СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ОСТЕОПОНТИНА ИЗ МОЛОКА Российский патент 2005 года по МПК A23J1/20 A23C23/00 C07K14/47 C07K14/52 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к новому способу выделения остеопонтина из молока.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Остеопонтин (ОПН) представляет собой секретируемый адгезивный гликофосфопротеин, первоначально выделенный из коллагенового внеклеточного матрикса минерализованной кости (Fransen A., Heinegard D. 1985. Isolation and characterization of two sialoproteins present only in bone calcified matrix. Biochem. J. 232:715-724). В последние годы было показано, что остеопонтин экспрессируется несколькими различными типами клеток, включая остеобласты, артериальные гладкомышечные клетки, лейкоциты, несколько типов эпителиальных клеток и трансформированные клетки различных линий (Denhardt D.Т., Butler W.Т., Chambers A.F., Senger D.R. (eds.). 1995. Osteopontin: role in cell signalling and adhesion. Ann. N.Y. Acad. Sci., 760). Соответственно, ОПН обнаруживали во многих тканях, включая почку, плаценту, секреторный эпителий и ганглии внутреннего уха, а также в гладкой мышце сосудистой системы (Butler W.Т., Ridall A.L, МсКее М.D. 1996. Osteopontin. In Bilezekian J.P., Rai L.G., Rodan G.A. (eds.). Principles of bone biology. Academic Press, San Diego, CA, USA, pp.167-181). Кроме того, ОПН присутствует также во многих текучих средах организма, главным образом в плазме, моче, желчи и молоке, и проявляет повышенную экспрессивность во многих трансформированных клетках (Senger D.R., Peruzzi С.A., Gracey С.F., Papadopoulos A., Tenen D.G. 1988. Secreted phosphoproteins associated with neoplastic transformation: close homology with plasma proteins cleaved during blood coagulation. Cancer Res. 48:5770-5774). Остеопонтин представляет собой высококислое вещество, аминокислотный компонент которого приблизительно на 25% состоит из аспартат/аспаргиновой кислоты и глутамат/глутаминовой кислоты, а также из значительного числа фосфорилированных аминокислот (Sorensen E.S., Petersen Т.Е. 1994. Identification of two phosphorylation motifs in bovine osteopontin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 198:200-205; Sorensen E.S., Hojrup P., Petersen T.E. 1995. Posttranslational modifications of bovine osteopontin: Identification of twenty-eight phosphorylation and three O-glycosylation sites. Protein Sci. 4:2040-2049).

Остеопонтин содержит последовательность RGD (аргинин, глицин, аспартат), связывающую интегрин, и может промотировать присоединение клеток к различным поверхностям, например присоединение остеобластов к кости во время ее реконструкции. В дополнение к способности осуществлять присоединение клеток остеопонтин может действовать как цитокин. Другие предполагаемые применения или функции остеопонтина включают в себя хемотаксис и ингибирование экспрессии NO-синтазы.

Таким образом, было предложено применять остеопонтин в качестве фармацевтического агента. Европейский патент №705842 предлагает применение остеопонтина в диагностике, профилактике и терапии остеоартрита и ревматоидного артрита. Считается также, что остеопонтин может играть определенную роль в стимулировании роста кости и лечении ран у млекопитающих, см., например, документы ЕР 942452 и WO 9933415. Далее предлагалось использовать остеопонтин для ингибирования оксида азота, см. патентный документ US 5695761. Предполагалось также применение остеопонтина для солюбилизации ионов двухвалентных металлов с целью добавления в пищевые продукты, см. реферат документа JP 9173018.

Остеопонтин выделяли в количествах, соответствующих исследовательскому масштабу (в масштабе от микрограмм до нескольких миллиграмм), из некоторых тканей и текучих сред, включая минерализованную кость. Однако существует огромная потребность в остеопонтине как для экспериментального, так и для промышленного применения Все известные способы выделения остеопонтина сводятся к экспериментальному масштабу, дающему количества, слишком маленькие для промышленного применения.

В публикации Sorensen E.S., Petersen Т.Е. 1993. Journal of Dairy Research 60, 189-197. Purification and characterization of three proteins isolated from the proteose peptone fraction of bovine milk описан способ, включающий в себя осаждение протеинов посредством ТХК (трихлоруксусной кислоты). Указанный способ несовместим с производством пищевых ингредиентов, т.к. наличие ТХК в продуктах питания не допускается. Кроме того, способ включает в себя гель-фильтрацию, которая непригодна для крупномасштабного производства.

