Изобретение относится к новым производным пептидов, называемыми мемнопептидами, которые можно получить брожением Memnoniella echinata FH2272, DSM 13195 в культуральной среде, к способу получения мемнопептидов и к применению мемнопептидов в качестве фармацевтических препаратов, например, для производства фармацевтического препарата для лечения сердечной недостаточности.
Сердечно-сосудистые заболевания еще занимают первое место в качестве причин смерти в западных промышленных странах. Значительную часть из них представляют собой пациенты с диагнозом сердечной недостаточности. Значение термина «сердечная недостаточность» подразумевает неадекватное функционирование сердца. Сердце неспособно продуцировать выброс, соответствующий потребностям млекопитающего. Сердечная недостаточность представляет собой острую или хроническую неспособность сердца в условиях нагрузки или даже в покое обеспечить выброс крови, необходимый для метаболизма, или принять венозный возврат. Она представляет собой состояние сердца, при котором такие механизмы компенсации как частота сердечных сокращений, ударный объем или повышенное давление больше не достаточны для поддержания нормального сердечного выброса. Сердечная недостаточность имеет множество причин, например, воспалительные и дегенеративные изменения миокарда (сердечной мышцы), расстройства коронарного кровообращения и инфаркт миокарда. Сердечная недостаточность приводит к изменениям периферического кровообращения, к нарушению дыхания, почечной функции и электролитного баланса, а также к снижению силы скелетной мускулатуры, а в конечном счете она часто приводит к смерти.
Сердечная недостаточность преимущественно возникает в немолодом возрасте. Ее частота составляет 3 расстройства в год на 1000 жителей в возрасте от 35 до 64 лет и 10/1000/год в возрастной группе от 65 до 94 лет. Фактор смертности у лиц в возрасте 75 лет возрастает почти на 200 по сравнению с возрастной группой от 35 до 44 лет. Как показали исследования в США, с 1970 по 1983 г смертность оставалась приблизительно постоянной. Для Федеративной Республики Германии те же цифры предстоит определить. Более 50% больных умирают в первые 5 лет после установления диагноза. Данное статистическое исследование само по себе показывает большое значение сердечной недостаточности для населения, но оно также подтверждает неадекватные возможности медикаментозного лечения, которые имеются у врача в настоящее время.
Учитывая неадекватность современных способов лечения, были разработаны новые концепции, которые должны привести к созданию новых сердечных лекарственных препаратов. Способность сердечных и скелетных мышц сокращаться и, таким образом, выполнять механическую работу, зависит от (1) сократительных структурных элементов (миофибрилл) и (2) химической энергии (АТФ), доступной для миофибрилл, которая превращается в механическую энергию в процессе сокращения. Укорочение миофибрилл происходит в процессе сокращения. Это может инициироваться двигательными нервными импульсами, под действием которых ионы кальция (Са2+) входят в саркоплазматическое пространство из внеклеточного пространства в пределах нескольких миллисекунд, и депо кальция опорожняются. При недостаточности миокарда (сердечной недостаточности) концентрация Са2+ в миофибриллах может быть снижена. Однако ионы Са2+ играют ключевую роль в активации сократительного аппарата. Если имеется возросшая потребность, Са2+ преимущественно закачивается в саркоплазматический ретикулум (СР) под влиянием катализа мембранной Са2+-зависимой Mg2+-АТФазы: этот фермент также называется Са2+АТФаза сарко(эндо)плазматического ретикулума (SERCA2). В соответствии с гидропатическим анализом Са2+АТФаза включает 10 трансмембранных спиралей и ряд внемембранных петель. С цитозольной стороны образуются домены связывания Са2+ и АТФ, фосфорилирования и взаимодействия с модуляторным белком фосфоламбаном (PLB). Последний представляет собой белковый пентамер, который локализуется в мембране СР и оказывает ингибирующее влияние на SERCA2 в нефосфорилированном состоянии. В условиях физиологического стресса происходит фосфорилирование PLB, которое увеличивает сродство SERCA2 с Са2+ и, таким образом, увеличивает скорость транспорта ионов Са2+ в СР. Фосфорилирование PLB (белка из 52 аминокислот) происходит на двух аминокислотных остатках: серин-16 может фосфорилироваться цАМФ-зависимой протеинкиназой, а треонин может фосфорилироваться в положении 17 киназой, зависимой от Са2+/кальмодулина. Фосфорилирование вызывает изменение конформации PLB, за которым следует увеличенное сродство SERCA2 с Са2+. Антитела против PLB способны имитировать эффект фосфорилирования PLB и, таким образом, подтверждают ключевую роль PLB в качестве регулятора сократительной активности сердца (Phospholamban: Protein Structure, Mechanism of Action and Role in Cardiac Function. H.K. Simmermann and L.R. Jones, Physiological Reviews; Vol.78, №4,921ff, 1998). Таким образом, активаторы SERCA2 должны оказать благоприятное влияние при сердечной недостаточности.
Неожиданно было обнаружено, что культуры штамма грибов Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195 содержат естественные вещества, которые способны проявлять благоприятные воздействия на сердце и кровообращение. Выделенные активные соединения, мемнопептиды, представляют собой естественные вещества, включающие специфические составные группы. Эти составные группы включают терпеновые звенья, так называемую поликетидную часть, и группу, содержащую водород.
