снабжение иммобилизованных клеток субстратом и отвод метаболитов, особенно большие диффузионные проблемы возникают во внутренних областях гелевой матрицы, вследствие чего происходит быстрое отмирание иммобилизованных клеток, локализованных в центральной части гранул биокатализатора.

Поливиниловый спирт (ПВС), являясь синтетическим полимером тоннажного производства, относится к числу наиболее привлекательных полимеров для получения иммобилизованных клеток микроорганизмов, что обусловлено сочетанием таких его качеств как нетоксичность, высокая химическая и микробиологическая стабильность, высокая пористость, обеспечивающая благоприятные условия для массообменных процессов [В.И.Лозинский. Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения. // Успехи химии, 71, (6) 559-585 (2002); Lozinsky V.I., Plieva F.M. Poly(vinyl alcohol) cryogels employed as matrices for cell immobilization. 3. Overview of recent research and developments. Enzyme Microb. Technol. 23 (3-4), 227-242 (1998)]. Формирование гелевого носителя происходит при замораживании и последующем оттаивании раствора полимерного гелеобразователя. Отсутствие в среде формирования носителя каких-либо реагентов, токсичных для клеток, позитивно отличает криогель ПВС от полиакриламидного геля.

Известен способ получения иммобилизованного биокатализатора для производства спиртосодержащих игристых напитков [патент РФ № 2239658 (2004) Способ получения биокатализатора для производства спиртосодержащих игристых напитков; кл. C12N 11/04; C12G 1/073], согласно которому биомассу дрожжей Saccharomyces cerevisiae расы Харьковская-39 наращивают в течение 72 ч на бродильной смеси, содержащей 50 г/л сахара. Полученную биомассу отделяют центрифугированием, промывают виноматериалом, суспендируют (10 г) в 11%-ном водном растворе ПВС (90 г) и формируют при -20°С замороженные сферические гранулы диаметром 2 мм с помощью криогранулятора [патент РФ № 2036095 (1992). Устройство для формирования сферических гранул из материала на основе водных систем]. Гранулы после формирования в криогрануляционной установке в среде охлаждающей гидрофобной жидкости (гексана, петролейного эфира, уйтспирита и др.) и выдержки в замороженном состоянии в течение 12 ч размораживают, промывают стерильным физиологическим раствором и далее выдерживают в течение 2 ч при 20°С в виноматериале, содержащем 9,5-11,0 об.% спирта и 0,005 г/л специально введенного ауторегуляторного фактора d-1 (2-(4-гидроксифенил)-этанола), подавляющего рост и, таким образом, предотвращающего выход клеток из гранул биокатализатора. Общее время получения биокатализатора составляет 120 ч.

Иммобилизованный биокатализатор, полученный по этому способу, предназначен для получения шампанского. При проведении сбраживания шампанского виноматериала в течение 30 сут с использованием этого биокатализатора в бутылках накапливается максимальное давление углекислого газа 0,47 МПа, а концентрация спирта составляет 87,4 г/л.

Однако, несмотря на стабильность криогеля ПВС в средах для брожения и уменьшение количества свободных клеток, присутствующих в готовом шампанском, данный способ имеет ряд существенных недостатков:

- большая длительность процесса получения биокатализатора, обусловленная, в основном, длительным ростом самой биомассы, необходимой для иммобилизации (72 ч). Использование для наращивания биомассы дрожжей виноматериала, содержащего до 10 об.% этилового спирта, как известно, существенно ингибирующего рост клеток, приводит, с одной стороны, к очень медленному и потому продолжительному по времени накоплению необходимого количества биомассы, а с другой стороны, клетки, выращенные в таких неблагоприятных условиях, быстро теряют свою жизнеспособность в процессе их иммобилизации;

- для реактивации клеток и восстановления их жизнеспособности перед иммобилизацией, согласно способу, дрожжи необходимо обрабатывать свежим виноматериалом, что ведет к расходу самого виноматериала и увеличению общего времени получения биокатализатора;

