СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО БЕЛКОВОГО КОНЦЕНТРАТА, ОБОГАЩЕННОГО ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ РИБОНУКЛЕАЗОЙ А, АНГИОГЕНИНОМ И ЛИЗОЦИМОМ, ИЗ МОЛОЧНОГО УЛЬТРАФИЛЬТРАТА Российский патент 2003 года по МПК A23J3/08 A23J3/10 A23C9/00 A61K35/20 

Изобретение относится к молочной, мясной отраслям промышленности, медицинской промышленности, косметической промышленности, а именно к выделению биологически активных белков молока, в том числе панкреатической рибонуклеазы А, ангиогенина и лизоцима.

Цельное коровье молоко является источником биологически активных белков и ферментов, в том числе таких как лизоцим, панкреатическая рибонуклеаза А (пРНКаза А) и ангиогенин. Однако в процессе технологической переработки молока эти белки либо теряют свою активность, либо остаются во вторичном молочном сырье, таком как подсырная и творожная сыворотки, ультрафильтрат, пахта.

Большинство способов выделения и фракционирования сывороточных белков основывается на применении таких методов, как ионообменная хроматография, аффинная хроматография, селективное осаждение. Несмотря на то, что различные фракции и композиции сывороточных белков вызывают коммерческий интерес, вышеперечисленные методы фракционирования не могут быть использованы для выделения белков в промышленном масштабе, из-за их сложности, высокой стоимости, продолжительности процесса и низкого конечного выхода белков.

Так, известен способ выделения белков из ультрафильтрата цельного молока, заключающийся в осаждении белков 12,5% трихлоруксусной кислотой (ТХУ) и дальнейшем центрифугировании белкового осадка (2000g в течение 20 мин) [Barbano D.M., Sciancalepore V., Rudan M.A. Characterization of milk proteins in ultrafiltration permeate // J. Dairy Sci. - 1988. - V.71, 10, P. 2655-2657] . Недостатком данного способа является получение денатурированных белков, вследствие чего они теряют свою биологическую и ферментативную активность, а также к недостаткам относится осаждение белков ТХУ кислотой, использование которой не разрешается в пищевой промышленности.

В настоящее время имеется большое количество изобретений, где сывороточные белки получают, используя различные мембранные методы обработки и их комбинации. В результате получают белковые фракции, отличающиеся как по своему составу, так и по биологическому действию.

Известен способ получения из сыворотки белковой фракции, обогащенной α-лактальбумином, заключающийся в том, что сыворотку (значения рН которой лежат в интервале 4,0-7,5) подвергают тепловой обработке: 85^oС с выдержкой 5 мин или 120^oС - 5 с, в результате чего происходит агрегация молекул β-лактоглобулина друг с другом и с другими белковыми молекулами. Далее α-лактальбумин отделяют от увеличившихся в размере молекул β-лактоглобулина с помощью таких мембранных процессов как микрофильтрация или ультрафильтрация и последующая диафильтрация. Размер пор используемых при этом мембран составляет 50000-150000 дальтон, далее по тексту Д [Uchida et al. Process for preparing a fraction having a high content of α-lactalbumin from whey and nutritional compositions containing such fractions // Патент США. - 1996. - 5, 503, 864]. Недостатками данного способа являются высокая температурная обработка используемой сыворотки, что приводит к потере активности многих белков и пептидов, в том числе пРНКазы, ангиогенина и лизоцима, а также то, что мембраны, используемые в данном способе, пропускают значительную долю белков с молекулярной массой ниже 50000 Д.

Известны способы выделения белковых композиций, обладающих костеукрепляющей активностью из сыворотки или сывороточных белков (молекулярный вес входящих в состав композиций белков и пептидов находится в пределах 5000-28000 Д), заключающиеся в том, что белки фракционируют, используя такие способы, как осаждение этанолом, нагреванием и добавлением концентрированных солей, затем полученные осадки отделяют центрифугированием при различных режимах или ультрафильтрацией (размер пор используемых мембран 500000 Д или 30000 Д). Полученные фракции, содержащие данные белки, обессоливают электродиализом или концентрируют и обессоливают обратным осмосом, затем лиофильно высушивают [Kobayashi et al. Bone enhancing factors from whey and compositions containing same // Патент США. - 1997. - 56540]. Недостатками данных способов является сложность и продолжительность процессов, что в конечном итоге приводит к высокой стоимости производства и самих белковых композиций.