В публикации Bayless К.J., Davis G.E., Meininger G.А. 1997. Protein Expression and Purification 9, 309-314. Isolation and biological properties of osteopontin from bovine milk описан способ, включающий в себя ионный обмен и два этапа гидрофобной хроматографии на фенилсефарозных колонках. Сложность способа и в особенности гидрофобная хроматография делают способ непригодным для крупномасштабной очистки остеопонтина.

В публикации Senger D.R., Peruzzi С.A., Papadopoulos A., Tenen D.G. 1989. Biochimica et Biophysica Acta 996, 43-48. Purification of a human milk protein closely similar to tumor-secreted phosphoproteins and osteopontin предлагается способ очистки. Указанный способ, описанный применительно к женскому молоку, включает в себя использование сродства с цитратом бария, а также ЖХВР (жидкостную хроматографию высокого разрешения) с обращенной фазой, что делает его непригодным для крупномасштабной очистки.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение решает указанные выше проблемы. В рамках изобретения предложен способ крупномасштабной очистки или выделения остеопонтина из коровьего молока (и молока других домашних млекопитающих, производящих молоко, например, коз, овец, буйволов, лам, верблюдов и т.д.). Молочный остеопонтин особо предпочтителен, поскольку он естественным образом присутствует в молоке домашних животных. Согласно изобретению остеопонтин выделяют с помощью технологических приемов, одобренных для производства молочных пищевых продуктов. Поэтому такой остеопонтин пищевого качества без какого-либо риска можно применять в виде ингредиента в продуктах питания, предназначенных для потребления человеком.

Настоящее изобретение предлагает способ выделения остеопонтина из молочного материала, характеризующийся тем, что молочный материал, содержащий остеопонтин, и материал, содержащий кальций, смешивают друг с другом, а рН регулируют таким образом, чтобы удержать остеопонтин в растворе во время осаждения других составляющих молока или чтобы агрегировать или связать остеопонтин во время удаления других растворимых составляющих.

Способ можно осуществлять в один или несколько этапов. Можно также комбинировать этапы удержания остеопонтина в растворе и его связывания или агрегирования.

В способе согласно изобретению предпочтителен сырьевой материал на основе молока, содержащего остеопонтин. Хорошим сырьевым материалом является сыворотка, т.к. содержавшиеся в ней казеиновые протеины уже удалены. Особо пригодна сыворотка, получающаяся при химическом подкислении молока, поскольку ее остеопонтин находится в нетронутом состоянии. С другой стороны, остеопонтин, содержавшийся в творожистой сыворотке, может быть частично гидролизованным. Однако до сих пор не ясно, ухудшаются ли при этом или полностью пропадают свойства остеопонтина.

Отделение остеопонтина от денатурированного или осажденного протеина можно осуществить посредством микрофильтрации или центрифугирования, как это обычно осуществляется в молочной промышленности.

Размер пор может лежать в интервале 0,1-1,4 мкм. Особенно подходящими являются керамические фильтры, обладающие механической стабильностью и долгим сроком службы. Сепарация может осуществляться при температурах от 10°С до 80°С. Наиболее предпочтителен интервал 50-55°С, обеспечивающий очень высокую производительность и стабильные бактериологические условия.

Можно применять все типы анионного обмена. В данном случае применяют быстротечный обменник DEAE Sepharose. Во время ионного обмена рН можно изменять от приблизительно 3 до приблизительно 6.

Этапы, включающие (А) растворение или солюбилизацию остеопонтина или (Б) его агрегацию или связывание, можно скомбинировать в одном процессе. Для осуществления концентрирования, разделения, сушки или проведения прочих процессов, обычно применяемых в молочной промышленности, потоки продуктов можно обрабатывать различными способами до и/или после указанных этапов. Таким образом можно применять, например, микрофильтрацию. Подходящий фильтр легко может быть выбран специалистами в данной области, см., например, справочник "Dairy processing Handbook" (1995) фирмы Tetra Paks, pp.123-132.

Обычно, чтобы уменьшить количество обрабатываемой воды, до начала осуществления процесса по изобретению сыворотку предпочтительно сконцентрировать. Для ее предварительной концентрации можно применить любую обычную ультрафильтрационную систему: пластинчатую и рамную, полое волокно, трубу, керамику и спираль и т.д. С экономической точки зрения в настоящее время наиболее подходящими для этого являются спиральные системы. Пригодна любая мембрана, не пропускающая через себя остеопонтин. Размер пор таких мембран составляет 20000 Д или менее. К пригодным мембранам относятся, например, мембраны марки Koch HFK 131, Desal PW или другие мембраны, подобные указанным.

