СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИОХЛОРОФИЛЛА А Российский патент 2018 года по МПК C12P17/18 C12N1/20 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение в целом относится к способам получения бактериохлорофиллов из микроорганизмов и, в частности, к улучшенным способам ферментации для получения бактериохлорофилла а из пурпурных бактерий.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Фотодинамическая терапия (ФДТ) применяется в качестве нехирургического лечения опухолей. ФДТ сочетает в себе нетоксичные лекарственные средства и безопасное фотосенсибилизирующее облучение, оба безвредные агенты сами по себе, для образования в присутствии молекулярного кислорода цитотоксических активных форм кислорода (АФК) in situ, которые способны убить или инактивировать клетки. Будучи бинарным методом лечения, ФДТ позволяет повысить специфичность и обладает потенциалом быть более избирательной, однако не менее разрушительной, по сравнению с широко используемой химиотерапией или радиотерапией.

Порфирины применяли в клиниках в качестве фотосенсибилизирующих агентов первого поколения. Порфимер натрия (Фотофрин®, торговая марка Axcan Pharma Inc.), первый одобренный в мире агент для фотодинамической терапии, который получен из гематопорфирина-IX путем обработки кислотами, и который получил одобрение FDA для лечения рака пищевода и эндобронхиального немелкоклеточного рака легкого, представляет собой сложную и неразделимую смесь мономеров, димеров и высших олигомеров.

Большой объем работ был посвящен синтезу отдельных чистых соединений - так называемых сенсибилизаторов «второго поколения», - которые поглощают в области длинных волн, обладают хорошо установленными структурами и проявляют лучшую дифференциацию между их задержкой в опухолевых клетках и их задержкой в коже или других нормальных тканях. С целью оптимизации характеристик порфириновых лекарственных средств для терапии и диагностики предложено несколько производных порфирина, в которых, например, центральный атом металла (кроме Mg) образует комплекс с четырьмя пиррольными кольцами, и/или модифицированы периферические заместители пиррольных колец, и/или макроцикл дигидрогенирован до производных хлорофилла (хлоринов) или тетрагидрогенирован до производных бактериохлорофилла (бактериохлоринов).

Из-за интенсивного поглощения в подходящих областях спектра (650-850 нм) и быстрого удаления после лечения, производные хлорофилла (Chl) и бактериохлорофилла (Bchl) были идентифицированы как отличные сенсибилизаторы для ФДТ опухолей, имеющие превосходные свойства в сравнении с порфиринами. Бактериохлорофиллы имеют потенциальные преимущества по сравнению с хлорофиллами, поскольку они демонстрируют интенсивные полосы в области, близкой к инфракрасной, то есть при значительно больших длинах волн по сравнению с производными хлорофилла.

Бактериохлорофиллы представляют собой фотосинтетические пигменты, которые имеются у различных фототрофных бактерий. Они относятся к хлорофиллам, которые являются основными пигментами у растений, водорослей и цианобактерий. Бактерии, которые содержат бактериохлорофилл (Bchl), осуществляют фотосинтез, но не выделяют кислород. Они используют световые волны такой длины, которые не поглощаются растениями или цианобактериями. Различные группы бактерий синтезируют различные виды бактериохлорофилла:

По химическому составу бактериохлорофиллы a, b и g представляют собой бактериохлорины, то есть их молекулы имеют бактериохлориновое макроциклическое кольцо с двумя редуцированными пиррольными кольцами (B и D). Бактериохлорофилл a (в данном описании Bchla) представляет собой соединение формулы:

Бактериохлорофиллы c, d и e представляют собой хлорины, то есть их молекулы имеют хлориновое макроциклическое кольцо только с одним редуцированным пиррольным кольцом (D).

Пурпурные фотосинтезирующие бактерии

Пурпурные фотосинтезирующие бактерии способны получать клеточную энергию из света, органических соединений или неорганических соединений, в зависимости от химических и физических факторов среды. Данная примечательная универсальность обычно означает, что один режим метаболизма используется в то время и так, чтобы предотвратить ненужный биосинтез альтернативных энергетических систем. Таким образом, фотосинтетический метаболизм и, следовательно, биосинтез пигментов происходит только при ограниченной совокупности условий.

В отношении способности продуцировать бактериохлорофилл выделяют две основные группы в пределах пурпурных бактерий. Первая группа включает в себя Rhodobacter (Rba.) spheroidedes, Rba. Capsulatus и Rhodospirilum rubrum, которые фотосинтезируют и таким образом продуцируют бактериохлорофилл на свету в анаэробных условиях; они также могут синтезировать значительное количество пигмента в темноте, но только в условиях низкой аэрации. Данный факт указывает на регуляцию, в зависимости от кислорода и света, генов, кодирующих ферменты, участвующие в синтезе данных пигментов. Вторая группа, включающая в себя Rhodovulum sulfidophilum, sp. и Rubrivivax (Rvi.) gelatinosus, способна синтезировать пигменты в темноте и фотосинтезировать как при анаэробных, так и при аэробных условиях.