Известен способ получения биологически активных сывороточных белков, взятый в качестве прототипа, в котором неденатурированный белковый концентрат получают из подсырной сыворотки, которую облучают с помощью источника гамма облучения (радиационная доза варьирует в пределах 5-15 кГ), при этом достигается антибактериальный эффект, эквивалентный стандартной пастеризации, с минимальной денатурацией белков. Затем сыворотка сепарируется и концентрируется ультрафильтрацией через полисульфоновые мембраны, размер пор которых приблизительно 10000 Д, так что белки с молекулярным весом 15000 Д и более задерживаются мембраной. Процесс осуществляется на установке, состоящей из 18 модулей (каркасный типичный модуль содержит большой ряд мембран), очистка белкового раствора от лактозы и минеральных солей осуществляется диафильтрацией, для этого в последние 10 модулей установки подается деминерализованная вода. Полученный белковый концентрат лиофилизируется и содержит до 80% белка [Bounous G., Gold P. et al. Biologically active whey protein concentrate // Патент США. - 1994. - 5290571].

Однако этот способ не может быть использован для получения биологически активного белкового концентрата, обогащенного пРНКазой А, ангиогенином и лизоцимом, поскольку молекулярная масса этих белков составляет приблизительно 14000 Д, а следовательно, они проходят через поры применяемой в данном способе мембраны. К недостатками данного способа относится стерилизация сыворотки гамма излучением, которое запрещено для использования в пищевой промышленности, а также применение для ультрафильтрации полисульфоновых мембран, которые к настоящему моменту являются морально устаревшими и уже не эксплуатируются в промышленности.

Технический результат заключается в увеличении биологической активности белкового концентрата, за счет обогащения его пРНКазой, ангиогенином и лизоцимом, получаемого из молочного ультрафильтрата с использованием мембранных процессов.

Технический результат достигается тем, что концентрирование белков молочного ультрафильтрата осуществляется посредством обратного осмоса, следующая затем очистка белкового раствора от лактозы и минеральных веществ осуществляется посредством диафильтрации, полученный белковый концентрат стерилизуют, подвергая его микрофильтрации, и сублимационно сушат.

Согласно изобретению, для получения неденатурированного белкового концентрата, ультрафильтрат, полученный при ультрафильтрационной обработке молока, где размеры пор используемых мембран 20000-50000 Д, концентрируется обратным осмосом. Для обеспечения производственной стерильности и предотвращения денатурации белка, процесс необходимо проводить при температуре 4-10^oС. В установке используются модули, оснащенные мембранами, размер пор которых составляет 1000-5000 Д (при этом материал мембран должен характеризоваться минимальной связываемостью с белком), жидкость подается на мембрану при рабочем давлении 0,4-0,7 МПа. Установка содержит такое количество модулей, чтобы степень концентрирования раствора была 10-12-кратная. Затем осуществляется очистка белкового раствора от лактозы и минеральных веществ добавлением в последние модули установки 0,01 молярного калий-фосфатного буфера, рН которого 6,7-7,0 (0,01 М К₂НРО₄) посредством диафильтрации. Далее полученный белковый концентрат поступает в промежуточный резервуар, снабженный рубашкой для поддержания температуры раствора порядка 4-10^oС. Оттуда белковый концентрат подается в микрофильтрационную установку, где происходит его стерилизация. Целью данного процесса является микробиологическая очистка без влияния на активность белков. В микрофильтрационной установке используются мембраны, размер пор которых составляет 0,10-0,45 мкм (предпочтительно 0,22 мкм), рабочее давление 0,2-0,7 МПа. После микрофильтрации белковый концентрат в стерильных условиях сублимационно сушат. Таким образом, получают сухой белковый концентрат, обогащенный пРНКазой, ангиогенином и лизоцимом, содержащий до 90% биологически активных белков. Согласно проведенному электрофорезу в 15% полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия, в состав полученного белкового концентрата входят белки с молекулярной массой (ММ) приблизительно от 5000 Д до 28000 Д, причем основную долю составляют белки с ММ 14000 Д и примерно 18000 Д. Таким образом, биологически активный белковый концентрат включает такие белки, как: α-лактальбумин (ММ 14147 Д), а также пРНКазу, ангиогенин и лизоцим, молекулярные массы которых близки к 14000 Д; β-лактоглобулин (ММ 18362 Д); неидентифицированный белок с молекулярной массой несколько ниже 30000 Д и низкомолекулярные пептиды молока, обладающие иммуностимулирующими свойствами [Демин А. А. , Малинин В.В., Шатаева Л.К. и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 1994. Т. 30. 2. С. 311-315].

