ПРОИЗВОДНЫЕ БЕТУЛИНА КАК ИНГИБИТОРЫ КОМПЛЕМЕНТА Российский патент 2004 года по МПК C07J53/00 C07J63/00 A61K31/56 A61P37/04 

Предложенное изобретение относится к области медицины, а конкретно к иммунологии.

Система комплемента является частью иммунной системы организма, которая активируется при попадании в организм чужеродных бактерий и антигенов. После уничтожения чужеродных тел активация комплемента прекращается. Однако широкий спектр иммунных, аутоиммунных и иммунодефицитных заболеваний, сопровождающихся поражением собственных тканей организма, связан с чрезмерной и (или) несвоевременной активацией системы комплемента. К группе острых состояний, связанных с активацией системы комплемента, можно отнести респираторный дистрессиндром взрослых, ишемические повреждения (инфаркт миокарда, скелетных мышц, легких), сепсис, ожоговую болезнь, раневую болезнь, астму, повторный (послеоперационный) стеноз сосудов, синдром множественной органной недостаточности, кровотечения, синдром Гийена-Барре. В группу хронических состояний входят пароксизмальная ночная гемоглобинурия, гломерулонефрит, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, болезнь Альшеймера, отторжение органов при трансплантациях, миастения, рассеянный склероз. Часто активация системы комплемента, приводящая к осложнениям, возникает из-за неполной биосовместимости материалов в аппаратах для гемодиализа, искусственного сердца и др. В связи с этим создание эффективных модуляторов системы комплемента, способных предотвращать ее деструктивное действие на организм, является одной из актуальных задач современной молекулярной иммунологии

Известны высокомолекулярные терапевтические препараты на основе природных и рекомбинантных форм естественных ингибиторов системы комплемента (C1-ING и sCRl) [Asghar S.S. Pharmacological manipulation of the complement system in human diseases. //Frontiers in Bioscience. 1996. March 1. V.1 P.15-25]. Причина привлекательности рекомбинантных белков, как терапевтических препаратов, заключена в уже заложенных в них биологических свойствах Однако высокая стоимость рекомбинантных белков и их возможная иммуногенность делает их неконкурентоспособными по сравнению с простыми и дешевыми низкомолекулярными ингибиторами системы комплемента.

На сегодняшний день найдено много сильных низкомолекулярных ингибиторов активации комплемента in vitro. Среди них противоопухолевые, потивовоспалительные, антифибринолитические агенты. Розмариновая кислота (1) ингибирует активацию комплемента при IC₅₀ 180 мкМ [Sahu A., Rawal N. Inhibition of

complement by covalent attachment of rosmarinic acid to activated C3b //Biochem. Pharmacol. 1999. V.57, P.1439-1446]. Это природное соединение труднодоступно, к тому же недостаточно активно.

Наиболее близкими по структуре и достигаемому результату к предлагаемому предмету изобретения являются полусинтетические аналоги олеановой кислоты (2). Из табл.1 видно, что наиболее активное соединение этого ряда ингибирует активацию комплемента при IС₅₀ 31.4 мкМ [Assefa H., Nimrod A. Synthesis and evaluation of potential complement inhibitory semisynthetic analogs of oleanolic acid. //Bioorg.Med.Chem.Lett. 1999. V.9. P. 1889-1894].

К несомненным недостаткам такого ингибитора следует отнести недостаточно высокую активность, малую доступность исходной олеановой кислоты, многостадийность получения ее производных, обладающих необходимым свойством.

Технической задачей данного изобретения является синтез более активного ингибитора комплемента.

Для достижения лучшего технического результата нами предложены новые ингибиторы комплемента, блокирующие активацию комплемента при IC₅₀ до 7 мкМ. Они получаются из выделяемого из коры березы тритерпена бетулина.

Ингибиторы комплемента общей формулой

где R¹, R² одинаковые или различные и независимо или вместе представляют:

- SO₂(OH) и их соли (А)

- Р(O)(ОН)₂ и их соли (В)

- СН₂СООН и их соли (С)

где R₃, -С(СН₃)(=СН₂) (I)

- СН(СН₃); (II)

Пример 1

3,28-Дисульфаты бетулина и его производных (IA-VIA). Сульфатирование бетулина (1, R1=R2=H) и его производных (II-VI, Rl=R2=H) проводят по следующей схеме. К смеси 9.5 ммоль серной кислоты и 9.5 ммоль уксусного ангидрида в 10 мл пиридина при температуре от 18 до 90°С прибавляют 1.6 ммоль соответствующего производного бетулина и перемешивают в течение 30-60 минут. Затем смесь нейтрализуют, осадок неорганических солей отфильтровывают, раствор упаривают досуха. Полученные кристаллы дважды промывают 20 мл воды и сушат. Выходы продуктов 90-97%.