Биосинтез Bchla факультативной аэробной бактерией Rhodovulum sulfidophilum, ранее известной как Rhodobacter sulfidophilus, был описан Porra et al., 1998 (Porra, RJ, M. Urzinger, J. Winkler, C. Bubenzer, and H. Scheer, Eur. J. Biochem. 257, 185-191).

Bchla, полученный из Rhodovulum sulfidophilum, послужил основой для дальнейшего получения и модификации для синтеза улучшенных производных Bchla, применяемых в ФДТ и реактористо-целевой ФДТ (VTP) опухолей и других патологических состояний, как описано, например, в US 6147195, EP 863903, US 6333319, US 6569846, WO 2004/045492 и US 8207154.

Возрастает применение производных Bchla для ФДТ и исследования ФДТ; следовательно, существует увеличивающаяся потребность в получении более высоких количеств Bchla путем ферментации.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно настоящему изобретению предложен способ ферментации для получения бактериохлорофилла а (Bchla) из фотосенсибилизирующих пурпурных бактерий Rhodovulum sulfidophilum, включающий стадии выращивания бактерии в биореакторе и выделение полученного Bchla из собранных бактерий.

В частности, настоящее изобретение относится к способу периодической ферментации с подпиткой для получения бактериохлорофилла а (Bchla) из Rhodovulum sulfidophilum, причем указанный способ включает:

(i) культивирование Rhodovulum sulfidophilum в реакторе ферментера в ростовой среде, содержащей неорганическое соединение азота в качестве источника азота, источник углерода, источник фосфора, источник железа, источник магния, дрожжевой экстракт и NaCl;

(ii) подачу культуры на периодическую ферментацию с подпиткой одновременно с подачей в среду сукцината в качестве источника углерода, неорганического соединения в качестве источника азота и источника фосфора из внешних резервуаров, соединенных с реактором ферментера, и поддержание уровня кислорода на уровне 10% или ниже;

(i) выделение клеток из среды; и

(ii) выделение и восстановление Bchla из клеток из стадии (iii).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В способах, описанных в литературе, Bchla была получена из бактерий, выращенных в среде, содержащей органический источник азота, такой как пептон, полипептон или смесь аминокислот и небольших пептидов, полученных с помощью кислотного гидролиза казеина, известных как казаминовые кислоты (Shioi, Yuzo, Plant Cell Phisiol. 27(3): 567-572,1986; Porra et al., Eur. J. Biochem. 257, 185-191, 1998).

В соответствии с настоящим изобретением было установлено, что определенные модификации процесса ферментации для выращивания пурпурных бактерий Rhodovulum sulfidophilum привели к 12-кратному увеличению объемного выхода Bchla и существенно снизили расходы производства.

Таким образом, согласно настоящему изобретению предложен способ ферментации для получения Bchla из культивированных Rhodovulum sulfidophilum в количествах, значительно превышающих количества, полученные с использованием известных способов ферментации.

В настоящем описании, термины «ферментер», «реактор ферментера» и «биореактор» используются взаимозаменяемо для обозначения реактора, в котором рост и ферментация Rhodovulum sulfidophilum происходит в соответствии с настоящим изобретением.

В настоящем описании, термины «ростовая среда» и «ферментационная среда» используются взаимозаменяемо для обозначения среды, в которой бактерии Rhodovulum sulfidophilum выращивают в ферментере.

Способ согласно данному изобретению включает усовершенствования как в ростовой среде для бактерий, так и в процессе ферментации.

Усовершенствование, относящееся к ростовой среде согласно настоящему изобретению, заключается в замене пептона, который является дорогостоящим источником азота животного происхождения, на неорганический источник азота.

Усовершенствование способа ферментации согласно настоящему изобретению включает непрерывную подачу в биореактор свежих питательных веществ из внешних резервуаров, содержащих питательные растворы источников азота, углерода и фосфора, при одновременном мониторинге в режиме онлайн уровней необходимых питательных веществ в ферментационной среде и подаче их при необходимости. Согласно данному способу, известному как «периодическая ферментация с подпиткой», питательные вещества непрерывно подают к выращиваемым бактериям в биореактор в количествах и скоростях введения, которые зависят от скорости потребления данных питательных веществ в биореакторе бактериями в процессе ферментации.