Источником растворимого кальция (Са) может быть любое растворимое соединение кальция, такое как гидроксид кальция, хлорид кальция или ацетат кальция. Можно использовать также нитрит кальция и нитрат кальция, но в случае применения остеопонтина в пищевой промышленности этот вариант обычно не рекомендуется.

Для агрегирования или связывания с нерастворимым источником Са можно применять Са₃РО₄ или какой-либо другой источник нерастворимого Са. Для осаждения фосфата кальция или какой-либо другой нерастворимой соли совместно с остеопонтином регулирование рН можно осуществлять в интервале 6,0-8,5. Наиболее рекомендуемым представляется интервал рН 6,5-8,0. Особенно эффективно значение рН, составляющее приблизительно 7,0. В качестве агента, регулирующего рН в этом процессе, можно применить любое основание как органическое, так и неорганическое. Особо пригодными основаниями являются NaOH, КОН, Са(ОН)₂, в особенности NaOH.

Для удержания остеопонтина в растворе рН регулируют в интервале 3,5-5,0, предпочтительно 4,0-4,6. Наиболее предпочтительна величина рН 4,2. Для такого регулирования можно применять любую органическую или неорганическую кислоту. Особенно пригодна соляная кислота, поскольку она относится к сильным кислотам и обладает приемлемой стоимостью. Если исходный молочный материал, содержащий остеопонтин, содержит к тому же природный кальций из молока, кальций добавляют в меньшем количестве или не добавляют вообще. Кроме того, применение Ca(OH)₂ для регулирования рН позволяет свести к минимуму количество Са из другого источника. Обычно пригодное количество кальция будет обеспечено в том случае, когда его концентрация в растворе составляет 0,2%. Здесь нет нижнего предела, но количество менее 0,05% от процентного содержания протеинов проявится в понижении выхода остеопонтина. Эффективным было бы количество кальция, равное 0,1%, но при этом, по сравнению с вариантом, применяющим 0,2% кальция, выход остеопонтина понижается. Проводили испытания для концентраций кальция, доходящих до 0,4%. Однако для концентраций выше 0,2% получили лишь небольшое увеличение выхода. Поэтому предпочтительной является величина 0,2%, но можно было применять также и 0,3%.

Отделение осажденного фосфата кальция или какого-либо другого твердого источника Са, содержащих остеопонтин, из остальной части можно провести любым обычным способом, таким как микрофильтрация или центрифугирование. Размер пор может составлять 0,1-1,4 мкм. Особенно подходящими являются керамические фильтры, обладающие механической стабильностью и долгим сроком службы. Сепарация может осуществляться при температурах от 10°С до 80°С. Особенно хорошо подходит интервал 50-55°С, обеспечивающий очень высокую производительность и стабильные бактериологические условия.

Для отделения остеопонтина от растворенной кальциевой соли можно применять любую ультрафильтрационную систему: пластинчатую и рамную, полое волокно, трубу, керамику и спираль и т.д. С экономической точки зрения особенно подходящими являются спиральные системы. Можно применять любую мембрану, не пропускающую через себя остеопонтин. Номинальный размер пор таких мембран составляет обычно 20000 Д или менее. К пригодным мембранам относятся, например, марки Koch HFK 328, Desal PW или другие мембраны, подобные указанным. Можно применять все типы анионных ионообменников. В данном случае применяют быстротечный ионообменник DEAE Sepharose.

В течение ионного обмена рН можно изменять от приблизительно 3 до приблизительно 6.

Посредством микробной фильтрации сывороточного протеинового концентрата, СПК, оставшегося перед доведением рН до 7,0 с целью осаждения Са₃(PO₄)₂ или какой-либо другой твердой фазы с остеопонтином, производят более чистый агрегат, который соответственно дает более чистый продукт для дальнейшей обработки в ходе обсуждаемых процессов и, таким образом, более чистые продукты остеопонтина.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следующие далее примеры преследуют только иллюстративные цели и не ограничивают настоящее изобретение.