Дисульфат бетулина (IA): ¹Н-ЯМР (CDCl3-CD3ОD, 1:1, δ , м.д.): 0.68-1.99 (42Н, 6СН3, (СН2)n, м.), 3.65 (1H,=CHOS, т.), 4.0 (2Н, CH2OS, д. д.). 4.55, 4.70 (2Н, СН2=С, 2 с.).

Пример 2

3,28-Дифосфаты бетулина и его производных (IB-VIB) получают по следующей методике. 3.20 ммоль производного бетулина нагревают с 32.04 ммоль хлорокиси фосфора и 0.41 ммоль трихлорида фосфора при механическом перемешивании при 90-95°С 24 ч, продувая аргоном, затем добавляют еще 10.7 ммоль хлорокиси фосфора и нагревают при тех же условиях еще 76 ч. Избыток хлорокиси фосфора отгоняют под вакуумом. Оставшуюся маслянистую жидкость кристаллизуют при температуре -4° С с 10 мл гексана. Осадок отделяют декантированием, приливают 32 мл гептана, 20 мин кипятят с обратным холодильником, отделяют нерастворившийся осадок декантированием и раствор помещают в холодильник (-4° С) для кристаллизации. Выпавшие кристаллы отфильтровывают, растворяют в 5 мл теплой воды и сушат над Р₂O₅ и КОН. Выход 68-75%.

Дифосфат бетулина (IB): ¹Н-ЯМР (CDCl3-CD3ОD, 1:1, δ , мд): 0.68-1.99 (42Н, 6СН3, (СН2)n. м.), 3.61 (1Н,=СНОР, т.), 3.90 (2Н, СН2OР, д. д.), 4.55, 4.70 (2Н, СН2=С, 2с.).

Пример 3

3,28-Ди-О-карбоксиметилбетулин и его производные (IC-VIC) получают по следующей методике. К 3.2 ммоль гидрида натрия в 20 мл тетрагидрофурана добавляют 1.6 ммоль производного бетулина, а затем 3.2 ммоль этилового эфира бромуксусной кислоты. Реакционную смесь кипятят при перемешивании 30 минут, затем упаривают. Добавляют 10 мл воды и 2 мл концентрированной соляной кислоты и упаривают до 3 мл. После охлаждения выпавшие кристаллы отфильтровывают, промывают 5 мл воды и сушат. Выходы продуктов 85-95%.

3,28-Ди-О-карбоксиметилбетулин (IC): ¹Н-ЯМР (CDCl3-CD3ОD, 1:1, δ , м.д.): 0.68-1.99 (42Н, 6СН3, (СН2)n, м.), 3.63 (1H,=OСН2СООН, т.), 3.95 (2H, OСН2СООН, д. д.), 4.49 (4Н, СН2СООН, с), 4.55, 4.70 (2Н, СН2=С, 2 с.).

Пример 4

20,29-Дигидробетулин (II, R¹=R²=H) получают каталитическим гндрированием бетулина в тетрагилрофуране на 5%-ом палладии на угле при комнатной температуре и атмосферном давлении. Выход количественный.

Пример 5

20,29-Дигидро-20,29-дихлорметиленбетулин (V, R¹=R²=H) и 20.29-дигидро-20,29-дибромметиленбетулин (IV, R¹=R²=H) получают в гетерофазной смеси бетулина (I, R¹=R²=H), хлористого метилена и хлороформа (либо бромоформа) с 50% водным раствором гидрооксида натрия в присутствии катализатора межфазного переноса в течение 20 ч. Смесь упаривают и экстрагируют конечные вещества тетрагидрофураном, перекристаллизовывают из этилацетата. Выходы 85 и 60% соответственно.

20,29-Дигидро-20,29-дихлорметиленбетулин (V, R¹=R²=H): т. пл. 201-202,5⁰C. ¹Н-ЯМР (CDCl₃): 3.72 (1H, д, J 10.7, 28-СН2OН), 3.22 (1Н, д, J 10.7, 28-СН₂OН). 3.18 (1Н. м, 3Н). 2.30 (1Н, м, 19Н). 1.22 (3Н, с, СН₃), 0.99 (3Н, с, СН₃), 0.98 (3Н, с, СН₃), 0.96 (3Н, с, СН₃), 0.81 (3Н, с, СН₃), 0.74 (3Н, с, СН₃). Найдено, %: С 70.84, Н 9.59. С₃₁H₅₀Cl₂O₂. Вычислено, %: С 69.39, Н 9.65.