- использование для формирования гранул криогрануляционной установки, заполненной гидрофобной жидкостью с низкой температурой, в которую через раскапывающее устройство вносят суспензию клеток в растворе ПВС, приводит к необходимости последующего тщательного удаления с поверхности гранул гидрофобной пленки, образующейся за счет остаточных количеств гидрофобной жидкости, перекрывающей доступ к иммобилизованным клеткам, находящихся внутри гранул, всех гидрофильных (водных) растворов, в том числе и среды для брожения. Для удаления гидрофобной пленки с поверхности гранул в процессе получения биокатализатора по этому способу специально предусмотрена стадия отмывки гранул физиологическим раствором после их размораживания. Сама стадия увеличивает продолжительность процесса в целом, а в результате образуются сточные воды, содержащие гидрофобную жидкость и подлежащие дополнительной дорогостоящей очистке, что ведет к удорожанию процесса получения биокатализатора в целом. Необходимость использования самой гидрофобной жидкости (гексана, петролейного эфира, уйтспирита и др.), обладающих пожароопасностью и токсичностью для людей, обслуживающих процесс, является серьезным недостатком способа получения биокатализатора с помощью криогрануляционной установки. Такие жидкости требуют особых условий пожарной техники безопасности и вентиляции помещений при работе с ними и их хранении;

- для предотвращения выхода иммобилизованных клеток из матрицы носителя их выдерживают 2 ч при 20°С в виноматериале, специально вводя в него d1-фактор (2-(4-гидроксифенил)-этанол). Присутствие последнего в гранулах биокатализатора сохраняется при последующем их использовании в процессах брожения, плюс к тому, d1-фактор диффундирует из объема гранул в среду и остается в готовом продукте, что само по себе негативно сказывается на его органолептических характеристиках;

- сама обработка биокатализатора d1-фактором приводит к дополнительным расходам виноматериала и увеличению времени получения готового биокатализатора. Кроме того, дополнительная обработка d1-фактором в указанной концентрации (0,005 г/л) не полностью устраняет проблему выхода клеток из матрицы носителя (свободные клетки присутствуют в готовом продукте в концентрации 5×10⁴ кл/мл), а более высокие концентрации d1-фактора приводят к гибели иммобилизованных дрожжевых клеток;

- иммобилизованный биокатализатор, полученный согласно этому способу, может быть использован только для получения игристых напитков.

Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по типу используемого носителя (ПВС) и предназначению получаемого биокатализатора принято за прототип.

Задачей предлагаемого изобретения является создание более эффективного и менее продолжительного способа получения иммобилизованного биокатализатора, а также самого биокатализатора с новыми свойствами, предназначенного для получения более широкого спектра спиртосодержащих напитков.

Поставленная задача решается тем, что биомассу дрожжей, выращенную строго до конца логарифмической фазы роста в течение 12-18 ч на среде, не содержащей этиловый спирт, смешивают с раствором поливинилового спирта, замораживают в среде воздуха при -15÷-80°С, выдерживают при той же температуре в течение 12-16 ч и размораживают при +2÷+10°С так, что готовый биокатализатор имеет следующий состав (в мас.%): биомасса дрожжей 0,15÷0,9 (по сух. массе); повиниловый спирт 10÷15; водная фаза - до 100.

Использование питательных сред, не содержащих этанол, позволяет избежать его ингибирующего воздействия на рост клеток дрожжей и существенно сократить время накопления максимального количества биомассы клеток для иммобилизации и, следовательно, значительно сократить длительность всего процесса получения биокатализатора.

Культивирование клеток строго до конца логарифмической фазы роста обеспечивает, с одной стороны, накопление к этому моменту времени в среде необходимого для иммобилизации количества биомассы, а с другой стороны, получение максимально продуктивных клеток.

После выращивания проводят концентрирование (сгущение) биомассы для ее подготовки к включению в матрицу полимерного носителя. Такое концентрирование проводят известными приемами, например центрифугированием.

Иммобилизация биомассы осуществляется путем ее суспендирования в растворе ПВС с последующей криогенной обработкой (замораживанием, выдерживанием в замороженном состоянии и оттаиванием) в атмосфере воздуха, а не гидрофобной жидкости, при определенных условиях, что приводит к формированию прочного полимерного криогеля, содержащего включенную в него матрицу клеток дрожжей. В ходе криогенной обработки получаемому биокатализатору может быть придана любая необходимая форма, в частности форма сферических гранул, частиц неправильной формы, гелевых блоков, дисков, листов, трубок и др. Для этого суспензия биомассы в растворе гелеобразователя замораживается в соответствующей форме.