Терпены представляют собой естественно встречающиеся соединения, которые могут формально трактоваться как продукты полимеризации углеводорода изопрена. В соответствии с рядом изопреновых групп можно дифференцировать монотерпены (С10), сесквитерпены (C15), дитерпены (С20) и т.д. Большое число соединений может образовываться из родительских структур замещением, циклизацией, перегруппировкой, окислением и т.д.; соответственно, в литературе было описано много тысяч терпенов. Также сообщалось о содержащих азот соединениях, происходящих от терпенов, но они перечисляются среди алкалоидов (например, алколоиды Gentiana) [Römpp Chemie Lexikon [Römpp's Chemical Encyclopedia], 9th Edition, Volume 6, page 4508 ff., Georg Thieme Verlag, Stuttgart/New York, 1992]. Однако эти терпены кардинально отличаются от мемнопептидов в соответствии с изобретением, в котором терпены не содержат поликетидную группу, с помощью которой они могут связывать азот.
Примерами других известных содержащих азот терпенов являются:
- Стахибоцины [J.Antibiotics, 48:1396 (1995)];
- Стахиботрины [Y.Nozawa et al. J.Antibiotics, 50:635-645 (1997)];
- Спиродигидробензофурановые лактамы [J.Antibiotics, 49:13 (1996)];
- Накиджихиноны [Tetrahedron, 51:10867-10874 (1995)];
- F1839-A-F1839-J представляют собой содержащие азот терпены, имеющие поликетидные части [патенты Японии 061864133 и 08283118]. Они являются ингибиторами холестеринэстеразы.
Данные терпеновые производные были синтезированы из различных штаммов родов Memnoniella echinata и Stachybotrys и других. Они были описаны как антагонисты эндотелинового рецептора, как ингибиторы протеазы ВИЧ-1 и холестринэстеразы и как тонизирующие средства для волос. Ингибитор инозитолмонофосфотазы L-671,776 был, кроме того, выделен из культур штамма Memnoniella echinata ATCC 20928 [Y.К.Т.Lam et al. J. Antibiotics, 45, pp.1397-1402, (1992)].
Мемнопептиды в соответствии с изобретением имеют отличающийся спектр активности. Характерным признаком является их активирующее воздействие на SERCA2 и, таким образом, на сердце при его недостаточности.
Таким образом, настоящее изобретение относится к соединениям формулы (I)
в которой
R1 и R2 вместе представляют собой О с двойной связью, или Н2, или Н и ОН, или Н и O-C1-C4-алкил;
R3 и R4 вместе представляют собой О с двойной связью, или Н2, или Н и ОН, или Н и O-С1-С4-алкил;
R8 выбран из Н, ОН, С1-С4-алкила и O-С1-С4-алкила, такого как O-метил;
R6 представляет собой группу формулы (II)
в которой
R9 представляет собой Н или сахар, связанный гликозидной связью, или группу формулы (III)
в которой R10 представляет собой Н или сахар, связанный гликозидной связью;
и в которой,
если R6 представляет собой группу формулы (II), то R5 представляет собой связь с атомом углерода С9 формулы (II), а R7 представляет собой Н, или R7 представляет собой связь с атомом углерода С9 формулы (II), a R5 представляет собой Н и
если R6 представляет собой группу формулы (III), то R5 и R7 представляют собой Н;
А представляет собой аминокислоту;
n представляет собой целое число, выбранное от 1 до 12, причем каждая А такая же или отлична от каждой другой А;
в которой атом азота в изоиндольном кольце формулы (I) представляет собой азот N-концевого амина первой аминокислоты группы (А)n;
или их соли или производному;
при условии, что
А представляет собой аминокислоту, отличную от Glu, когда n равно 1 и R1 и R2 вместе представляют собой О с двойной связью и R3 и R4 вместе представляют собой H2, a R6 представляет собой группу формулы (II), a R5 представляет собой связь с атомом углерода С9 группы формулы (II), а R7 представляют собой Н, a R8 представляют собой Н и R9 представляют собой Н.
В формуле (I) (А)n может представлять собой, по меньшей мере, одну природную аминокислоту, выбранную из: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Ser, Thr, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, Asp, His, Glu, Asn, Gin, Cys и Met. A(n) может представлять собой пептидную цепь, имеющую от 2 до 12 аминокислот. В одном варианте реализации А(n) включает 10 аминокислот.
С1-С4-алкил представляет собой прямоцепочечный или разветвленный алкил, имеющий от 1 до 4 атомов углерода, такой как метил, этил, изо-пропил или трет-бутил.
Сахар может представлять собой гексозу, например альдогексозу, такую как манноза, глюкоза или галактоза, которая может быть необязательно замещена дополнительными группами, такими как C1-C4-алкил или NH2.
Настоящее изобретение, кроме того, относится ко всем очевидным производным соединений формулы I. Производные представляют собой соли, продукты восстановления, сложные эфиры, простые эфиры, ацетаты, а также амиды и продукты N-алкилирования, кроме того, все оптические антиподы, диастереомеры и все стереомерные формы.
В одном варианте реализации соединение формулы (I) имеет формулу (IV)
в которой R1, R2, R3, R4, R9 и (А)n имеют значение, как указано выше. В формуле (IV) R1 и R2, взятые вместе, могут представлять собой О с двойной связью, R3 и R4 вместе могут представлять собой Н2, и R9 может представлять собой Н.
В одном варианте реализации соединение изобретения представляет собой мемнопептид A, C76H108N16O18S формулы (IVa)
В этой формуле декалиновая структура, имеющая 4-метиловые и одну метиленовую группу, представляет собой терпеновую часть; замещенное изоиндольное кольцо представляет собой кетидную часть. Аминокислотная последовательность:
Met His Gln Pro His Gln Pro Leu Pro Pro (SEQ ID NO:1)
является частью казеиновой последовательности. Метионин (Met) может быть окислен до сульфоксида.
Формула (IVb) показывает предпочтительную пространственную форму:
в которой (А)n имеет значение, как указано выше.