Несмотря на то, что неорганические источники азота иногда используются в ростовой среде для бактерий, авторы изобретения неожиданно обнаружили, что применение хлорида аммония в качестве единственного источника азота и периодической ферментации с подпиткой по изобретению привело к увеличению на 350% сухой массы клеток на литр и увеличению на 335% концентрации Bchla в клетках, а именно, 600 мг Bchla на литр - почти в 12 раз выше, чем в известных промышленных способах. Кроме того, это привело к снижению стоимости среды, широко используемой для выращивания Rhodovulum sulfidophilum, примерно на 15%.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу периодической ферментации с подпиткой для получения бактериохлорофилла а (Bchla) из Rhodovulum sulfidophilum, причем указанный способ включает:

(i) культивирование Rhodovulum sulfidophilum в реакторе ферментера в ростовой среде, содержащей неорганическое соединение азота в качестве источника азота, источник углерода, источник фосфора, источник железа, источник магния, дрожжевой экстракт и NaCl;

(ii) подачу культуры на периодическую ферментацию с подпиткой одновременно с подачей в среду сукцината в качестве источника углерода, неорганического соединения в качестве источника азота и источника фосфора из внешних резервуаров, соединенных с реактором ферментера, и поддержание уровня кислорода на уровне 10% или ниже;

(iii) выделение клеток из среды; и

(iv) выделение и восстановление Bchla из клеток из стадии (iii).

Неорганическое соединение азота в ростовой среде может быть любым из неорганических соединений азота, применяемых в ростовых средах для бактерий, такое как, но без ограничений, хлорид аммония, сульфат аммония, нитрат аммония, дигидрофосфат аммония, гидрофосфат аммония, нитрат калия и нитрат натрия, или любая их комбинация. В некоторых вариантах реализации предпочтительным неорганическим соединением азота является хлорид аммония (NH₄Cl). Неорганический источник азота также подается к выращиваемым бактериям путем добавления в ферментационную среду в процессе периодической ферментации с подпиткой по мере необходимости.

Источником углерода в ростовой среде может быть, например, моно- или дисахариды, сахароза, дикарбоновые кислоты, такие как яблочная кислота, янтарная кислота и сукцинат натрия, глицерин, лимонная кислота, или любые их комбинации. Кроме того, источник углерода, включающий янтарную кислоту и сукцинат натрия, подают к выращиваемым бактериям путем добавления в ферментационную среду в процессе периодической ферментации с подпиткой по мере необходимости.

Источник фосфора в ростовой среде может включать одну или более водорастворимую соль гидрофосфата и дигидрофосфата, например, фосфаты натрия, калия, и аммония, а также пирофосфат. В некоторых вариантах реализации, источник фосфора включает смесь фосфатных солей K₂HPO₄*3H₂O и KH₂PO₄. Кроме того, источник фосфора, включающий эти две фосфатные соли, подают к выращиваемым бактериям путем добавления в ферментационную среду в процессе периодической ферментации с подпиткой по мере необходимости.

Источником железа в ферментационной среде может быть одна или более водорастворимая соль двухвалентного или трехвалентного железа, например, цитрат аммония железа, хлорид железа, ацетат железа и сульфат железа. В некоторых вариантах реализации источник железа представляет собой цитрат аммония железа (цитрат FeNH₄).

Источником магния в ферментационной среде может быть одна или более водорастворимая соль магния, например, хлорид магния, глюконат магния, нитрат магния, сульфат магния, цитрат магния, ацетат магния или сукцинат магния. В некоторых вариантах реализации источник магния представляет собой сульфат магния (MgSO₄*7H₂O).

Ферментационная среда Rhodovulum sulfidophilum может содержать, согласно настоящему изобретению, источник углерода в количестве 30-45 г/л, источник фосфора в количестве 0,4-0,7 г/л, источник азота в количестве 1,5-3,0 г/л, дрожжевой экстракт в количестве 1,5-2,5 г/л, источник железа в количестве 0,5-1,0 г/л, источник магния в количестве 0,15-0,3 г/л, NaCl в количестве 10-30 г/л и микроэлементы.

В некоторых вариантах реализации, ферментационная среда содержит смесь следующих ингредиентов: лимонной кислоты, CaCl₂*2H₂O, MgSO₄*7H₂O, цитрата FeNH₄, янтарной кислоты, динатрия сукцината*6H₂O, Na₂SO₄, K₂CO₃, дрожжевого экстракта, NH₄Cl, KH₂PO₄, K₂HPO₄^*3H₂O, NaCl, NaOH, KOH, антивспенивающего агента и микроэлементов. Микроэлементами могут быть CoCl₂*6H₂O, NiCl₂*6H₂O, CuCl₂*2H₂O, MnCl₂*4H₂O, ZnSO₄*7H₂O, Na₂MoO₄*2H₂O, H₃BO₃ и KI, а антивспенивающий агент может быть любым антивспенивающим агентом, используемым в ферментативных способах, например, Y-30 или Biospumex.