Существенным отличием заявляемого изобретения является новое сочетание технологических операций, которое ранее известно не было, а именно: получение для иммобилизации биомассы в строго определенных условиях, обеспечивающих высокую целевую метаболическую активность клеток, а также проведение иммобилизации включением клеток в полимерный криогель в сторогом их соотношении и реализация этого процесса на воздухе при соблюдении определенных условиях формирования криогеля с макропористой структурой, которые обеспечивают надежное удерживание клеток матрицей носителя и позволяют варьировать форму получаемого биокатализатора, предназначенного для производства спиртосодержащих напитков. Изменение заявляемых условий получения биокатализатора (подготовки клеток к иммобилизации, температуры замораживания и размораживания системы "клетки:полимер", время ее выдерживания в замороженном состоянии, а также соотношение между ее компонентами) ведет к ухудшению прочностных характеристик биокатализатора и метаболической активности иммобилизованных клеток.

Вторым объектом изобретения является иммобилизованный биокатализатор, полученный согласно заявляемому способу, для производства различных спиртосодержащих напитков (шампанского, белого и красного вина, пива и др.).

Существенным техническим результатом заявляемого изобретения является способность биокатализатора сбраживать широкий спектр сред, в том числе недоброды, и осуществлять биологическое кислотопонижение сусел, обеспечивая при этом получение принципиально разных спиртосодержащих напитков.

Заявляемый способ получения биокатализатора обеспечивает максимальное сохранение жизнеспособности иммобилизованных клеток, что позволяет биокатализатору характеризоваться высокой бродильной активностью, а именно продуцировать до 135 г/л этанола и накапливать давление углекислого газа до 0,56 МПа, а также при этом иметь период полуинактивации при хранении в замороженном состоянии 24 месяца, а при многократной эсплуатации - 150 суток.

Получаемый биокатализатор имеет макропористую структуру, обеспечивающую благоприятные условия для массообменных процессов, и может быть многократно применен для получения спиртосодержащих напитков.

Ниже приводятся конкретные примеры реализации заявляемого технического решения.

Пример 1. Получение иммобилизованного биокатализатора и биокатализатор на основе клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса Шампанская-39, включенных в криогель ПВС, для получения игристых вин классическим методом.

Дрожжи S.cerevisiae раса Шампанская-39 культивируют строго до конца логарифмической фазы роста в течение 18 ч при 22°С на среде, не содержащей этиловый спирт, следующего состава (г/л): глюкоза - 2,5; дрожжевой экстракт - 2,0; хлорид натрия - 1,0; сульфат аммония - 2,0; сульфат магния - 1,0; дигидрофосфат калия - 13,5; рН 5,6.

20 г биомассы дрожжей, полученной после отделения от культуральной жидкости центрифугированием (10 мин, 10000 об/мин), смешивают с 980 г 15%-ного раствора ПВС, приготовленного на основе дистиллированной воды, до получения однородной массы. Полученную смесь раскапывают в иммунологические 96-луночные планшеты по 0,2 мл, замораживают при -25°С, выдерживают в замороженном состоянии 16 ч, а затем оттаивают при +2°С и, таким образом, получают биокатализатор с цилиндрической формой гранул, имеющий следующий состав (в мас.%): биомасса дрожжей 0,17 (по сух. массе); полимер 15; водная фаза - до 100. Общее время получения иммобилизованного биокатализатора составляет 40 ч.

Полученный иммобилизованный биокатализатор предназначен для получения игристых вин. При проведении сбраживания в течение 28 сут шампанского виноматериала с добавлением тиражного ликера, содержащего суммарно 25 г/л сахара и 98 г/л спирта, с использованием этого биокатализатора в бутылках накапливается дополнительно 23 г/л спирта (таким образом, общая концентрация спирта составляет в конце брожения - 121 г/л), а давление углекислого газа составляет 0,56 МПа. При микроскопировании образцов шампанского, полученного после брожения, концентрация свободных клеток составляет 50 кл/мл.

Период полуинактивации такого биокатализатора при его хранении в замороженном состоянии составляет 18 месяцев.

Пример 2. Получение иммобилизованного биокатализатора и биокатализатор на основе клеток дрожжей Saccharomyces vini, включенных в криогель ПВС, для получении белых вин.