Физико-химические и спектроскопические свойства предпочтительного соединения в соответствии с изобретением можно обобщить следующим образом:
Мемнопептид А
Нумерация атомов углерода и ассоциированных ЯМР химических сдвигов классифицируется в соответствии с процедурой нумерации для циклических сесквитерпенов.
Фиг.1: Нумерация циклического сесквитерпена кетолида.
Данные ЯМР (химические сдвиги) мемнопептида А в ДМСО - d6 при 310К.
3.467, 3.689
1.792
3.624
3.655, 3.538
3.538
1.416
м
1.840, 0.926
1.719
м
1.719, 4.484, 2.198
1.722
м
1.927, 4.468, 2.166
3.067
3.067
1.771
м
1.945
2.144, 4.578, 1.905,
1.945
4.578
1.840
м
2.144, 4.223, 1.926
3.533
2.031
м
(1.863)
2.012
м
1.814, 4.388, (1.927)
1.430
м
(1.802)
1.538, 1.460,
1.802
2.792
д
3.154
37.84
2.546
2.633, 2.783
40.03
4.536
3.533
1.851
3.467
м
1.936
49.70
2.758 2.633
2.783
ддт ддт
ддт
2.682, 2.162,2.289 2.783, 2.289 2.162
2.633, 2.289, 2.162
4.869, 2.545
4.585
8.506, 2.934, 3.067
53.62
4.869
2.162, 2.284
1.771, 1.905,
3.553,1.926,
73.51
97.91
0.972, 0.668
100.88
6.596
112.55
116.90
8.665
2.976, 4.585
4.592
132.96
153.62
2.792
2.792, 4.330
168.07
169.89
8.499, 4.892, 2.182
1.924, 4.356
4.388
1.844, 7.918
1.805, 4.570
173.81
173.86
1.73
8.496
Таблица 2
4.588
1.727, (1.927)
1.688,1.427
6.807
s
6.789
s
В одном варианте реализации изобретения соединения формулы (I) можно получить брожением Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195 или одного из его вариантов или мутантов в подходящих условиях в культуральной среде до тех пор пока, по меньшей мере, один мемнопептид формулы (I) не будет присутствовать в культуральной среде, с последующим выделением мемнопептидов.
Поэтому изобретение, кроме того, относится к способу получения соединения формулы I, который включает культивацию микроорганизма Memnoniella echinata FH2272, DSM 13195 в культуральной среде до тех пор, пока, по меньшей мере, один мемнопептид формулы (I) не будет присутствовать в культуральной среде, и последующее выделение мемнопептида из культуральной среды.
В одном варианте реализации штамм FH2272, DSM 13195, его мутанты и/или варианты подвергаются культивации в питательном растворе (называемом также культуральная среда), включающем, по меньшей мере, один источник атомов углерода и, по меньшей мере, один источник атомов азота и, необязательно, включающий обычные неорганические соли, до тех пор пока мемнопептиды не будут присутствовать в культуральной среде. Затем мемнопептиды могут быть выделены из культуральной среды и, необязательно, разделены на отдельные активные компоненты и подвергнуты очистке. В одном варианте реализации мемнопептиды накапливаются в культуральной среде и разделяются на отдельные компоненты.
В другом варианте реализации, по меньшей мере, один источник атомов азота, используемый для культуральной среды, выбирается из аминокислот и пептидов. Аминокислоты и пептиды, используемые в качестве источников атомов азота, могут быть такими же, как группа (А)n, как определено выше.
Способ в соответствии с изобретением может использоваться для культивации в лабораторном масштабе (в диапазоне от мл до л) и в промышленном масштабе (в масштабе м3).
Была выращена колония Memnoniella echinata FH2272, характеризующаяся сильной продуцирующей способностью. Изолят был депонирован 14 декабря 1999 г. в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, 330 Brunswick, Germany, в соответствии с правилами Будапештской конвенции, под следующим номером: Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195.
Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195 имеет коричнево-зеленый мицелий и характеризуется конидиофорами, характерными для рода Memnoniella.
Варианты и мутанты штамма Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195 могут также применяться для синтеза, по меньшей мере, одного соединения мемнопептидов в соответствии с изобретением. Такие мутанты могут быть получены per se известным способом, физическими методами, например, облучения, такого как облучение ультрафиолетовыми или рентгеновскими лучами, или химическим мутагенезом, с использованием таких реагентов, как этилметансульфонат (EMS), 2-гидрокси-4-метоксибензофенон (MOB) или N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (MNNG). Возможные варианты включают тесно связанные виды грибов Stachybotrys, такие как Stachybotrys atra, Stachybotrys chartarum или Stachybotrys complementi.
Скрининг для выявления мутантов и вариантов, которые синтезируют, по меньшей мере, одно соединение мемнопептидов в соответствии с изобретением, может проводиться в соответствии со следующей схемой:
- Отделение мицелия после культивации;
- Экстракция мицелия органическим растворителем;
Экстракция мемнопептидов из фильтрата культуры с использованием твердых фаз;
- Анализ посредством ВЭЖХ нисходящей хроматографии или испытание биологической активности.
Описанные ниже условия культивации относятся к грибу Memnoniella echinata FH 2272, депонированному изоляту DSM 13195 и к его мутантам и вариантам.
В одном варианте реализации в питательном растворе, включающем, по меньшей мере, один источник атомов углерода, казеиновый пептон в качестве источника атомов азота и обычные неорганические соли, Memnoniella echinata FH 2272 продуцирует мемнопептид А. В одном варианте реализации Memnoniella echinata FH 2272 представляет собой DSM 13195.
