СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИММУНОРЕАКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/58 G01N33/53 

Изобретение относится к области иммунобиотехнологии и может быть использовано в производстве высокочувствительных тест-систем для (качественного и количественного) определения антигенов, антител и других иммунореактивных соединений, а также в технологии изготовления безынструментальных и надежных диагностикумов для анализов, основанных на стереоспецифических взаимодействиях, таких как: иммунохимические, генно-гибридизационные и лиганд-рецепторные. Предполагаемая область применения изобретения включает, в частности, диагностику ряда заболеваний, в том числе и особо опасных: СПИД, гепатит, хламидиоз, ботулизм, столбняк, диабет и т.д., а также анализ соматических состояний: ранняя диагностика беременности, определение сроков овуляции и др.

Предлагаемое решение относится к объектам, один из которых предназначен для осуществления другого.

Аналогом заявляемых объектов по технической сущности и достигаемому результату являются способ стереоспецифического анализа с использованием конъюгатов антианалита с частицами коллоидного золота и способ получения конъюгатов для данного анализа (Roth J., Heitz P.U., Immunolabeling with the Protein A - Gold Technique: An Overview, Ultrastructural Pathology, 1989, 13:467-484).

В аналоге инкубируемый с иммобилизованным на твердофазном носителе первым антианалитом определяемый лиганд (аналит) детектируют вторым антианалитом, меченным частицами коллоидного золота. В процессе детекции конъюгатом "антианалит/коллоидное золото" осуществляют прямую визуализацию специфически связанного аналита. Таким образом исключается дополнительная стадия визуализации самого конъюгата (как, например, стадия субстратного проявления ферментных конъюгатов в дот-ИФА).

Основным недостатком аналога является относительно низкая чувствительность, связанная с невысокой хромофорностью (цветностью в видимом диапазоне светового спектра) частиц коллоидного золота, что связано как собственно с оптическими характеристиками, которые обусловлены химической природой самих коллоидов золота, так и с ограниченными размерами частиц коллоида.

Что касается способа получения конъюгатов антианалита с цветной суспензоидной меткой, то в известном аналоге используют нековалентную процедуру конъюгирования, которая по существу заключается в простом соединении свежеприготовленного метаста-бильного коллоида золота с антианалитом в зоне определенных оптимальных концентраций последнего, которая для каждого конкретного антианалита должна быть подобрана в индивидуальных экспериментах. При этом в соединении двух названных реагентов участвуют только нехимические адсорбционные связи, которые существенно слабее ковалентных. В результате получаемые в аналоге конъюгаты не являются достаточно стабильными, что осложняет возможность их длительного хранения и, кроме того, накладывает ряд существенных ограничений на их использование в самих процедурах анализа - например, не позволяет использовать обычно применяемые в подавляющем большинстве твердофазных анализов с целью подавления неспецифических взаимодействий детергенты, которые способны разрушить нековалентный конъюгат "антианалит/коллоидное золото". В целом способ-аналог обладает неудовлетворительной чувствительностью и надежностью.

Прототипом является патент РФ №20899212 от 10.09.1997, в котором в качестве метки применили частицы коллоидного углерода и красителей из ряда формазанов, диформазанов и суданов. Проблемы повышения надежности системы анализа решили путем ковалентного конъюгирования метки с антианалитами.

Указанные метки отличаются очень высокой степенью оптической плотности в видимом диапазоне светового спектра, существенно превышающей оптическую плотность всех известных цветных меток, включая коллоидное золото, а также хромофорность продуктов конвертации преципитирующих субстратов ферментных меток в иммуноферментном варианте безынструментального анализа. Использование высокой оптической плотности частиц коллоидного углерода и красителей из ряда формазанов, диформазанов и суданов позволило решить проблему повышения чувствительности систем безынструментального анализа.

Задачу повышения надежности анализа и стабильности используемых в анализе детектирующих реагентов решили путем ковалентного конъюгирования антианалита с цветными суспензоидными частицами. Для этого частицы покрывали водорастворимым полимером, способным относительно прочно сорбироваться на поверхности частиц. Сорбция полимера позволяет получить стабильный в растворах суспензоид цветной метки. Обработка полученного комплекса бифункциональным реагентом приводит к ковалентной сшивке между сорбированными молекулами полимера и одновременно - к внедрению на поверхность комплекса реакционноспособных групп бифункционального реагента. Последующее соединение освобожденной от избытка конъюгирующего реагента активированной метки с антианалитом завершается ковалентной пришивкой молекул антианалита к поверхности цветной метки.