Дрожжи Saccharomyces vini 47-K культивируют строго до конца логарифмической фазы роста в течение 17 ч при 26°С на среде, не содержащей этанола, а именно на пивном сусле с концентрацией сухих веществ 10%.

100 г биомассы дрожжей, полученной после центрифугирования (10 мин, 10000 об/мин), смешивают с 900 г 11%-ного раствора ПВС, приготовленного на основе физиологического раствора, до получения однородной массы. Полученную смесь выливают ровным слоем на противень с бортами высотой 3 см для получения гелевых блоков высотой 0,5 см, замораживают при -15°С, выдерживают в замороженном состоянии 15 ч, оттаивают при +10°С и, таким образом, получают биокатализатор, имеющий следующий состав (в мас.%): биомасса дрожжей 0,9 (по сух. массе); полимер 10; водная фаза - до 100. Гель разрезают на гранулы (0,5×0,5 мм) и используют в процессе брожения. Общее время получения иммобилизованного биокатализатора составляет 36 ч.

Полученный иммобилизованный биокатализатор предназначен для приготовления белого вина. При проведении сбраживания виноградного сока с концентрацией сахара 215 г/л, полученного из винограда сорта "Рислинг", в течение 12 сут с использованием этого биокатализатора в емкости для брожения накапливается 100,2 г/л спирта. При микроскопировании образцов полученного вина концентрация свободных клеток составляет 100 кл/мл.

Период полуинактивации такого биокатализатора при его хранении в замороженном состоянии составляет 22 месяца.

Пример 3. Получение иммобилизованного биокатализатора и биокатализатор на основе клеток дрожжей Saccharomyces vini 47-К, включенных в криогель ПВС, для получения красных вин.

Дрожжи Saccharomyces vini 47-K культивируют, как описано в Примере 2. 40 г биомассы дрожжей, полученной после центрифугирования (15 мин, 8000 об/мин), смешивают с 960 г 12,5%-ного раствора ПВС, приготовленного на основе 50 мМ К-фосфатного буфера (рН 6,4), до получения однородной массы. Полученную смесь заливают в прямоугольную металлическую форму с бортами высотой 3 см для получения гелевых блоков высотой 0,3 см, замораживают при -20°С, выдерживают в замороженном состоянии 15 ч, оттаивают при +10°С и, таким образом, получают биокатализатор, имеющий следующий состав (в мас.%): биомасса дрожжей 0,35 (по сух. массе); полимер 12; водная фаза - до 100. Гель разрезают на гранулы (0,3×0,5 мм) и используют в процессе брожения. Общее время получения иммобилизованного биокатализатора составляет 34 ч.

Полученный иммобилизованный биокатализатор предназначен для приготовления красного вина. При проведении сбраживания виноградного сока с концентрацией сахара 270 г/л, полученного из винограда сорта "Каберне Савиньон и Саперави", в течение 18 сут с использованием этого биокатализатора в емкости для брожения накапливается 135 г/л спирта. При микроскопировании образцов полученного вина концентрация свободных клеток составляет 1×10² кл/мл.

Период полуинактивации такого биокатализатора при его хранении в замороженном состоянии составляет 19 месяцев.

Пример 4. Получение иммобилизованного биокатализатора и биокатализатор на основе клеток дрожжей S.cerevisiae phv bayanus, включенных в криогель ПВС, для устранения недобродов с высокой концентрацией спирта

Дрожжи S.cerevisiae phv bayanus культивируют строго до конца логарифмической фазы роста в течение 16 ч при 28°С на среде, не содержащей этанола, а именно на пивном сусле с концентрацией сухих веществ 10%.

17 г биомассы дрожжей, полученной после центрифугирования (15 мин, 8000 об/мин), смешивают с 983 г 15%-ного раствора ПВС, приготовленного на основе 100 мМ Na-фосфатного буфера (рН 6,8), до получения однородной массы. Полученную смесь выливают на противень с высотой бортов 3 см для получения гелевых листов высотой 0,2 см, замораживают при -80°С, выдерживают в замороженном состоянии 10 ч, оттаивают при +8°С и, таким образом, получают биокатализатор, имеющий следующий состав (в мас.%): биомасса дрожжей 0,15 (по сух. массе); полимер 14,75; водная фаза - до 100. Полученный биокатализатор в виде гелевого листа сворачивают в трубку и помещают в емкость для брожения. Общее время получения иммобилизованного биокатализатора составляет 35 ч.