Возможные источники атомов углерода для аэробной культивации включают ассимилируемые углеводы и сахарные спирты, такие как глюкозу, лактозу, сахарозу, крахмалы, декстрины, фруктозу, мелассу, глицерин, галактозу и D-маннитол, и содержащие углеводы естественные продукты, такие как экстракт солода. Возможные источники атомов азота включают, например, аминокислоты, пептиды, белки, продукты распада аминокислот, пептидов и белков, такие как казеин, пептоны и триптоны; экстракты мяса; экстракты дрожжей; экстракты арахиса; пророщенные семена, например, кукурузы, пшеницы, бобов, сои и хлопчатника; композиции, содержащие семена; остатки перегонки при производстве спиртов; мясная мука; экстракты дрожжей; аммониевые соли и нитраты. В одном варианте реализации, по меньшей мере, один источник атомов азота выбран из синтетически полученных пептидов и биосинтетически полученных пептидов. Питательный раствор необязательно включает, по меньшей мере, одну неорганическую соль. В одном варианте реализации неорганическая соль выбрана из хлоридов, карбонатов, сульфатов и фосфатов. Сульфаты и фосфаты могут быть выбраны из сульфатов щелочных металлов, фосфатов щелочных металлов, сульфатов щелочноземельных металлов и фосфатов щелочноземельных металлов, причем щелочноземельные металлы выбраны из железа, цинка, кобальта и марганца.
Образование мемнопептидов в соответствии с изобретением может проходить в питательном растворе, включающем казеиновый пептон. В одном варианте реализации питательный раствор включает концентрацию казеинового пептона в диапазоне от около 0,05 до 5%. Другой вариант реализации включает концентрацию казеинового пептона в диапазоне от 0,1 до 1%. Еще один вариант реализации включает концентрацию казеинового пептона в диапазоне от 0,2 до 5%. Питательный раствор может включать глюкозу. Один вариант реализации включает концентрацию глюкозы в диапазоне от 0,5 до 3%. Питательный раствор может также включать кукурузный гидролизат. В одном варианте реализации питательный раствор включает концентрацию кукурузного гидролизата в диапазоне от 0,05 до 1%. Другой вариант реализации включает концентрацию кукурузного гидролизата в диапазоне от 0,1 до 0,5%. Питательный раствор может включать следовые количества, по меньшей мере, одного компонента, выбранного из хлорида калия, сульфата магния и сульфата железа.
В одном варианте реализации питательный раствор включает казеиновый пептон, глюкозу, кукурузный гидролизат и следовые количества хлорида калия, сульфата магния и сульфата железа. В другом варианте реализации питательный раствор включает концентрацию казеинового пептона в диапазоне от около 0,05 до 5%, концентрацию глюкозы в диапазоне от 0,5 до 3%, концентрацию кукурузного гидролизата в диапазоне от 0,05 до 1% и следовые количества хлорида калия, сульфата магния и сульфата железа. Данные в процентах в каждом случае связаны с массой всего питательного раствора.
В этом питательном растворе Memnoniella echinata, которая может представлять собой Memnoniella echinata FH 2272 DSM 13195, образует смесь мемнопептидов. В зависимости от состава питательного раствора количественная доля одного или нескольких мемнопептидов в соответствии с изобретением может варьировать. Кроме того, синтез отдельных мемнопептидов может контролироваться составом сред так, что мемнопептид может не продуцироваться вообще или может продуцироваться микроорганизмом в количестве ниже предела выявления.
Культивирование микроорганизма может проводиться в аэробных условиях, т.е., например, погружением со встряхиванием или перемешиванием во встряхиваемых колбах или ферментерах, необязательно с введением воздуха или кислорода. Оно может проводиться в диапазоне температур от около 18 до 37°С, в более узком диапазоне от около 20 до 32°С и в еще более узком диапазоне от 25 до 30°С. Диапазон рН должен быть от 6 до 8, например, от 6,5 до 7,5. В целом микроорганизм культивируется в этих условиях в течение периода от 24 до 300 ч, обычнее от 36 до 140 ч.
Преимущественно культивирование может проводиться в несколько этапов, т.е., по меньшей мере, одна прекультура может быть получена в жидкой питательной среде и затем может быть посеяна в действительную продукционную среду, основную культуру, например, в объемном соотношении 1:10. Прекультура может быть получена, например, посевом мицелия в питательный раствор и предоставлением ей возможности расти в течение приблизительно от 36 до 120 ч, например, в течение от 48 до 72 ч. Мицелий может быть получен, например, предоставлением возможности штамму расти в течение приблизительно от 3 до 40 дней, например, от 4 до 10 дней, на твердой или жидкой питательной среде, например, на солодово-дрожжевом агаре или картофельном декстрозном агаре (стандартная среда для плесневых грибов, например, продаваемая компанией Difco).
За течением культивирования можно следить посредством контроля рН культур или объема мицелия, а также с использованием хроматографических способов, такими как тонкослойная хроматография или высокоэффективная жидкостная хроматография, или испытанием биологической активности. Соединение в соответствии с изобретением может быть и в мицелии, и в фильтрате культуры, но самая большая часть обычно обнаруживается в фильтрате культуры.
Описанный ниже процесс выделения служит для очистки мемнопептидов в соответствии с изобретением, например, мемнопептида А. Выделение или очистка мемнопептида в соответствии с изобретением из культуральной среды может проводиться в соответствии с известными способами с учетом химических, физических и биологических свойств естественных веществ. Для тестирования концентраций мемнопептидов в культуральной среде на отдельных этапах выделения может применяться тонкослойная хроматография, например, на силикагеле, с использованием в качестве элюента изопропанол/25% NH3, или ВЭЖХ. Определение при выделении тонкослойной хроматографией может проводиться, например, посредством цветных реагентов, таких как хлорсульфоновая кислота/ледяная уксусная кислота, причем количество образовавшегося вещества целесообразно сравнивать с калибровочным раствором.