20,29-Дигидро-20,29-днбромметиленбетулин (IV, R¹=R²=H): т. пл.162-164° С; ¹Н-ЯМР (CDCl₃): 3.72 (1H, д, J 10.2, 28-СН₂OН), 3.22 (1Н, д, J 10.2, 28-СН₂ОН). 3.18 (1Н, м, 3Н), 2.40 (1H, м, 19Н), 1.66 (3Н, с, СН₃), 1.59 (3Н, с, СН₃), 1.36 (3Н, с, СН₃), 1.00 (3Н, с, СН₃), 0.94 (3Н, с, СН₃), 0.81 (3Н, с, СН₃). Найдено, %: С 60.59, Н 8.20. C₃₁H₅₀Br₂O₂. Вычислено, %: С 60.82, Н 8.83.

Пример 6

20,29-Дигидро-20,29-метиленбетулин (III, R¹=R²=H) получают из 2 ммоль бетулина (I, R¹=R²=H) и 3 ммоль дииодометана в эфире в присутствии металлической меди активированной цинковой пылью в течение суток. Раствор фильтруют, упаривают, перекристаллизовывают из этилацетата. Выход 60%. т. пл.233-234,5° С, ¹Н-ЯМР (CDCl3): 3.72 (1H, д, J 10.7, 28-СН2OН), 3.22 (1H, д, J 10.7, 28-СН2OН), 3.18 (1H, м, 3-Н), 2.30 (1H, м, 19-Н), 1.22 (3Н, с, СН3), 0.99 (3Н, с, СН3), 0.98 (3Н, с, СН3), 0.96 (3Н, с, СН3), 0.81 (3Н, с, СН3), 0.74 (3Н, с, СН3), 0.24 (4Н, м, СН2-СН2); EI-MS m/z 457 М+.

Найдено, %: С 81.52, Н 11.47. С31H52О2. Вычислено, %: С 78.06, Н 11.52.

Пример 7

30-Бромбетулин (VI) получают бромированием 1,5 ммоль бетулина (I) 1,6 ммоль N-бромсукцинимидом в 20 мл четыреххлористого углерода в течение 24 ч. После упаривания и промывания 10 мл горячей воды получают кристаллический порошок. Выход 91%. ¹Н-ЯМР (CDCl3): 5.00, 5.11 (2Н, с, 29-СН2=), 3.95 (2Н, с, 30-СН2Вr), 3.72 (1Н, д, J 10.7, 28-СН2OН), 3.22 (1Н, д, J 10.7, 28-СН2OН), 3,18 (1Н, м, 3-Н), 2.30 (1H, м, 19-Н), 1.22 (3Н, с, СН3), 0.99 (3Н, с, СН3), 0.98 (3Н, с, СН3), 0.96 (3Н, с, СН3), 0.81 (3Н, с, СН3), 0.74 (3Н, с, СН3).

Пример 8

Определение антигемолитической активности (АА) проводят в стандартной гемолитической системе следующего состава: сенсибилизированные кроличьими антителами бараньи эритроциты, образец исследуемого вещества, комплемент морской свинки, вероналовый буфер (рН 7.4), содержащий ионы Са²⁺ и Mg²⁺ (VBS⁺⁺) [Козлов Л.В., Ростовцева Л.И., Ломака Т.С., Сутовская Н.С., Сорокина И.Б, Баркова Т-И. // Биоорганич. Химия, 1985, т. 11, с. 1510-1518].

Приготовление буфера. При перемешивании и нагревании растворяют 3 г (0.0145 моль) мединала и 5.75 г (0.0312 моль) веронала в 1.5 л дистиллированной воды. Растворяют 85 г (1.45 моль) NaCl и доводят объем до 2 л. Добавляют безводный NaOH (0.4-0-5 г) до рН 7.4. Затем добавляют 5 мл 1 М раствора хлорида магния и 1.5 мл 1 М раствора хлорида кальция.