В некоторых вариантах реализации ферментационная среда содержит следующие количества следующих ингредиентов: 30,0-40,0 г/л янтарной кислоты; 2,0-4,0 г/л Na₂SO₄; 0,5-1,0 г/л CaCl₂; 0,2-0,5 г/л K₂CO₃; 0,5-1,0 г/л цитрата аммония железа; 1,5-2,5 г/л дрожжевого экстракта; 3,0-6,0 г/л лимонной кислоты; 0,15-0,3 г/л MgSO₄; 10-30 г/л NaCl; 1,5-3,0 г/л NH₄Cl; 0,2-0,4 г/л KH₂PO₄; и 2,0-3,0 г/л K₂HPO₄.

В процессе периодической ферментации с подпиткой растворы источников углерода, азота и фосфора, иногда называемые в данном описании также как «подаваемый материал», размещены каждый во внешнем резервуаре, соединенном с реактором ферментера. Источник углерода, называемый в настоящем описании как «сукцинат в качестве источника углерода», представляет собой водный раствор янтарной кислоты и динатрия сукцината; неорганическое соединение в качестве источника азота предпочтительно представляет собой водный раствор NH₄Cl; и источник фосфора представляет собой водный раствор KH₂PO₄ и K₂HPO₄^*3H₂O.

Уровни углерода контролируют в течение всего процесса ферментации, и когда уровень янтарной кислоты в среде доходит до определенного порогового уровня, например, 1-2 г/л, янтарную кислоту добавляют (перекачивают из) в ферментер из внешнего резервуара.

Уровни фосфора контролируют в течение всего процесса ферментации, и свежий источник фосфора добавляют по мере необходимости. В некоторых вариантах реализации, свежий раствор фосфата перекачивают из внешнего резервуара в ферментер уже через 16 часов после начала ферментации, а затем дополнительно добавляют каждые 24 часа.

Уровни аммиака контролируют в течение всего процесса ферментации, и свежий источник азота добавляют по мере необходимости. В некоторых вариантах реализации, свежий раствор аммиака (NH₄Cl 5H) перекачивают из внешнего резервуара в ферментер уже через 16 часов после начала ферментации, а затем дополнительно добавляют каждые 12 часов.

Объем исходных материалов следует свести к минимуму, насколько это возможно, чтобы раствор сукцината мог быть добавлен для продления хода ферментации при необходимости. В начале ферментации, поскольку pH возрастает до 8,6, применяют серную кислоту для поддержания pH=7. В процессе ферментации добавляют раствор NaOH для поддержания pH=7. В течение всего процесса проверяют количество янтарной кислоты, и когда уровень достигает 1-2 г/л, из внешнего резервуара должна быть добавлена янтарная кислота (вместо серной кислоты).

Ферментационную среду в ферментере готовят следующим образом: образование в реакторе ферментера исходной ферментационной среды путем приготовления раствора (далее в описании «Раствор 4») посредством добавления к водному раствору лимонной кислоты, CaCl₂*2H₂O, MgSO₄*7H₂O и цитрата FeNH₄ (далее в описании «Раствор 7»), водного раствора янтарной кислоты, Na₂SO₄, K₂CO₃ и дрожжевого экстракта (далее в описании «Раствор 2»), с последующим добавлением NaCl, перемешиванием и добавлением раствора NH₄Cl (далее в описании «Раствор 3») и доведением pH до 5 с помощью 10H NaOH, затем следует добавление к Раствору 4 водного раствора антивспенивающего агента, закрывание ферментера и стерилизация в автоклаве (121°C, 20 мин), и далее следует добавление к стерильной среде водного раствора микроэлементов CoCl₂*6H₂O, NiCl₂*6H₂O, CuCl₂*2H₂O, MnCl₂*4H₂O, ZnSO₄*7H₂O, Na₂MoO₄*2H₂O, H₃BO₃ и KI, с последующим добавлением водного раствора фосфатных солей KH₂PO₄, K₂HPO₄^*3H₂O. Инокулят Rhodovulum sulfidophilum добавляют к данной исходной ферментационной среде в ферментере, и в процессе ферментации свежие количества сукцината в качестве источника углерода, хлорида аммония в качестве источника азота и источник фосфата добавляют к ферментационной среде по мере необходимости.