Пример 1

1000 кг Казеиновой сыворотки с рН 4,55, содержащей 0,53% протеина, приблизительно 20 м.д. (0,002%) остеопонтина и 4,50% сухого вещества, сконцентрировали в спиральной ультрафильтрационной установке, мембраны которой имели такой номинальный размер пор, чтобы протеины не проходили через мембрану. Характерный номинальный размер пор составлял 10000 Д. Температура во время фильтрации равнялась 50°С, а среднее давление составляло 3,5×10⁵ Па. Концентрирование осуществляли до момента удаления 900 кг фильтрата, не содержащего остеопонтин. Во время концентрирования средняя скорость течения составляла 45,6 л/м²/час. Осталось 100 кг остатка с рН 4,55, содержащего 3,86% протеина, приблизительно 200 м.д. (0,02%) остеопонтина и 10,3% сухого вещества.

100 кг Остатка пастеризовали при 68°С в течение 15 с и охладили до 50°С. После этого посредством 6% NaOH довели рН до 7,0.

После отстаивания в течение 2 час провели микрофильтрацию на керамических мембранах с размером пор 1,4 мкм при 50°С и среднем давлении 4,0×10⁵ Па. Диафильтрацию осуществляли при рН, доведенном до 7,0, с горячей (50°С) деминерализованной водой до тех пор, пока проводимость в фильтрате не оказалась ниже 100 мкСм (микросименс). Во время всего процесса фильтрации средняя скорость течения составляла 310 л/м²/час.

20,0 кг Остатка микрофильтрации с рН 7,0, содержащего 0,58% протеина, приблизительно 1000 м.д. (0,1%) остеопонтина и 4,1% сухого вещества, собрали и охладили до 8°С ледяной водой. Остаток высушили распылением в колончатой (шахтной) сушилке NIRO и получили 0,7 кг порошка, содержащего 13,6% протеина, приблизительно 2,3% остеопонтина и 96,4% сухого вещества. Сухое вещество состоит из 80% золы, 27% кальция и 13,8% фосфора.

Пример 2

2000 кг Казеиновой сыворотки с рН 4,55, содержащей 0,55% протеина, приблизительно 20 м.д. (0,002%) остеопонтина и 4,53% сухого вещества, сконцентрировали в спиральной ультрафильтрационной установке, мембраны которой имели такой номинальный размер пор, чтобы протеины не проходили через мембрану. Характерный номинальный размер пор составлял 10000 Д. Температура во время фильтрации равнялась 12°С, а среднее давление составляло 3,5×10⁵ Па. Концентрацию проводили до момента удаления 1800 кг фильтрата, не содержащего остеопонтин. Во время концентрирования средняя скорость течения составляла 27,6 л/м²/час. Осталось 200 кг остатка с рН 4,55, содержащего 3,97% протеина, приблизительно 200 м.д. (0,02%) остеопонтина и 10,4% сухого вещества.

200 кг Остатка пастеризовали при 68°С в течение 15 с и охладили до 50°С. После этого посредством 6% NaOH довели рН до 7,0.

После отстаивания в течение 30 мин провели микрофильтрацию на керамических мембранах с размером пор 1,4 мкм и с площадью 0,2 м² при 50°С и среднем давлении 4,0×10⁵ Па. Диафильтрацию осуществляли при рН, доведенном до 7,0, с горячей (50°С) деминерализованной водой до тех пор, пока проводимость в фильтрате не оказалась ниже 100 мкСм. Во время всего процесса фильтрации средняя скорость течения составляла 310 л/м²/час. 20,0 кг Остатка микрофильтрации с рН 7,0, содержащего 1,25% протеина, приблизительно 2000 м.д. (0,2%) остеопонтина и 8,3% сухого вещества, собрали и охладили до 8°С ледяной водой.

Довели рН остатка до 3,0 посредством добавления 28% соляной кислоты, которая давала почти прозрачный раствор.

Указанный раствор подвергли ультрафильтрации при 10°С и среднем давлении 4,0×10⁵ Па на мембранах с отсекающей границей 5000 Д. Остаток подвергали диафильтрации с горячей деминерализованной водой до тех пор, пока проводимость в фильтрате не оказалась ниже 0,1 мкСм. Во время всего процесса фильтрации средняя скорость течения составляла 17,8 л/м²/час. Собрали 10 кг остатка, содержащего 2,42% протеина, приблизительно 4000 м.д. (0,4%) остеопонтина и 2,6% сухого вещества.

Остаток высушили распылением в колончатой сушилке NIRO и получили 0,2 кг порошка, содержащего 89,6% протеина, приблизительно 14,8% остеопонтина и 96,4% сухого вещества.