Способ осуществляется следующим образом: производят мембранную обработку молочного ультрафильтрата, включающую на первой стадии обратный осмос, в результате чего происходит концентрирование белков в 10-12 раз; на второй стадии - диафильтрацию, для очистки белкового раствора от лактозы и минеральных веществ добавлением 0,01 М калий-фосфатного буфера с рН 6,7-7,0; на третьей стадии - микрофильтрацию, для стерилизации полученного белкового концентрата, обогащенного пРНКазой, ангиогенином и лизоцимом. Выделенный данным способом концентрат белков сублимационно сушат.

Пример 1. 1 л охлажденного до 4^oС ультрафильтрата, полученного при ультрафильтрации нормализованного и гомогенизированного молока на установке непрерывного действия, оснащенной мембранами с размером пор 30000 Д, концентрируют обратным осмосом, при этом используется мембрана, размер пор которой составляет 1000 Д, давление в установке 0,7 МПа. Сконцентрировав ультрафильтрат в 10 раз, осуществляют процесс очистки белкового раствора от лактозы и минеральных веществ добавлением 0,01 М калий-фосфатного буфера (рН 6,7) посредством диафильтрации, при этом объем раствора на протяжении всего процесса диафильтрации остается постоянным. Затем полученный белковый концентрат стерилизуют посредством микрофильтрации, используя в установке мембрану с размером пор 0,10 мкм. Полученный биологически активный белковый концентрат, обогащенный пРНКазой, ангиогенином и лизоцимом (концентрация данных белков увеличивается в 40-300 раз, по сравнению с молоком и молочной сывороткой), сублимационно сушат, при этом из 1 л ультрафильтрата получают 300-400 мг сухого белка. В состав концентрата входят белки и пептиды с молекулярными массами от 5000 до 28000 Д (электрофорез в 15% ПААГ) (см. чертеж).

Пример 2. 1 л охлажденного до 6^oС ультрафильтрата, полученного при ультрафильтрации нормализованного и гомогенизированного молока на установке непрерывного действия, оснащенной мембранами с размером пор 30000 Д, концентрируют обратным осмосом, при этом используется мембрана, размер пор которой составляет 3000 Д, давление в установке 0,5 МПа. Сконцентрировав ультрафильтрат в 12 раз, осуществляют процесс очистки белкового раствора от лактозы и минеральных веществ добавлением 0,01 М калий-фосфатного буфера (рН 6,8) посредством диафильтрации, при этом объем раствора на протяжении всего процесса диафильтрации остается постоянным. Затем полученный белковый концентрат стерилизуют посредством микрофильтрации, используя в установке мембрану с размером пор 0,22 мкм. Полученный биологически активный белковый концентрат, обогащенный пРНКазой, ангиогенином и лизоцимом (концентрация данных белков увеличивается в 40-300 раз, по сравнению с молоком и молочной сывороткой), сублимационно сушат, при этом из 1 л ультрафильтрата получают 300-400 мг сухого белка. В состав концентрата входят белки и пептиды с молекулярными массами от 5000 до 28000 Д (электрофорез в 15% ПААГ) (см. чертеж).

Пример 3. 1 л охлажденного до 10^oС ультрафильтрата, полученного при ультрафильтрации нормализованного и гомогенизированного молока на установке непрерывного действия, оснащенной мембранами с размером пор 30000 Д, концентрируют обратным осмосом, при этом используется мембрана, размер пор которой составляет 5000 Д, давление в установке 0,4 МПа. Сконцентрировав ультрафильтрат в 10 раз, осуществляют процесс очистки белкового раствора от лактозы и минеральных веществ добавлением 0,01 М калий-фосфатного буфера (рН 7,0) посредством диафильтрации, при этом объем раствора на протяжении всего процесса диафильтрации остается постоянным. Затем полученный белковый концентрат стерилизуют посредством микрофильтрации, используя в установке мембрану с размером пор 0,45 мкм. Полученный биологически активный белковый концентрат, обогащенный пРНКазой, ангиогенином и лизоцимом (концентрация данных белков увеличивается в 40-300 раз, по сравнению с молоком и молочной сывороткой), сублимационно сушат, при этом из 1 л ультрафильтрата получают 300-400 мг сухого белка. В состав концентрата входят белки и пептиды с молекулярными массами от 5000 до 28000 Д (электрофорез в 15% ПААГ) (см. чертеж).