Для выделения мемнопептида в соответствии с изобретением мицелий в целом сначала удаляют из культурального бульона с использованием обычных процедур, а затем мемнопептиды экстрагируют из клеточной массы с использованием необязательно смешиваемого с водой органического растворителя. Фаза органического растворителя содержит естественные вещества в соответствии с изобретением; она может необязательно концентрироваться в вакууме, и остаток может быть подвергнут дальнейшей очистке, как описано ниже. В одном варианте реализации мемнопептид экстрагируется из культуры добавлением растворителя в смесь грибов и среды.
Фильтрат культуры может необязательно объединяться с концентратом экстракта мицелия и экстрагироваться подходящим, не смешиваемым с водой органическим растворителем, например н-бутанолом. Удаленная в последующем органическая фаза может необязательно концентрироваться в вакууме. Для обезжиривания ценных продуктов концентрат может быть разбавлен неполярным растворителем, в котором соединения в соответствии с изобретением не очень растворимы, например с гексаном, петролейным эфиром или простым диэтиловым эфиром. При этом процессе мемнопептиды осаждаются, а липофильные примеси остаются растворенными и могут быть удалены обычными методами разделения твердой и жидкой фазы.
Преципитат, включающий мемнопептиды, может быть растворен в 1/30 исходного объема воды/метанола. Преципитат растворяется полностью в ходе этой манипуляции и может быть лиофилизирован. Лиофилизат, называемый в последующем неочищенным продуктом, может включать от 5 до 50% мемнопептидов и может применяться для дальнейшего выделения.
Дальнейшая очистка, по меньшей мере, одного пептида в соответствии с изобретением может проводиться хроматографией на подходящих материалах, например, на молекулярных ситах, на силикагеле, оксиде алюминия, на ионообменниках или на адсорбирующих смолах, или на обращенных фазах (RF). Мемнопептиды могут отделяться с помощью данной хроматографии. Хроматография мемнопептидов может проводиться с использованием буферных водных растворов или смесей водных и органических растворов.
Понятие «смеси водных и органических растворов» подразумевает все смешиваемые с водой органические растворители, такие как метанол, пропанол и ацетонитрил, в концентрации от 5 до 80% растворителя, обычнее от 20 до 50% растворителя или, альтернативно, все буферные водные растворы, которые смешиваемы с органическими растворителями. Буферы, которые должны применяться, могут быть такими же, как указано выше.
Отделение мемнопептидов на основании их отличающейся полярности может проводиться с помощью хроматографии в обращенной фазе, например, на MCI® (адсорбирующая смола от компании Mitsubishi, Japan) или Amberlite XAD® (Toso Haas), или дополнительных гидрофобных материалов, таких как на фазах RF-8 или RF-18. Кроме того, отделение может проводиться с помощью нормальнофазной хроматографии, например, на силикагеле, оксиде алюминия и им подобных.
Хроматография мемнопептидов может проводиться с использованием буферного или подкисленного водных растворов или смесей водных растворов со спиртами или другими смешиваемыми с водой органическими растворителями. В одном варианте реализации органический растворитель выбран из пропанола и ацетонитрила.
Под понятием «буферные или подкисленные водные растворы» подразумевается, по меньшей мере, один раствор отдельно или в комбинации. Например, указанный, по меньшей мере, один раствор может быть выбран из воды, фосфатных буферов, ацетата аммония, цитратных буферов и кислот. В одном варианте реализации цитратный буфер находится в концентрации в диапазоне от 0 до 0,5 М. Кислоты выбраны из муравьиной кислоты, уксусной кислоты, трифторуксусной кислоты и из всех коммерчески доступных кислот, известных специалисту в данной области. В одном варианте реализации коммерчески доступная кислота находится в концентрации в диапазоне от 0 до 1%. Еще в одном варианте реализации концентрация кислоты составляет 0,1%.
Хроматография может проводиться с использованием градиента, который начинается со 100% воды и заканчивается 100% растворителя. Используется, по меньшей мере, один растворитель. Может также применяться смесь двух или более растворителей. В одном варианте реализации линейный градиент поддерживается от 20 до 50% растворителя, выбранного из пропанола и ацетонитрила.
Альтернативно, может также проводиться гель-хроматография или хроматография на гидрофобных фазах.
Гель-хроматография может проводиться на полиакриламидных или сополимерных гелях, таких как Biogel-P 2®(Biorad) или Fractogel TSK HW 40® (Merck, Germany, или Toso Haas, USA).
Еще одним очень эффективным способом очистки соединений в соответствии с изобретением может быть использование ионообменников. Например, основной мемнопептид А может быть с большим преимуществом выделен на катионных обменниках, таких как Fractogel® EMD SO3. Могут использоваться буферные растворы с рН от 5 до 8, например с рН от 6 до 7,5. Элюция может быть достигнута, например, использованием повышающегося солевого градиента. В дополнение к воде целесообразно также использовать смеси водных буферных растворов с органическим растворителем в качестве растворителей. Доля органического растворителя может составлять от 10% до 90%, например, от 30 до 60%.
Последовательность указанных выше хроматографических процессов может быть обратимой.
Дальнейшим очень эффективным этапом очистки мемнопептидов является кристаллизация. Мемнопептиды могут быть выкристаллизованы из растворов в органических растворителях и из смесей воды с органическими растворителями. Кристаллизация может проводиться известным способом, per se, например, концентрацией или охлаждением насыщенных растворов мемнопептидов.