Пример 3

1000 кг Предварительно сконцентрированной казеиновой сыворотки с рН 4,55, содержащей 3,76% протеина, приблизительно 200 м.д. (0,02%) остеопонтина и 10,3% сухого вещества, пастеризовали при 67°С в течение 15 с и охладили до 50°С. После этого посредством 6% NaOH довели рН до 7,0.

После отстаивания в течение 60 мин провели микрофильтрацию на керамических мембранах с размером пор 1,4 мкм и с площадью 2,8 м² при 50°С и среднем давлении 4,0×10⁵ Па. Диафильтрацию осуществляли при рН, доведенном до 7,0, с горячей (50°С) деминерализованной водой до тех пор, пока проводимость в фильтрате не оказалась ниже 100 мкСм. Во время всего процесса фильтрации средняя скорость течения составляла 325 л/м²/час.

100 кг Остатка микрофильтрации с рН 7,0, содержащего 1,22% протеина, приблизительно 2000 м.д. (0,2%) остеопонтина и 8,3% сухого вещества, собрали и охладили до 5°С на пластинчатом теплообменнике.

Довели рН остатка до 3,0 посредством добавления 28% соляной кислоты, которая давала почти прозрачный раствор. Указанный раствор подвергли ультрафильтрации при 10°С и среднем давлении 4,0×10⁵ Па на мембране с отсекающей границей 5000 Д. Остаток подвергали диафильтрации с деминерализованной водой до тех пор, пока проводимость в фильтрате не оказалась ниже 100 мкСм. Затем проводили диафильтрацию с 0,45 М КН₂PO₄ с рН, равным 4,5, до тех пор, пока значение рН в остатке не достигло 4,5. Во время всего процесса фильтрации средняя скорость течения составляла 15,9 л/м²/час. Собрали 10 кг остатка, содержащего 12,1% протеина, приблизительно 20000 м.д. (2,0%) остеопонтина и 13,4% сухого вещества.

Остаток прокачали через колонку с анионным ионообменником, который был уравновешен с 0,45 М КН₂PO₄ с рН, равным 4,5. Таким образом, остеопонтин, в отличие от большей части других протеинов, в связанном состоянии остался в колонке. Колонку промывали с 0,45 М KH₂PO₄ с рН, равным 4,5, до тех пор, пока поглощение при 280 нм не оказалось равным 0.

Элюировали остеопонтин из анионного ионообменника с 0,7 М КН₂PO₄ с рН, равным 4,5, до тех пор, пока поглощение при 280 нм не оказалось равным 0. В результате собрали 50 л элюата, содержащего 500 г протеина, 40% которого составлял остеопонтин. Элюат сконцентрировали и с целью удаления солей подвергли диафильтрации на ультрафильтрационных мембранах с размером пор 5000 Д при 10°С и среднем давлении 4,0×10⁵ Па. Собрали 5 кг остатка, содержащего 10,7% сухого вещества, приблизительно 4% остеопонтина и 9,6% протеина. Остаток высушили распылением в колончатой сушилке NIRO и получили 0,5 кг порошка, содержащего 86,0% протеина, приблизительно 36% остеопонтина и 95,8% сухого вещества.

Пример 4

1000 кг Казеиновой сыворотки с рН 4,56, содержащей 0,52% протеина, приблизительно 20 м.д. (0,002%) остеопонтина и 4,50% сухого вещества, пастеризовали при 71°С в течение 15 с и охладили до 50°С. После этого посредством 6% NaOH довели рН до 7,0.

После отстаивания в течение 2 час провели микрофильтрацию на керамических мембранах с размером пор 1,4 мкм и с площадью 1,4 м² при 50°С и среднем давлении 4,0×10⁵ Па. Диафильтрацию проводили при рН, доведенном до 7,0, с 50°С горячей деминерализованной водой до тех пор, пока проводимость в фильтрате не оказалась ниже 100 мкСм. Во время всего процесса фильтрации средняя скорость течения составляла 520 л/м²/час.

30,0 кг Остатка микрофильтрации с рН 7,0, содержащего 0,78% протеина, приблизительно 670 м.д. остеопонтина (0,07%) и 16,1% сухого вещества, собрали и охладили до 8°С ледяной водой. Остаток высушили распылением в колончатой сушилке NIRO и получили 4,5 кг порошка, содержащего 4,7% протеина, приблизительно 0,4% остеопонтина и 96,4% сухого вещества. Сухое вещество состоит из 85% золы, 27% кальция и 13,8% фосфора.