Подтверждением биологической активности полученного данным способом белкового концентрата стала активация защитных реакций организма экспериментальных животных. Для этого белковый концентрат перорально вводили крысятам (инфантильного периода породы Вистар) во время перехода от грудного вскармливания к стандартному рациону питания (т. е. в момент неблагоприятных стрессовых условий), при этом из него были исключены молочные продукты, которые могли содержать данные белки, что затруднило бы выявление эффектов. Животные получали в течение 10 дней 400 мг/кг белкового концентрата ежедневно. В качестве критериев оценки использовались морфологические показатели (масса животных, абсолютная и относительная масса органов), гематологические показатели (гемоглобин, эритроциты, лейкоциты, формула и свертываемость крови), биофизические показатели (вязкость крови, индекс аггрегации эритроцитов), иммунологический показатель - уровень лизоцима в крови и кристаллографические показатели (морфология сухой капли сыворотки крови и спектр структур жидкокристаллической фазы).

Морфологические исследования выявили, что белковый концентрат, полученный вышеописанным способом, не влияет на вес, абсолютную и относительную массу таких внутренних органов, как печень, легкие, селезенка, почки и головной мозг, которые находятся в пределах нормы для данной возрастной категории животных, но вызывает некоторое увеличение массы тимуса (в опытной группе 136,9±31,9 мг против 94,4±9,4 мг в контрольной) - центрального органа иммунной системы, оказывающего влияние на иммунный гомеостаз.

Результаты гематологических исследований выявили значительный разброс показателей формулы крови, а также увеличение базофилов с признаками дегрануляции в контрольной и опытной группе, что отражает индивидуальную чувствительность животных на стресс.

Биофизические исследования свидетельствуют о положительном влиянии белкового концентрата на реологические показатели, так параметры вязкости крови в обеих группах имели тенденцию к повышению при малых скоростях сдвига - 20 с^-1, а при расчете индекса аггрегации эритроцитов выявлено его снижение в опытной группе 1,21 против 1,39 в контроле.

Кристаллографическое исследование морфоструктур жидкокристаллической фазы (поляризационно-оптический метод) не выявило существенных различий сложнобелкового состава в сравниваемых группах. Морфограммы сухой капли в опытной группе имели некоторые отличия в виде уменьшения секторальности, расширения трещин, увеличения количества конкреций с ядерно-островными структурами и волновыми образованиями, свидетельствующими о конформационной перестройке.

Белковый концентрат стимулирует достоверное увеличение лизоцима в крови опытной группы животных 2,5±0,3 мкг/мл против 1,7±0,2 в контроле (Р<0,05).

Биологическое действие белкового концентрата таково, что использование его per os в физиологических дозах в период неблагоприятных (стрессовых) условий приводит к некоторой активации защитных реакций организма.

Изобретение относится к молочной промышленности, в частности к выделению биологически активных белков молока, в том числе панкреатической рибонуклеазы А, ангиогенина и лизоцима. Способ заключается в том, что молочное сырье, в качестве которого используют ультрафильтрат, сначала концентрируют в 10-12 раз посредством обратного осмоса через мембрану с размером пор 1000-5000 Д при давлении 0,4-0,7 МПа и температуре 4-10^oС, затем производят очистку белкового раствора от лактозы и минеральных веществ добавлением калий-фосфатного буфера с рН 6,7-7,0, посредством диафильтрации, полученный белковый концентрат стерилизуют, подвергая его микрофильтрации через мембрану с размером пор 0,10-0,45 мкм при давлении 0,2-0,7 МПа и температуре 4-10^oС. Изобретение позволяет увеличить биологическую активность белкового концентрата за счет обогащения его и РНКазой, ангиогенином и лизоцимом, получаемого из молочного ультрафильтрата с использованием мембранных процессов. 1 ил.

Способ получения биологически активного белкового концентрата из молочного сырья с использованием мембранных процессов и сублимационной сушки полученного концентрата, отличающийся тем, что в качестве молочного сырья используют ультрафильтрат, который сначала концентрируют в 10-12 раз посредством обратного осмоса через мембрану с размером пор 1000-5000 Д при давлении 0,4-0,7 МПа и температуре 4-10^oС, затем производят очистку белкового раствора от лактозы и минеральных веществ добавлением калий-фосфатного буфера с рН 6,7-7,0, посредством диафильтрации, полученный белковый концентрат стерилизуют, подвергая его микрофильтрации через мембрану с размером пор 0,10-0,45 мкм при давлении 0,2-0,7 МПа и температуре 4-10^oС.