Температура в ферментере перед добавлением инокулята Rhodovulum sulfidophilum должна быть примерно 28°C и pH=7 (регулируется с помощью NaOH и раствора сукцината по мере необходимости).

В течение ферментации следует поддерживать хорошее перемешивание и аэрацию, а также следует контролировать температуру, pH, уровень кислорода и подачу азота, углерода и фосфора. Температуру следует поддерживать на уровне минимум 25°C и максимум 31°C, а контрольные пределы pH представляют собой 6.8 и 7.3.

Очень важно поддерживать кислород на уровне 10%или ниже спустя 10-20 часов ферментации. Высокая концентрация кислорода ускоряет рост бактерий, но при этом они не продуцируют бактериохлорофилл а, в то время как концентрация кислорода 10% ускоряет образование бактериохлорофилла а.

Ферментацию продолжают до тех пор, пока объем ферментационной среды в реакторе не увеличится до примерно полного объема реактора.

Как только ферментация завершена бульон центрифугируют, надосадочную жидкость отбрасывают, клетки лиофилизируют и Bchla извлекают из высушенных клеток. Bchla может быть очищен и использован для химического получения производных бактериохлорофилла, представляющих интерес.

Настоящее изобретение далее будет проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами.

ПРИМЕРЫ

Материал и методы

Rhodovulum sulfidophilum (Штамм DSM 1374) был получен из Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ), Брауншвейг, Германия.

Ферментер BioFlo IV на 20 л компании New Brunswick Scientific (США).

Янтарная кислота, динатрия сукцинат*6H₂O, NH₄Cl, цитрат FeNH₄/лимонная кислота, K₂HPO₄, MgCl₂ CoCl₂*6H₂O, NiCl₂*6H₂O, CuCl₂*2H₂O, MnCl₂*4H₂O, ZnSO₄*7H₂O и KI были приобретены у Acros Organics (Гел, Бельгия); KH₂PO₄, Na₂SO₄, KCl, CaCl₂*2H₂O, K₂CO₃, NaHCO₃ MgSO₄*7H₂O и NaCl были приобретены у Fisher (Fisher Scientific, Лафборо, Великобритания); казеиновый пептон и гидролизат казеина были приобретены у Difco (Лоуренс, Канзас, США); дрожжевой экстракт был приобретен у Difco и Bio Springer (Монреаль, Квебек, Канада); NH₄Cl был приобретен у Fluka (Sigma-Aldrich, Реховот, Израиль); KH₂PO₄ был приобретен у Merck (Merck KGaA, Дармштадт, Германия); KOH, H₃BO₃, антивспениватель Y-30 и Na₂MoO₄*2H₂O были приобретен у Sigma (Sigma-Aldrich, Реховот, Израиль).

Пример 1. Подготовка рабочего банка клеток из бактерий Rhodovulum sulfidophilum

Бактерии Rhodovulum sulfidophilum (Штамм DSM 1374) высевали на чашки Петри, предварительно покрытые субстратом, содержащим агар, смешанный с водной средой, приготовленной из следующих ингредиентов: янтарная кислота (9 г), Na₂SO₄ (3 г), KCl (750 мг), CaCl₂ (750 мг), NaHCO₃ (300 мг), цитрат FeNH₄ (150 мг), дрожжевой экстракт (3 г), казеиновый пептон (1,5 г), гидролизат казеина (1,5 г), MgCl₂ (7,5 г), NaCl (30 г), деионизированная вода (1500 мл).

Значение pH среды доводили до 7 с помощью NaOH 10H и HCl 1M. Агар добавляли к среде (7,5 г агара на 500 мл среды), чтобы получить ростовой субстрат. Чашки Петри, покрытые ростовым субстратом, стерилизовали в автоклаве (121°C, 30 мин), и высевали бактерии на субстрат.

После инкубации при 30°C в течение трех дней, инокулят бактерий переносили в колбу Эрленмейера на 250 мл и выращивали в инокуляционной среде, в которой казеиновый пептон как органический источник азота (используемый для роста бактерий в чашках Петри) заменяли на хлорид аммония в качестве неорганического источника. Бактерии выращивали, пока оптическая плотность (OD 540 нм) культуры не достигла значения выше 10. Аликвоты источника инокулята по восемь мл переносили в стерильные криогенные пробирки для замораживания на 15 мл, добавляли 2 мл 50% стерильного раствора глицерина и пробирки хранили при -80°C до использования.