Полученный иммобилизованный биокатализатор предназначен для сбраживания недобродов. При проведении дображивания виноматериала, содержащего 106 г/л спирта, полученного при сбраживании виноградного сока с высоким содержанием сахара свободными клетками, в течение 20 сут с использованием этого биокатализатора в емкости для брожения накапливается дополнительно 5,5 г/л спирта, и его суммарная концентрация составляет 111,5 г/л. При микроскопировании образцов полученного вина концентрация свободных клеток составляет 1×10³ кл/мл.

Период полуинактивации такого биокатализатора при его хранении в замороженном состоянии составляет 20 месяцев.

Пример 5. Получение иммобилизованного биокатализатора и биокатализатор на основе клеток дрожжей S. cerevisiae phv bayanus, включенных в криогель ПВС, для устранения недобродов, полученных после сбраживания на холоду

Получение иммобилизованного биокатализатора проводят, как описано в Примере 4. Общее время получения иммобилизованного биокатализатора составляет 35 ч.

Полученный иммобилизованный биокатализатор предназначен для сбраживания недобродов. При проведении дображивания виноматериала, содержащего 82,8 г/л спирта, полученного при сбраживании виноградного сока свободными клетками на холоду, в течение 20 сут с использованием этого биокатализатора в емкости для брожения накапливается дополнительно 22,8 г/л спирта, и его суммарная концентрация составляет 105,6 г/л. При микроскопировании образцов полученного вина концентрация свободных клеток составляет 0,9×10³ кл/мл.

Период полуинактивации такого биокатализатора при его хранении в замороженном состоянии составляет 21 месяц.

Пример 6. Получение иммобилизованного биокатализатора и биокатализатор на основе клеток дрожжей S.cerevisiae W96, включенных в криогель ПВС, для получения пива.

Дрожжи S.cerevisiae W96 культивируют строго до конца логарифмической фазы роста при 28°С в течение 12 ч на среде, не содержащей этанола, а именно на пивном сусле с концентрацией сухих веществ 11%.

100 г биомассы дрожжей, полученной после центрифугирования (10 мин, 6000 об/мин), смешивают с 900 г 11%-ного раствора ПВС, приготовленного на основе стерильной водопроводной воды до получения однородной массы. Полученную смесь раскапывают в иммунологические 96-луночные планшеты со сферическим дном по 0,1 мл, замораживают при -20°С, выдерживают в замороженном состоянии 12 ч, оттаивают при +4°С и, таким образом, получают биокатализатор, имеющий следующий состав (в мас.%): биомасса дрожжей 0,9 (по сух. массе); полимер 10; водная фаза - до 100. Полученный биокатализатор в виде гелевого листа сворачивают в трубку и помещают в емкость для брожения. Общее время получения иммобилизованного биокатализатора составляет 30 ч.

Полученный иммобилизованный биокатализатор предназначен для приготовления пива. При проведении сбраживания пивного сусла с концентрацией сухих веществ 12% в газлифт-реакторе в течение 22 ч с использованием этого биокатализатора накапливается 55 г/л спирта. При микроскопировании образцов полученного вина свободные клетки отсутствуют.

Период полуинактивации такого биокатализатора при его хранении в замороженном состоянии составляет 24 месяца.

Пример 7. Получение иммобилизованного биокатализатора и биокатализатор на основе клеток дрожжей S. cerevisiae phv bayanus, включенных в криогель ПВС, для биологического кислотопонижения виноградного сусла.

Биологическим кислотопонижением называют процесс яблочно-молочнокислого брожения, протекающего одновременно со спиртовым. Оно проводится для улучшения органолептических характеристик виноматериалов с высоким содержанием яблочной кислоты, которая конвертируется в молочную кислоту.

Дрожжи S.cerevisiae phv bayanus культивируют строго до конца логарифмической фазы роста при 28°С в течение 16 ч на среде, не содержащей этанола, а именно на солодовом сусле с концентрацией сухих веществ 10%.