Пример 5

5000 кг Казеиновой сыворотки с рН 4,56, содержащей 0,51% протеина, приблизительно 20 м.д. (0,002%) остеопонтина и 4,50% сухого вещества, пастеризовали при 69°С в течение 15 с и охладили до 50°С. После этого посредством добавления 6% NaOH довели рН до 7,0.

После отстаивания в течение 2 час провели микрофильтрацию на керамических мембранах с размером пор 1,4 мкм и с площадью 1,4 м² при 50°С и среднем давлении 4,0×10⁵ Па. Диафильтрацию осуществляли при рН, доведенном до 7,0, с горячей (50°С) деминерализованной водой до тех пор, пока проводимость в фильтрате не оказалась ниже 100 мкСм. Во время всего процесса фильтрации средняя скорость течения составляла 550 л/м²/час.

150 кг Остатка микрофильтрации с рН 7,0, содержащего 0,73% протеина, приблизительно 670 м.д. (0,07%) остеопонтина и 16,4% сухого вещества, собрали и охладили до 8°С ледяной водой.

Довели рН остатка до 3,0 посредством добавления 28% соляной кислоты, которая давала почти прозрачный раствор. Указанный раствор подвергли ультрафильтрации при 10°С и среднем давлении 4,0×10⁵ Па на мембране с отсекающей границей 10000 Д. Остаток подвергали диафильтрации с деминерализованной водой до тех пор, пока проводимость в фильтрате не оказалась ниже 100 мкСм. Во время всего процесса фильтрации средняя скорость течения составляла 25,3 л/м²/час. Собрали 10 кг остатка, содержащего 11,0% протеина, приблизительно 10000 м.д. (1,0%) остеопонтина и 12,6% сухого вещества.

Остаток высушили распылением в колончатой сушилке NIRO и получили 1,1 кг порошка, содержащего 83,8% протеина, приблизительно 7,6% остеопонтина и 96,2% сухого вещества.

Пример 6

10000 кг Казеиновой сыворотки с рН 4,56, содержащей 0,54% протеина, приблизительно 20 м.д. (0,002%) остеопонтина и 4,50% сухого вещества, пастеризовали при 69°С в течение 15 с и охладили до 50°С. После этого посредством 6% NaOH довели рН до 7,0.

После отстаивания в течение 2 час провели микрофильтрацию на керамических мембранах с размером пор 1,4 мкм и с площадью 2,8 м² при 50°С и среднем давлении 4,0×10⁵ Па. Диафильтрацию осуществляли при рН, доведенным до 7,0, с горячей (50°С) деминерализованной водой до тех пор, пока проводимость в фильтрате не оказалась ниже 100 мкСм. Во время всего процесса фильтрации средняя скорость течения составляла 570 л/м²/час.

300 кг Остатка микрофильтрации с рН 7,0, содержащего 0,76% протеина, приблизительно 670 м.д. (0,07%) остеопонтина и 16,3% сухого вещества, собрали и охладили до 8°С ледяной водой.

Довели рН остатка до 3,0 посредством 28% соляной кислоты, которая давала почти прозрачный раствор. Указанный раствор подвергли ультрафильтрации при 10°С и среднем давлении 4,0×10⁵ Па на мембране с отсекающей границей 10000 Д. Остаток подвергали диафильтрации с деминерализованной водой до тех пор, пока проводимость в фильтрате не оказалась ниже 100 мкСм. Во время всего процесса фильтрации средняя скорость течения составляла 24,6 л/м²/час. Собрали 20 кг остатка, содержащего 10,8% протеина, приблизительно 10000 м.д. (1,0%) остеопонтина и 12,3% сухого вещества.

Остаток прокачали через колонку с анионным ионообменником, который был уравновешен с 0,45 М КН₂PO₄ с рН, равным 4,5. Таким образом остеопонтин, в отличие от большей части других протеинов сыворотки, в связанном состоянии остался в колонке. Колонку промывали с 0,45 М КН₂PO₄ с рН, равным 4,5, до тех пор, пока поглощение при 280 нм не оказалось равным 0.

Элюировали остеопонтин из анионного ионообменника с 0,7 М КН₂PO₄ с рН, равным 4,5, до тех пор, пока поглощение при 280 нм не оказалось равным 0. В результате собрали 50 л элюата, содержащего 560 г протеина, 36% которого составлял остеопонтин. Элюат сконцентрировали и с целью удаления солей подвергли диафильтрации на ультрафильтрационных мембранах с размером пор 5000 Д при 10°С и среднем давлении 4,0×10⁵ Па. Собрали 5 кг остатка, содержащего 12,3% сухого вещества, приблизительно 4% остеопонтина и 11,2% протеина. Остаток высушили распылением в колончатой сушилке NIRO и получили 0,6 кг порошка, содержащего 87,6% протеина, приблизительно 31% остеопонтина и 96,2% сухого вещества.