Мемнопептиды в соответствии с изобретением устойчивы в твердом состоянии и в растворах в диапазоне рН от 3 до 8, например, от 5 до 7, и, таким образом, могут быть включены в обычные фармацевтические препараты.
Образованию содержащих азот мемнопептидов может способствовать добавление желаемых аминокислот или пептидов в качестве прекурсора к культуре Memnoniella echinata. Особенностью видов Memnoniella echinata может быть то, что они связывают аминогруппы аминокислот и пептидов, поставляемых синтезом пятичленного кольца лактама, обычно кольцевой системой изоиндола. Это связывание происходит или начиная с альдегидного предшественника в ходе окисления или со стадии окисления лактона в форме с открытым кольцом или в циклической лактоновой форме. Данная способность Memnoniella echinata связывать амины абсолютно удивительна и может использоваться для получения защищенных, конвертированных аминовых производных, таких как терпеновые производные аминокислот и пептидов.
По меньшей мере, одно соединение мемнопептидов в соответствии с изобретением может быть походящим в плане их ценных фармакологических свойств для применения в качестве фармацевтических препаратов в медицине или ветеринарии.
Таким образом, настоящее изобретение относится к применению соединения формулы (I) или его физиологически переносимой соли для производства сердечного лекарственного препарата для лечения или профилактики сердечной недостаточности.
Соединения в соответствии с настоящим изобретением могут также применяться для производства лекарственного препарата для лечения заболеваний, при которых сердечная недостаточность представляет собой первичную или вторичную причину заболевания, такого, например, как недостаточность кровообращения.
Механизм действия мемнопептидов не установлен, но было выявлено их значимое действие.
Для выявления активаторов SERCA2, которые имитируют эффект фосфорилирование PLB, может быть проведено колориметрическое испытание, которое определяет активность Са2+АТФазы в микросомах сердца собаки в присутствии испытуемых веществ. Испытание может быть проведено в 96-ячеечных микротитровальных планшетах. В спекторфотометре при длине волны 620 нм может быть измерено ферментное высвобождение неорганического фосфата из АТФ, который образует окрашенный в синий цвет комплекс с молибдатом аммония.
Мемнопептид А активирует SERCA2 в концентрации от 12,5 мкмоль.
Мемнопептиды, кроме того, обладают антимикробным действием.
Таким образом, настоящее изобретение относится к применению соединения формулы (I) или его физиологически переносимой соли для производства лекарственного препарата для лечения микробных, например, бактериальных инфекций.
В табл.3 показаны некоторые минимальные ингибирующие концентрации (М1С) антимикробного спектра мемнопептида А против некоторых отобранных бактерий.
В дополнение к антибактериальному действию соединения в соответствии с изобретением проявляют слабые антимикотические, т.е. противогрибковые свойства, например, против Candida albicans.
Кроме того, вещества в соответствии с изобретением оказывают определенное благоприятное ингибирующее действие на глюкозо-6-фосфат транслоказу (G-6-P-TL), фермент, который играет важную роль для метаболизма глюкозы и, таким образом, для лечения сахарного диабета. Например, соединение мемнопептид А проявляет избирательные виды активности против G-6-P-TL, но не ингибирует кофермент G-6-P фосфатазу.
Таким образом, настоящее изобретение относится к применению соединения формулы (I) или его физиологически переносимой соли для производства лекарственного препарата для лечения сахарного диабета.
Изобретение также относится к фармацевтическим препаратам, по меньшей мере, одного соединения мемнопептидов в соответствии с изобретением.
По меньшей мере, одно соединение мемнопептидов в соответствии с изобретением может в целом вводиться как таковое в неразведенной форме. Применение в виде смеси с подходящими эксципиентами или носителями представляет собой один вариант реализации изобретения. Носители, которые могут использоваться в лекарственных препаратах, могут представлять собой обычные и фармакологически переносимые носители и/или эксципиенты.
Лекарственные препараты в соответствии с изобретением могут преимущественно вводиться перорально или парентерально, но ректальное введение также возможно. Подходящие твердые или жидкие формы фармацевтических препаратов представляют собой, например, гранулы, порошки, таблетки, таблетки с покрытием, (микро) капсулы, суппозитории, сиропы, эмульсии, суспензии, аэрозоли, капли или растворы для инъекций в ампулированной форме и препараты, имеющие защищенное высвобождение активного соединения, причем в этих препаратах обычно используются носители и добавки и/или эксципиенты, такие как дезинтегранты, связующие, покрывающие средства, агенты, вызывающие набухание, глиданты или смазывающие вещества, ароматизаторы, подслащивающие вещества или смачивающие агенты. Часто используемые носители или эксципиенты, которые могут быть упомянуты, представляют собой, например, карбонат магния, диоксид титана, лактозу, маннит и другие сахара, тальк, лактопротеин, желатин, крахмал, витамины, целлюлозу и ее производные, животные или растительные жиры/масла, полиэтиленгликоли и растворители, такие как стерильная вода, спирты, глицерин и многоатомные спирты.
В случаях целесообразности, дозированные лекарственные формы могут быть микроинкапсулированными для орального введения для отсрочки высвобождения или для продолжения его в течение более длительного периода времени, например, покрытием или заливкой активного соединения в виде частиц в подходящие полимеры, воски или им подобные.
В одном варианте реализации фармацевтические препараты могут производиться и вводиться в дозированных лекарственных формах, причем каждая дозированная форма включает в качестве активного ингредиента определенную дозу, по меньшей мере, одного соединения мемнопептидов в соответствии с изобретением. В случае твердых дозированных лекарственных форм, таких как таблетки, капсулы и суппозитории, эта доза может составлять до около 500 мг, но обычнее она может составлять приблизительно от 0,1 до 200 мг, а в случае растворов для инъекций в ампулированной форме - приблизительно до 200 мг, но обычно приблизительно от 0,5 до 100 мг из расчета на день.