50 г биомассы дрожжей, полученной после центрифугирования (10 мин, 6000 об/мин), смешивают с 950 г 11,5%-ного раствора ПВС, приготовленного на основе стерильной водопроводной воды до получения однородной массы. Полученную смесь раскапывают в иммунологические 96-луночные планшеты со сферическим дном по 0,1 мл, замораживают при -30°С, выдерживают в замороженном состоянии 14 ч, оттаивают при +8°С и, таким образом, получают биокатализатор, имеющий следующий состав (в мас.%): биомасса дрожжей 0,45 (по сух. массе); полимер 10,9; водная фаза - до 100. Общее время получения иммобилизованного биокатализатора составляет 36 ч.

Полученный иммобилизованный биокатализатор предназначен для сбраживания и биологического кислотопонижения виноградного сусла. При проведении сбраживания и кислотопонижения виноградного сусла, приготовленного из винограда сорта "Рислинг", содержащего 8,42 г/л яблочной кислоты, при 20°С в течение 14 сут с использованием этого биокатализатора получается белое сухое вино, содержащее 85,2 г/л спирта, 1,45 г/л молочной кислоты и пониженную концентрацию яблочной кислоты (6,98 г/л). При микроскопировании образцов полученного вина свободные клетки составляют 60 кл/мл.

Период полуинактивации такого биокатализатора при его хранении в замороженном состоянии составляет 18 месяцев.

Пример 8. Получение иммобилизованного биокатализатора и биокатализатор на основе клеток дрожжей S.cerevisiae phv bayanus, включенных в криогель ПВС, для биологического кислотопонижения сусла.

Получение иммобилизованного биокатализатора проводят как описано в Примере 7. Общее время получения иммобилизованного биокатализатора составляет 36 ч.

Полученный иммобилизованный биокатализатор предназначен для сбраживания и биологического кислотопонижения ягодного сусла. При проведении сбраживания и кислотопонижения ягодного (крыжовникового) сусла, содержащего 14,1 г/л яблочной кислоты, при 20°С в течение 7 сут с использованием этого биокатализатора получается ягодное вино, содержащее 45 г/л спирта, 3,5 г/л молочной кислоты и пониженную концентрацию яблочной кислоты (11,8 г/л). При микроскопировании образцов полученного вина свободные клетки составляют 110 кл/мл.

Период полуинактивации такого биокатализатора при его хранении в замороженном состоянии составляет 17 месяцев.

Пример 9. Свойства биокатализатора, полученного согласно заявляемому способу.

На фиг.1 представлены микрофотографии поверхности гранул иммобилизованного биокатализатора, полученного согласно способу-прототипу (а) и согласно заявляемому способу (Пример 1), иллюстрирующие различия в структуре гелей, получаемых разными способами. Макропоры носителя, получаемого по заявляемому способу, формирование которого происходит на воздухе, существенно больше размера пор носителя, полученного по способу-прототипу, формирование которого идет в среде гидрофобной жидкости. Эта разница в структуре носителей обеспечивает лучший массообмен для клеток, иммобилизованных по заявляемому способу. Наблюдается существенно меньшее вымывание клеток из носителя, полученного согласно заявляемому способу, несмотря на больший размер пор в нем по сравнению с прототипом. Эти различия обусловлены тем, что в процессе брожения углекислый газ, накапливающийся внутри носителя способа-прототипа из-за недостаточно хороших условий массообмена, разрывает под давлением стенки мелких пор носителя, и клетки выходят из матрицы. В случае заявляемого способа разрыв стенок больших пор матрицы носителя отсутствует.

В Табл.1 и Табл.2 представлены органолептические характеристики соответственно белого и красного вина, приготовленного с использованием свободных клеток и иммобилизованного биокатализатора, полученного по заявляемому способу. Представленные результаты подтверждают высокое качество спиртосодержащих напитков, получаемых с использованием заявляемого иммобилизованного биокатализатора.

На фиг.2 представлена динамика накопления давления углекислого газа при многократном использовании иммобилизованного биокатализатора, приготовленного по заявленному способу (Пример 1), в процессе вторичного брожения вина.

На фиг.3 представлена динамика накопления этанола в среде брожения при многократном использовании биокатализатора, приготовленного по заявленному способу (Пример 3), в процессе получения красного вина.

Представленные данные подтверждают возможность многократного использования заявляемого иммобилизованного биоктализатора для получения спиртосодержащих напитков. Период полуинактивации биокатализатора в процессе его эксплуатации составляет до 150 сут.