Подготовка эритроцитов. Эритроциты хранятся при +4°С в стерильных пробирках в растворе Олсвера в анаэробных условиях. В экспериментах используют эритроциты в VBS⁺⁺. Во всех экспериментах используют только холодный буферный раствор (чтобы снизить спонтанный лизис эритроцитов). Для проведения эксперимента стерильно отбирают 2-3 мл суспензии эритроцитов, добавляют 20 мл буфера, аккуратно встряхивают до гомогенного состояния, и центрифугируют при 3000g 5 мин. Затем супернатант аккуратно сливают, добавляют немного VBS⁺⁺ и ресуспендируют осадок. После этого добавляют буфер до достижения прежнего уровня. Описанная операция повторялась до тех пор, пока супернатант не обесцветился. Полученную суспензию эритроцитов далее стандартизуют.

Приготовление сенсибилизированных эритроцитов. К 10 мл взвеси эритроцитов (1· 10⁹ клеток/мл) прибавляют 10 мл раствора кроличьих антител, полученного разбавлением буфером (VBS⁺⁺) в отношении 1:400, перемешивают и инкубируют 30 мин при 37° С, периодически взбалтывая. Взвесь центрифугируют при 3000g 5 мин. Затем супернатант аккуратно сливают, добавляют немного VBS⁺⁺ и ресуспендируют осадок.

Стандартизация сенсибилизированных эритроцитов. Взвесь эритроцитов доводят до концентрации 1.5· 10⁸ клеток/мл. Для этого к 1900 мкл дистиллированной воды прибавляют 100 мкл суспензии сенсибилизированных эритроцитов и встряхивают до тех пор, пока раствор не стал прозрачным. Необходимо добиться того, чтобы оптическая плотность раствора лежала в пределах 1.000-1.050. Для этого, если нужно, разбавляют суспензию эритроцитов буфером и повторяют операцию приготовления лизированного раствора и измерения оптической плотности. В дальнейшем используют стандартизованные эритроциты.

Подбор концентрации комплемента. Для тестирования веществ подбирают концентрация комплемента, при которой лизис составляет 75-80%. Это делали следующим образом. В пробирки добавляют компоненты согласно таблице 2 и инкубируют в течение 25 минут при 37° С, осторожно встряхивая их содержимое через каждые 5-7 мин.

По окончании термостатирования в пробирки вносят дополнительно по 3 мл холодного буфера. Все пробирки центрифугируют 5 мин при 3000g, измеряют оптическую плотность супернатанта (А₄₁₄ экс и А_{414 п/л ср.}). Далее по рассчитанным по формуле I значениям лизиса строят график зависимости величины лизиса от концентрации комплемента.

L=A_414ЭКС/А_{414 п/л ср.}·_{100% (I)}

А_414ЭКС - оптическая плотность супернатанта проб 5-16;

A_{414 п/л ср.}. - средняя оптическая плотность супернатанта проб 1-3.

Необходимо также обратить внимание на фоновый лизис эритроцитов - А_КЭ (лизис в чистом буфере). Желательно, чтобы он не превышал значения оптической плотности 0.1. Если он превышает 0.2, следует взять новую порцию эритроцитов.

Для дальнейших экспериментов используют ту концентрацию комплемента, при которой наблюдается 75-80% лизис эритроцитов.

Для определения антигемолитической активности веществ в каждую пробирку добавляют компоненты геополитической системы и раствор тестируемого вещества, руководствуясь таблицей 3. Контроль на полный лизис осуществляют добавлением дистиллированной воды вместо буфера. Контроль 75-80% лизиса осуществляют в пробах 4-6.

Пробирки тщательно встряхивают и инкубируют при 37° С в течение 25 мин. После этого содержимое пробирок охлаждают до 4° С, разбавляют буфером в 4 раза и центрифугируют при 3000g в течение 5 мин. После этого супернатант отделяют, количество высвободившегося гемоглобина в пробе измеряют спектрофотометрически при 414 нм.

Описываются производные бетулина общей формулы I

где R¹, R² одинаковые или различные и независимо или вместе

- SO₂(OH) и их соли

- Р(O)(ОН)₂ и их соли

- СН₂СООН и их соли

где R³, -С(СН₃)(=СН₂)

- СН(СН₃)₂

как ингибиторы комплемента. I проявляют более высокую активность, их получают из доступного тритерпена бетулина, выделяемого из коры березы. 5 табл.

Производные бетулина общей формулы

где R₁, R₂ одинаковые или различные и независимо или вместе представляют

- SO₂(OH) и их соли,

- Р(O)(ОН)₂ и их соли,

- СН₂СООН и их соли,

R₃ - -С(СН₃)(=СН₂),

- СН(СН₃)₂

как ингибиторы комплемента.