Пример 2. Растворы для ферментационной среды и их подготовка

Готовили следующие растворы:

Раствор 1. Следующие ингредиенты добавляли в нижеуказанном порядке и растворяли в 4,5 л деионизированной воды в реакторе ферментера:

Раствор 2. Следующие ингредиенты добавляли в нижеуказанном порядке и растворяли в 400 мл теплой воды, и объем доводили деионизированной водой до 0,5 л:

Раствор 3. Хлорид аммония 5H - NH₄Cl (примерно 268 г) растворяли в 900 мл воды, и объем доводили до 1 л. 80 мл образца переносили в бутылку объемом 100 мл для добавления в ферментер в виде Раствора 3, а остаток переносили в бутылку объемом 1 л, помеченную как Раствор 3, для применения в качестве резервного источника азота в процессе ферментации. Обе бутылки стерилизовали в автоклаве (121°C, 20 мин).

Раствор 4 получали в ферментере посредством добавления 450 мл Раствора 2 к 4,5 л Раствора 1, уже находящемуся в реакторе ферментера, с последующим добавлением 170 г NaCl и перемешиванием, а затем добавлением 80 мл Раствора 3 (NH₄Cl 5H, 1 г NH₄⁺ в литре среды). Значение pH доводили до 5 с помощью 10 H NaOH.

Раствор 5, раствор микроэлементов (TES), содержащий следующие ингредиенты: CoCl₂*6H₂O (примерно 50 мг), NiCl₂*6H₂O (примерно 50 мг), CuCl₂*2H₂O (примерно 100 мг), MnCl₂*4H₂O (примерно 150 мг), ZnSO₄*7H₂O (примерно 200 мг), H₃BO₃ (примерно 1000 мг), Na₂MoO₄*2H₂O) (примерно 50 мг), и KI (примерно 500 мг) в 0,5 л воды. Аликвоты Раствора 5 по 35 мл переносили в бутылки объемом 100 мл и стерилизовали в автоклаве (121°C, 20 мин).

Раствор 6, раствор фосфатных солей, готовили растворением 30 г KH₂PO₄ и 5 г K₂HPO₄ в 250 мл деионизированной воды. Значение pH доводили до 7 с помощью раствора 10H KOH. Аликвоту 55 мл переносили в бутылку объемом 100 мл и помечали как Раствор 6 для добавления в ферментер. Остальную часть переносили в бутылку объемом 500 мл и помечали как Раствор 6 для применения в качестве резервного источника фосфора в процессе ферментации. Обе бутылки стерилизовали в автоклаве (121°C, 20 мин).

Раствор 7, антивспенивающий раствор, готовили путем добавления примерно 25 мг антивспенивателя на основе кремния Y-30 к деионизированной воде до конечного объема 250 мл, с последующей стерилизацией в автоклаве (121°C, 20 мин), или путем добавления антивспенивателя Biospumex таким образом, что его концентрация в основной ферментационной среде составляла от 0,2 до 0,5 мл/л. Как правило, количество антивспенивателя, вводимого в ферментер, зависит от количества пены, образованной в среде.

Раствор 8, раствор сукцината, выступающий в качестве источника углерода, а также адаптер pH, получали растворением 250 г динатрия сукцината в 4 л деионизированной воды, добавлением 450 г янтарной кислоты, нагреванием до его растворения, и затем добавлением деионизированной воды до конечного объема 5 л, с последующей стерилизацией раствора в автоклаве (121°C, 20 мин).

Раствор 9, NaOH 10H, готовили поместив 250 мл деионизированной воды в бутылку объемом 500 мл, стерилизовали в автоклаве (121°C, 20 мин), добавляли 100 г NaOH к охлажденной бутылке и перемешивали.

Пример 3. Периодическая ферментация с подпиткой для получения Bchla

pH-электрод калибровали и подключали к реактору ферментера. Электрод РК (растворенного кислорода) подключали к реактору. К Раствору 4 добавляли два мл антивспенивателя при pH=5 в реактор ферментера непосредственно перед его закрыванием, и стерилизацию устанавливали на цикл 25 минут.

Исходная ферментационная среда содержала следующие ингредиенты:

Данную среду готовили в несколько этапов, при этом исходную ферментационную среду сначала получали в биореакторе, и другие ингредиенты добавляли после начала процесса ферментации из подаваемых растворов во внешних резервуарах, соединенных с биореактором, а затем непрерывно в процессе ферментации согласно онлайн мониторингу уровней питательных веществ в ростовой среде. Подаваемый раствор фосфора содержал KH₂PO₄ (12,0-14,5 г/л) и K₂HPO₄ (1,0-3,0 г/л), подаваемый раствор углерода содержал янтарную кислоту (80,0-100,0 г/л) и динатрия сукцинат (40,0-60,0 г/л), и подаваемый раствор азота содержал 200-300 г/л NH₄Cl. Значение pH всех перечисленных выше растворов доводили до 7,0.