Таким образом, заявляемый способ и получаемый согласно этому способу иммобилизованный биокатализатор имеют следующие преимущества по сравнению с аналогами и прототипом:

- заявляемый способ позволяет сократить общее время получения иммобилизованного биокатализатора в 3-4 раза;

- заявляемый способ позволяет сократить ряд технологических операций (активацию клеток виноматериалом перед иммобилизацией, отмывку гранул биокатализатора от гидрофобной жидкости физраствором, и обработку клеток виноматериалом с d1-фактором после их иммобилизации), существенно сократив при этом расход виноматериала и устранив необходимость очистки сточных вод от гидрофобной жидкости;

- заявляемый способ предусматривает формирование биокатализатора на воздухе и позволяет устранить все проблемы, связанные с применением гидрофобной жидкости, имеющиеся в прототипе, существенно снизив таким образом токсичность и пожароопасность процесса получения биокатализатора, а также в отличие от прототипа возможно существенное расширение формы получаемого биокатализатора;

- заявляемый способ по сравнению с прототипом позволяет получать биокаталиазатор с увеличенным размером пор, обеспечивающим лучший массообмен и присутствие существенно меньшего количества свободных клеток в готовом продукте или полное их отсутствие;

- заявляемый биокатализатор может быть использован, в отличие от прототипа, для сбраживания более широкого спектра сред и, соответственно, для получения различных спиртосодержащих напитков, в том числе для устранения недобродов и биологического кислотопонижения сусел;

- заявляемый биокатализатор может быть использован многократно для получения различных спиртосодержащих напитков с большим выходом накапливающегося спирта или давления углекислого газа, чем в прототипе.

Таблица 1Органолептические характеристики белого вина, приготовленного с использованием свободных клеток, и иммобилизованного биокатализатора, полученного по заявляемому способу.Исследуемый объектОрганолептические характеристикиСвободные клеткиВ аромате плодовые тона, свежесть, легкость, цветочные и травянистые оттенки, зеленое яблоко. Вкус свежий гармоничный, отмечается высокая кислотность. Дегустационная оценка - 7,8.Иммобилизованный биокатализатор (Пример 2)Букет яркий, вкус бархатистый, слаженный, полный. Дегустационная оценка - 8,0.

Таблица 2.Органолептические характеристики красного вина, приготовленного с использованием свободных клеток, и иммобилизованного биокатализатора, полученного по заявляемому способу.Исследуемый объектОрганолептические характеристикиСвободные клеткиАромат неяркий, чистый, с оттенками красных ягод и сафьяна. Вкус жесткий, разлаженный, негармоничный. Дегустационная оценка - 7,8Иммобилизованный биокатализатор (Пример 3)Букет разнообразный, богатый, с тонами красных ягод, фруктовой гаммой и барбариской. Вкус гармоничный, округленный, с небольшой бархатистостью. Дегустационная оценка - 7,9.

Способ включает выращивание биомассы дрожжей в течение 12-18 ч на среде, не содержащей этиловый спирт, смешивание с раствором поливинилового спирта, замораживание на воздухе при -15÷-80°С, выдерживание при той же температуре в течение 12÷16 ч и размораживание при +2÷+10°С. При этом получают иммобилизованный биокатализатор, содержащий биомассу дрожжей 0,15÷0,90 мас.% (по сухой массе), поливиниловый спирт 10÷15 мас.%, водную фазу до 100 мас.%. Изобретение может быть многократно использовано для сбраживания широкого спектра сред, для устранения недобродов биологического кислотопонижения сусел. 2 н.п. ф-лы, 2 табл., 4 ил.

1. Способ получения иммобилизованного биокатализатора на основе иммобилизованных клеток дрожжей для производства спиртосодержащих напитков, отличающийся тем, что биомассу дрожжей, выращенную строго до конца логарифмической фазы роста в течение 12-18 ч на среде, не содержащей этиловый спирт, смешивают с раствором поливинилового спирта, замораживают в среде воздуха при (-15)-(-80°)С, выдерживают при той же температуре в течение 12-16 ч и размораживают при 2-10°С.2. Иммобилизованный биокатализатор для производства спиртосодержащих напитков, полученный по способу п.1 и характеризующийся следующим составом, мас.%:

биомасса дрожжей (по сухой массе)0,15÷0,90поливиниловый спирт10÷15водная фазадо 100.