Пример 7

10000 кг Казеиновой сыворотки с рН 4,53, содержащей 0,55% протеина, приблизительно 20 м.д. (0,002%) остеопонтина и 4,50% сухого вещества, подвергли ультра/диафильтрации в спиральной ультрафильтрационной установке, мембраны которой имели такой номинальный размер пор, чтобы протеины не проходили через мембрану. Характерный размер пор составлял 20000 Д. Температура во время фильтрации равнялась 15°С, а среднее давление составляло 3,5×10⁵ Па. Сразу же после окончания фильтрации собрали 152 кг остатка с рН 4,54, содержащего 23,1% протеина, приблизительно 1300 м.д. (0,13%) остеопонтина и 28,7% сухого вещества. Во время концентрирования средняя скорость течения составляла 25,6 л/м²/час. 152 кг Остатка разбавили 722 кг деминерализованной воды, чтобы содержание протеина составляло 4%. Посредством 6% NaOH довели рН до 7,4. Затем провели тепловую обработку при 85°С в течение 30 мин и охлаждение до 8°С. К прошедшему тепловую обработку остатку добавили 6,4 кг CaCl₂·2Н₂O и посредством 6% соляной кислоты довели рН до 4,2.

После отстаивания в течение по меньшей мере 2 час (или до следующего дня) провели нагрев до 50°С и осуществили микрофильтрацию на керамических мембранах с размером пор 0,8 мкм и с площадью 1,4 м² при 50°С и среднем давлении 4,0×10⁵ Па. Диафильтрацию осуществляли при рН, доведенном до 4,2, с горячей (50°С) деминерализованной водой до тех пор, пока проводимость в фильтрате не оказалась ниже 100 мкСм. Во время фильтрации средняя скорость течения составляла 415 л/м²/час. В сумме собрали 2000 л фильтрата с рН 4,2, непрерывно охлаждаемого до 8°С в верхней части пластинчатого теплообменника (PW) и содержащего 0,16% протеина, приблизительно 100 м.д. (0,01%) остеопонтина и 4,1% сухого вещества.

Фильтрат микрофильтрации имел значение рН, доведенное до 6,6% посредством добавления 6% NaOH. Его подвергали ультра/диафильтрации в спиральной ультрафильтрационной установке при 10°С и среднем давлении 4,0×10⁵ Па до тех пор, пока проводимость в фильтрате не оказалась ниже 500 мкСм. Провели фильтрацию на мембранах с размером пор 5000 Д. Собрали 40 кг остатка с рН 6,5, содержащего 7,9% протеина, приблизительно 5000 м.д. (0,5%) остеопонтина и 9,6% сухого вещества.

Остаток высушили распылением в колончатой сушилке NIRO и получили 3,5 кг порошка, содержащего 79,2% протеина, приблизительно 5,0% остеопонтина и 96,2% сухого вещества.

Пример 8

200 кг Остатка казеиновой сыворотки с рН 4,55, содержащей 23,2% протеина, приблизительно 1300 м.д. (0,13%) остеопонтина и 29,1% сухого вещества, разбавили 1000 кг деминерализованной воды и посредством добавления 6% NaOH довели рН до 7,4. Затем провели тепловую обработку при 85°С в течение 30 мин и охлаждение до 8°С. К прошедшему тепловую обработку остатку добавили 8,8 кг CaCl₂·2H₂O и посредством добавления 6% соляной кислоты довели рН до 4,1.

После отстаивания в течение по меньшей мере 2 час (или до следующего дня) провели нагрев до 50°С и осуществили микрофильтрацию керамических мембран с размером пор 0,8 мкм и с площадью 2,8 м² при 50°С и среднем давлении 4,0×10⁵ Па. Диафильтрацию осуществляли при рН, доведенном до 4,1, с горячей (50°С) деминерализованной водой до тех пор, пока проводимость в фильтрате не оказалась ниже 100 мкСм. Во время всего процесса фильтрации средняя скорость течения составляла 445 л/м²/час. В сумме собрали 2800 л фильтрата с рН 4,1, охлажденного до 8°С в верхней части пластинчатого теплообменника (PW) и содержащего 0,16% протеина, приблизительно 100 м.д. (0,01%) остеопонтина и 4,0% сухого вещества.