Суточная доза, которую предстоит ввести, в целом зависит от массы тела, возраста, пола и состояния млекопитающего. Однако в определенных условиях могут также быть целесообразны более высокие или более низкие суточные дозы. Введение суточной дозы может проводиться как однократным введением в виде отдельной дозированной единицы или в виде ряда меньших дозированных единиц, и многократным введением разделенных доз через определенные интервалы.
Лекарственные препараты в соответствии с изобретением могут быть произведены путем включения, по меньшей мере, одного соединения мемнопептидов в соответствии с изобретением в подходящую лекарственную форму для введения с использованием обычных носителей и, если целесообразно, добавок и/или эксципиентов.
Изобретение далее иллюстрируется в следующих примерах. Процентные доли относятся к массе. Если не были представлены другие детали, то соотношения смешивания, в случае жидкостей, относятся к объему.
Следующие примеры предназначены для иллюстрации изобретения без ограничения диапазона его притязаний.
Примеры
Пример 1. Получение глицериновой культуры Memnoniella echinata FH2272, DSM 13195.
100 мл питательного раствора (2,0% экстракт солода, 0,2% дрожжевой экстракт, 1,0% глюкоза, 0,05% (NH4)2HPO4, pH 6,0) в стерильной колбе Эрленмейера емкостью 300 мл засевают штаммом Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195 и инкубируют на ротационном шейкере при 25°С и скорости вращения 140 об/мин в течение 7 дней. Затем 1,5 мл данной культуры разводят 2,5 мл глицерина 80% крепости и хранят при -20°С.
Пример 2. Получение культуры или прекультуры Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195 в колбе Эрленмейера.
В стерильную колбу Эрленмейера емкостью 300 мл, содержащую 100 мл следующего питательного раствора: 10 г/л глюкозы, 5 г/л казеинового пептона, 1,7 г/л жидкого кукурузного гидролизата и 7 мл раствора микроэлементов (10 г/л KCl, 10 г/л MgSO4×7 Н2O, 3/6 г/л FeSO4×7 Н2O и 6 г/л MgSO4×Н2O) засевают культуру, выращенную в пробирке со скошенной питательной средой (такой же питательный раствор, но с 2% агаром) или 1 мл глицериновой культуры (см. пример 1) и инкубируют при 180 об/мин и 30°С на шейкере. Максимальная продукция, по меньшей мере, одного из соединений мемнопептидов в соответствии с изобретением было достигнута приблизительно через 120 ч. Для засева ферментеров емкостью 10 и 200 л была использована культура, близкая к слиянию, выращивавшаяся в течение 48-96 ч (количество засева около 10%) из того же питательного раствора.
Пример 3. Получение мемнопептидов.
Ферментер емкостью 30 л работал в следующих условиях:
Питательная среда:
10 г/л глюкозы
0,5 г/л казеинового пептона
1,7 г/л жидкого кукурузного гидролизата
7 мл раствора микроэлементов
рН 6,5 (перед стерилизацией)
Образование пены необязательно подавляют повторным добавлением раствора этанолового многоатомного спирта. Максимальную продукцию достигают приблизительно через 35-70 ч.
Пример 4. Выделение смеси мемнопептидов из культурального раствора Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195.
После завершения культивирования Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195 культуральный бульон из ферментера, полученный в соответствии с примером 3 (200 л) фильтруют с добавлением приблизительно 2% ускорителя фильтрования (например, Celite®) и клеточную массу (22 л) экстрагируют с помощью 66 л метанола. Метаноловый раствор, содержащий целевое вещество, освобождают от мицелия фильтрацией и концентрируют в вакууме. Концентрат разводят водой и наносят на подготовленную 17-литровую колонку MCI GEL, CHP20P вместе с фильтратом культуры (180 л). Его элюируют градиентом воды после 60% пропан-2-ола в воде. Колоночный поток (25 л/ч) собирают по фракциям (10 л каждая) и объединяют фракции, содержащие мемнопептиды (от 25% до 30% пропан-2-ола).
Концентрация в вакууме дает 20 л коричневого раствора. 6 л катионного обменника Fractogel® EMD SO3 -, уравновешенного при рН 7 буфером с фосфатом калия, упаковывают в колонку (125 мм×500 мм). После загрузки ионообменника 20 л описанного выше концентрата его элюируют градиентом 10 мМ буфера фосфата калия при рН 7 после 1 М NaCl в 10 мМ буфере фосфата калия, рН 7 в воде/метаноле (1:1). Колоночный поток, т.е. несвязанный материал, содержит нейтральные мемнопептиды (49 г). Колоночный поток составляет 12 л/ч; порции по 1 л собирают по фракциям во время градиентного элюирования. С использованием 0,75 М NaCl (фракции 31 и 32) получают мемнопептид А. Фракции 31 и 32 объединяют и концентрируют приблизительно до 500 мл в вакууме.
Пример 5: Обогащение мемнопептида А гель-хроматографией.
8 г продукта, полученного в соответствии с примером 4, наносят на колонку емкостью 3,9 л, упакованную Fractogel® TSK HW-40 (ширина (высоту=10 см ×50 см). Элюент: метанол/вода (1:1) прокачивают через колонку при скорости потока 20 мл/мин, и выходящий поток из колонки собирают по фракциям (20 мл). Мемнопептиды А обнаруживают главным образом во фракциях с 75 по 85. Их объединяют и освобождают от метанола в вакууме. Это дает 0,9 г смеси активного вещества.
Пример 6. Система ВЭЖХ для выявления мемнопептидов.