Для инициации ферментации, 35 мл стерильного раствора TES (раствор 5) добавляли в ферментер, уже содержащий стерилизованный раствор 4. Затем 55 мл стерильного фосфатного раствора (раствор 6) добавляли при перемешивании (500 оборотов в минуту) и скорости аэрации 1 VVM (8 л/мин), и температуру в ферментере устанавливали на 28°C.

Подаваемый раствор углерода (сукцинат раствор 8) подсоединяли к питающим насосам, с последующим присоединением раствора 7 (раствор антивспенивателя) к питающим насосам. Значение pH ростовой среды доводили до pH 7 с помощью стерильного раствора NaOH 10H (раствор 9) и стерильного раствора сукцината по мере необходимости. Электрод РК (растворенного кислорода) калибровали.

Инокулят бактерий добавляли в ферментер с помощью питающего насоса. Концентрация клеток составляла 2,3-3,2 OD/л. Наконец, фосфатный раствор (раствор 6) и раствор хлорида аммония (раствор 3) подсоединяли к питающим насосам.

В процессе периодической ферментации с подпиткой температуру поддерживали на уровне минимум 25°C и максимум 31°C, и уровень кислорода поддерживали на уровне 10% или ниже. Значение pH поддерживали между минимум 6,8 и максимум 7,3. Раствор сукцината добавляли при увеличении pH до 7,1. NaOH 10H (раствор 9) добавляли при снижении pH до 6,8.

Спустя 16 часов ферментации возобновляли подачу азота и подачу фосфора в ростовую среду путем закачивания в ферментер 80 мл раствора 3 (NH₄Cl 5H) и 20 мл раствора 6 (фосфатный раствор) с помощью перистальтического насоса (скорость насоса 1 мл/мин). Затем 90 мл NH₄Cl добавляли каждые 12 часов, и 20 мл фосфата добавляли (перекачивали в) каждые 24 часа. Уровни аммиака и фосфора наблюдали в процессе ферментации, и добавление растворов 3 и 6 зависело от результатов анализа данного мониторинга.

Подачу углерода возобновляли путем добавления янтарной кислоты (раствор 8) всякий раз, когда уровень янтарной кислоты в ростовой среде снижался до 1-2 г/л. Уровень кислорода поддерживали на уровне 10% или ниже, после примерно 10-20 часов ферментации. Данный уровень кислорода ускоряет продуцирование бактериохлорофилла.

Исходный объем ростовой среды составлял примерно половину объема биореактора. Ферментация продолжалась в течение 120 часов, а объем увеличивался до примерно полного объема биореактора.

Пример 4. Экстракция бактериохлорофилла a

После завершения ферментации бактерии извлекали посредством центрифугирования при 4500 оборотов в минуту в течение 15 минут, а супернатант культуры удаляли. Осажденные клетки лиофилизировали. Bchla экстрагировали из сухих (лиофилизированных) клеток с помощью метанола. Выход Bchla составил 0,15-0,3 г/л.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ периодической ферментации с подпиткой для получения бактериохлорофилла а (Bchla). Способ предусматривает культивирование клеток штамма DSM 1374 Rhodovulum sulfidophilum в ростовой среде, содержащей лимонную кислоту, CaCl₂*2Н₂O, MgSO₄*7H₂O, цитрат FeNH₄, янтарную кислоту, динатрия сукцинат*6H₂O, Na₂SO₄, K₂CO₃, дрожжевой экстракт, NH₄Cl, KH₂PO₄, K₂HPO₄*3Н₂О, NaCl, NaOH, KOH, антивспенивающий агент и микроэлементы. В процессе ферментации осуществляют подачу водного раствора янтарной кислоты и динатрия сукцината, водного раствора NH₄Cl, КН₂РО_4, K₂HPO₄*3Н₂О из внешних резервуаров, соединенных с реактором ферментера, и поддержание уровня кислорода на уровне 10% или ниже. После завершения ферментации Bchla извлекают из выделенных клеток. Изобретение обеспечивает увеличение выхода целевого продукта. 4 з.п. ф-лы, 4 пр.