Посредством добавления 6% NaOH довели рН фильтрата микрофильтрации до 6,6%. Фильтрат подвергали ультра/диафильтрации в спиральной ультрафильтрационной установке при 10°С и среднем давлении 4,0×10⁵ Па до тех пор, пока проводимость в фильтрате не оказалась ниже 500 мкСм. Фильтрацию проводили на мембранах с размером пор 5000 Д. Собрали 40 кг остатка с рН 6,5, содержащего 11,2% протеина, приблизительно 6500 м.д. (0,65%) остеопонтина и 12,4% сухого вещества.

Остаток прокачали через колонку с анионным ионообменником, который был уравновешен с 0,45 М КН₂PO₄ с рН, равным 4,5. Таким образом остеопонтин, в отличие от большей части других протеинов, в связанном состоянии остался в колонке. Колонку промывали с 0,45 М КН₂PO₄ с рН, равным 4,5, до тех пор, пока поглощение при 280 нм не оказалось равным 0.

Элюировали остеопонтин из анионного ионообменника с 0,7 М КН₂PO₄ с рН, равным 4,5, до тех пор, пока поглощение при 280 нм не оказалось равным 0. В результате собрали 50 л элюата, содержащего 500 г протеина, 50% которого составлял остеопонтин. Элюат сконцентрировали и с целью удаления солей подвергли диафильтрации на ультрафильтрационных мембранах с размером пор 5000 Д при 10°С и среднем давлении 4,0×10⁵ Па. Собрали 5 кг остатка, содержащего 10,7% сухого вещества, приблизительно 5% остеопонтина и 9,6% протеина. Остаток высушили распылением в колончатой сушилке NIRO и получили 0,5 кг порошка, содержащего 86,0% протеина, приблизительно 45% остеопонтина и 95,8% сухого вещества.

Предложен способ выделения остеопонтина из молочного материала. Способ осуществляют путем проводимых выборочным образом смешивания молочного материала с растворимой солью кальция и выделения фазы, содержащей остеопонтин, из остальной части молочного материала за счет регулирования рН. 15 з.п. ф-лы.

1. Способ выделения остеопонтина из молочного материала, отличающийся тем, что смешивают молочный материал, содержащий остеопонтин, и кальций, а рН регулируют таким образом, чтобы удержать остеопонтин в растворе во время осаждения других составляющих молочного материала или чтобы агрегировать или связать остеопонтин во время удаления других составляющих молочного материала в растворе.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что молочный материал смешивают с растворимой солью кальция, а рН доводят до кислого рН, чтобы удержать остеопонтин в растворе во время осаждения других составляющих молочного материала.3. Способ по п.2, отличающийся тем, что рН доводят до 3,5-5,0.4. Способ по п.2, отличающийся тем, что рН доводят до 4,0-4,6.5. Способ по п.2, отличающийся тем, что рН доводят до приблизительно 4,2.6. Способ по п.2, отличающийся тем, что растворимый источник кальция представляет собой хлорид кальция.7. Способ по п.1, отличающийся тем, что молочный материал смешивают с нерастворимой солью кальция, а рН доводят до нейтрального или основного рН, чтобы связать или агрегировать остеопонтин во время его осаждения без осаждения основной части других составляющих молочного материала.8. Способ по п.7, отличающийся тем, что рН доводят до 6,0-8,5.9. Способ по п.7, отличающийся тем, что рН доводят до 6,5-8,0.10. Способ по п.7, отличающийся тем, что рН доводят до приблизительно 7.11. Способ по п.1, отличающийся тем, что процесс проводят поэтапно.12. Способ по п.11, отличающийся тем, что, по меньшей мере, один этап предусматривает использование растворимой соли кальция и кислого рН и, по меньшей мере, еще один этап предусматривает использование нерастворимого соединения кальция и рН в интервале от нейтрального до основного.13. Способ по п.1, отличающийся тем, что молочный материал, содержащий остеопонтин, представляет собой сывороточный продукт.14. Способ по п.1, отличающийся тем, что молочный материал, содержащий остеопонтин, представляет собой сконцентрированный сывороточный продукт.15. Способ по п.1, отличающийся тем, что молочный материал, содержащий остеопонтин, представляет собой сывороточный продукт химического подкисления молока.16. Способ по п.2 или 7, отличающийся тем, что молочный материал, содержащий остеопонтин, и материал, содержащий кальций, смешивают таким образом, чтобы концентрация кальция составляла приблизительно 0,2%.