Описанная ниже система обеспечила возможность проведения испытания чистоты, а также разделения и количественной оценки мемнотерпенов, например, в необработанной смеси или в фильтратах культуры.
Элюент: 0,1% трифторуксусная кислота в 32% ацетонитриле
Колонка: Нуклеосил (Nucleosil 100C18AB 250/4, Macherey-Nagel)
Поток: 1,0 мл/мин
Детекция: Поглощение ультрафиолетового света при 210 нм.
В указанных условиях мемнопептид А может иметь следующее время удерживания: Мемнопептид А: 7,0 мин.
Пример 7. Очистка мемнопептида А.
500 мл раствора мемнопептида А, выделенного и обогащенного в соответствии с примером 5, наносят на колонку Nucleosil®100-7 C18AB емкостью 500 мл и хроматографируют с использованием градиента от 25 до 50% ацетонитрила в 0,05% трифторуксусной кислоте в воде. Поток элюента составляет 50 мл/мин; размер фракции 50 мл. Мемнопептид А обнаруживают во фракциях с 71 по 88. Повторная очистка объединенных фракций с постоянной концентрацией растворителя 28% ацетонитрила в 0,05% трифторуксусной кислоте дает >95% чистого мемнопептида С после лиофилизации (100 мг).
Характеристика мемнопептида А:
10 мкг мемнопептида А гидролизуют в постоянно кипящей хлористоводородной кислоте и исследуют в аминокислотном анализаторе. Обнаруживают следующие обычные аминокислоты:
Поглощение ультрафиолетового света: λmax при 269 нм, 305 нм (кромка).
Масс-спектр FAB высокого разрешения показывает интенсивный МН+ при m/z 1565, 7819 Да, что хорошо согласуется с рассчитанной массой (для C76H109T16O18S, моноизотопного), равной 1565, 7827 Да. Фрагментация MS/MS соответствует формуле (IVa).
БУДАПЕШТСКИЙ ДОГОВОР ПО МЕЖДУНАРОДНОМУ ПРИЗНАНИЮ ДЕПОЗИТА МИКРООРГАНИЗМОВ В ЦЕЛЯХ ПАТЕНТНОЙ ПРОЦЕДУРЫ
II. НАУЧНОЕ ОПИСАНИЕ И/ИЛИ ПРЕДЛАГАЕМОЕ ТАКСОНОМИЧЕСКОЕ ОБОЗНАЧЕНИЕ
Микроорганизм, идентифицированный выше по пункту 1, сопровождался:
( ) научным описанием
(X) предлагаемым таксономическим обозначением
(Нужное отметить крестом)
III. ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИЕМКА
Орган Международного депозитария принимает микроорганизм, идентифицированный выше под пунктом I, который был получен им 12.09.1999 г (Дата первоначального депонирования)1
IV. ПОЛУЧЕНИЕ ЗАПРОСА НА ПЕРЕВОД
Микроорганизм, идентифицированный выше под пунктом I, был получен данным органом Международного депозитария (дата первоначального депонирования) и запрос на перевод первоначального депозита в депозит в соответствии с Будапештским договором был получен им (дата получения запроса на перевод).
V. ОРГАН МЕЖДУНАРОДНОГО ДЕПОЗИТАРИЯ
* В случае, если применяется Правило 6.4 (d), такая дата представляет собой дату, в которую был приобретен статус органа Международного депозитария.
Форма DSMZ-BP/4 (одна страница) 0196.
Изобретение относится к пептидным производным, называемым мемнопептиды, применяемые в качестве действующего вещества для производства лекарственного препарата для лечения микробной инфекции.
Предложено соединение формулы (I)
где R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, и (А)n имеют соответствующие значения, или его соль.
Получение соединения формулы (I), происходит путем культивации Memnoniella echinata FH2272, DSM 13195 в подходящих условиях в питательной среде, включающей, по меньшей мере, один источник атомов углерода и, по меньшей мере, один источник атомов азота, до тех пор, пока, по меньшей мере, одно соединение формулы (I) не будет присутствовать в питательной среде, с последующим выделением указанного соединения.
Достигнутый технический результат заключается в создании фармацевтической композиции, обладающей антимикробной активностью. Создание препарата позволяет расширить ассортимент средств для лечения подобных заболеваний, 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 2 табл.
в которой R1 и R2 вместе представляют собой О с двойной связью;
R3 и R4 каждый независимо представляет собой водород;
R8 представляет собой водород;
R6 представляет собой группу формулы (II)
в которой R9 представляет собой атом водорода;
при этом R5 представляет собой связь с атомом углерода С9 формулы (II), a R7 представляет собой атом водорода, или
R5 представляет собой атом водорода, a R7 представляет собой связь с атомом углерода С9 формулы (II);
(А)n представляет собой аминокислотную последовательность
Met-His-Gln-Pro-His-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro (SEQ ID NO:1),
или его соль.
где (А)n имеет значение, определенное в п.1.
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕТИЛОВОГО ЭФИРА N-БЕНЗИЛОКСИКАРБОНИЛ-L-АСПАРТИЛ-L-ФЕНИЛАЛАНИНА | 1994 |
|
RU2083585C1 |
| ПРОИЗВОДНЫЕ ДИАЗАБИЦИКЛОАЛКЕНОВ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ | 1993 |
|
RU2126008C1 |
| WO 9931255 А2, 24.06.1999 | |||
| B.E.Roggo et | |||
| al | |||
| Печь для непрерывного получения сернистого натрия | 1921 |
|
SU1A1 |
| B.E.Roggo et | |||
| al | |||
| "Novel spirohydrobenzopuranlactam as antagonists of | |||