1. Способ периодической ферментации с подпиткой для получения бактериохлорофилла a (Bchla) из штамма DSM 1374 Rhodovulum sulfidophilum, причем указанный способ включает:

(i) культивирование клеток штамма DSM 1374 Rhodovulum sulfidophilum в реакторе ферментера при температуре от 25 до 31°C и pH от 6,8 до 7,3 в ростовой среде, содержащей лимонную кислоту, CaCl₂*2Н₂O, MgSO₄*7H₂O, цитрат FeNH₄, янтарную кислоту, динатрия сукцинат*6H₂O, Na₂SO₄, K₂CO₃, дрожжевой экстракт, NH₄Cl, KH₂PO₄, K₂HPO₄*3Н₂О, NaCl, NaOH, KOH, антивспенивающий агент и микроэлементы;

(ii) подачу культуры на периодическую ферментацию с подпиткой одновременно с подачей в среду водного раствора янтарной кислоты и динатрия сукцината в качестве источника углерода, водного раствора NH₄Cl в качестве источника азота и водного раствора КН₂РО₄ и K₂HPO₄*3Н₂О в качестве источника фосфора из внешних резервуаров, соединенных с реактором ферментера, и поддержание уровня кислорода на уровне 10% или ниже;

(iii) выделение клеток из среды и

(iv) выделение и восстановление Bchla из клеток из стадии (iii).

2. Способ ферментации по п. 1, отличающийся тем, что приготовление указанной ростовой среды включает следующие стадии:

(а) образование в реакторе ферментера исходной ферментационной среды путем приготовления раствора для культивирования посредством добавления к водному раствору лимонной кислоты, CaCl₂*2H₂О, MgSO₄*7H₂О и цитрата FeNH₄, водного раствора янтарной кислоты, Na₂SO₄, K₂CO₃ и дрожжевого экстракта с последующим добавлением NaCl, перемешиванием и добавлением раствора NH₄Cl, и доведение pH до 5 с помощью 10Н NaOH с последующим добавлением к указанному раствору для культивирования водного раствора антивспенивающего агента, закрытие ферментера и стерилизация путем автоклавирования и далее добавление к стерильной среде водного раствора микроэлементов CoCl₂*6H₂O, NiCl₂*6H₂O, CuCl₂*2H₂O, MnCl₂*4H₂O, ZnSO₄*7H₂O, Na₂MoO₄*2H₂O, H₃BO₃ и KI с последующим добавлением водного раствора фосфатных солей KH₂PO₄ и K₂HPO₄*3H₂O;

(b) после добавления инокулята штамма DSM 1374 Rhodovulum sulfidophilum к исходной ферментационной среде (а) следует дополнительно обеспечение в процессе ферментации водного раствора янтарной кислоты и динатрия сукцината в качестве источника углерода, водного раствора NH₄Cl в качестве источника азота и водного раствора KH₂PO₄ и K₂HPO₄*3Н₂О в качестве источника фосфата в ферментационной среде по мере необходимости.

3. Способ ферментации по п. 2, включающий следующие этапы:

(i) образование раствора для культивирования в реакторе ферментера и доведение pH до 5 с помощью NaOH;

(ii) калибровка pH-электрода и подключение указанного pH-электрода и электрода РК (растворенного кислорода) к реактору ферментера;

(iii) добавление к указанному раствору для культивирования водного раствора антивспенивающего агента;

(iv) закрытие ферментера и стерилизация среды путем автоклавирования;

(v) добавление к стерильной среде водного раствора микроэлементов СоС1₂*6Н₂О, NiCl₂*6H₂O, CuCl₂*2H₂O, MnCl₂*4H₂O, ZnSO₄*7H₂O, Na₂MoO₄*2H₂O, H₃BO₃ и KI с последующим добавлением водного раствора фосфатных солей KH₂PO₄ и K₂HPO₄*3Н₂О;

(vi) присоединение при перемешивании и аэрации раствора сукцината и раствора антивспенивателя к питающим насосам;

(vii) установление в ферментере температуры 28°C и доведение pH до 7 с помощью NaOH и раствора сукцината по мере необходимости;

(viii) добавление в ферментер инокулята Rhodovulum sulfidophilum штамма DSM 1374;

(ix) присоединение водного раствора фосфатных солей KH₂PO₄ и K₂HPO₄*3Н₂О и раствора хлорида аммония к питающим насосам;

(x) переход к ферментации при контроле температуры, pH, уровня кислорода и подачи азота, углерода и фосфора и

(xi) продолжение ферментации до тех пор, пока объем ферментационной среды в реакторе не увеличится до полного объема реактора.

4. Способ ферментации по п. 3, отличающийся тем, что на стадии (х) температуру поддерживают на уровне минимум 25°C и максимум 31°C; контрольные пределы pH представляют собой 6,8 и 7,3; уровень кислорода составляет 10% или ниже спустя 10-20 часов ферментации; и растворы сукцината в качестве источника углерода, хлорида аммония и источника фосфата добавляют из внешних резервуаров по мере необходимости.

5. Способ ферментации по п. 4, отличающийся тем, что раствор хлорида аммония перекачивают спустя 16 часов ферментации и затем каждые 12 часов, а раствор фосфата перекачивают спустя 16 часов ферментации и затем каждые 24 часа.