Недостатками прототипа является то, что получение углеродных частиц является весьма трудоемким процессом, а формазаны, диформазаны и суданы не только ограниченно выпускаются отечественной промышленностью, но и достаточно дороги. Кроме того, в способе получения конъюгата дважды предусмотрены стадии хроматографии и процесс концентрирования реагента, что приводит не только к удлинению, усложнению и удорожанию синтеза, но и к существенным, до 25%, потерям материала.

Изобретение направлено на решение задач: повышение чувствительности, надежности и универсальности способа анализа, а также оптимизация способа получения конъюгата.

Первую поставленную задачу решают путем использования в качестве метки второго антианалита частиц водонерастворимых красителей: акридинового оранжевого, 2,4-нитродифенилгидразина, кумасси R-250. Предлагаемые метки обладают очень высокой степенью оптической плотности в видимом диапазоне светового спектра, доступны, сравнительно дешевы и не требуют никакой предварительной процедуры подготовки к синтезу.

Задачу оптимизации способа получения конъюгата для детекции и увеличения чувствительности систем детекции решают следующим образом. Частицы покрывают водорастворимым полимером, который является непосредственно аффинным соединением, т.е. антианалитом, прочно сорбирующимся на поверхности частиц. Сорбция полимера позволяет получить стабильный в растворах суспензоид цветной метки. Сорбированный полимер экспонирует в водную фазу функциональные группы, способные ковалентно реагировать с гомо- и/или гетеробифункциональными конъюгирующими соединениями. Последующая обработка полученного комплекса бифункциональным реагентом, взятым в большом молярном избытке по отношению к функциональным группам полимера, осуществляемая в присутствии в реакционной смеси антианалита, приводит к ковалентной сшивке между сорбированными молекулами полимера, внедрению на поверхность комплекса реакционноспособных групп бифункционального реагента и ковалентной пришивке молекул антианалита к поверхности цветной метки. То есть реакции стабилизации, активирования и конъюгирования протекают одновременно. В результате заявляемый способ позволяет получать конъюгаты прочной ковалентной структуры, которые устойчивы в растворах, в том числе в присутствии высоких концентраций детергентов, и очень стабильны при длительном хранении в широких температурных пределах (которые зависят только от природных характеристик антианалитов). Более того, ковалентно сшитый полимер на поверхности частиц представляет собой не монослой, как в прототипе, а мультислойную амплифицированную структуру, что приводит к увеличению числа реакционно-способных аффинных групп антианалита. Одноэтапный, в отличие от прототипа, характер конъюгирования, исключающий одну стадию хроматографической очистки и стадию концентрирования, создает дополнительное преимущество, делая заявляемый способ существенно проще в процедурном отношении, значительно дешевле, более надежно воспроизводимым независимо от диапазона концентраций тех или иных антианалитов. Создаваемый способом положительный эффект в целом характеризуется существенно большей по сравнению с аналогом надежностью и универсальностью.

Нижеследующие примеры приводятся только с целью демонстрации возможностей настоящего изобретения, но никоим образом не ограничивают как спектр возможных технологических приемов синтеза конкретных детектирующих реагентов, так и область возможного применения изобретения в целом.

Приводимые в примерах конкретные количественные параметры, даже в области указываемых диапазонов, не фиксируются формулой изобретения, потому что не являются принципиальными условиями осуществления заявляемых способов с точки зрения их существенных отличий, которыми в наиболее широком смысле являются использование новых цветных суспензоидных меток в анализе и их одноэтапное ковалентное конъюгирование с антианалитами.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЮТ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ

Получение конъюгатов цветных суспензоидных меток с антианалитами (Белком А, Белком G, Стрептавидином, Антителами).

К 20 мл раствора антианалита 10-50 мг/мл в 0,01-0,2М фосфатном буферном растворе рН 6-8,5 (ФБР) добавляют 0,1-2 грамма сухой метки. Смесь перемешивают на магнитной мешалке или роторном встряхивателе типа "Vortex" в течение времени, достаточного для полной предварительной пептизации (смачивания) частиц. Полученную суспензию озвучивают в ультразвуковом дезинтеграторе. Условия ультразвуковой обработки суспензии (интенсивность и мощность, количество и продолжительность циклов озвучивания) подбирают таким образом, чтобы разбиваемая суспензия при одновременном (возможном) охлаждении не разогревалась до температуры свыше 40°С, а общее время ультразвукового воздействия на суспензию составило 120 минут. Полученный в результате эффективной ультразвуковой дезинтеграции суспензоид центрифугируют при 6000 g в течение 5-10 минут с целью удаления оставшихся относительно крупных частиц. Покрытые антианалитом суспензоидные частицы метки с размерами 150 - 160 нм, содержащиеся в супернатанте, в дальнейшем обрабатывают раствором глутаральдегида. Диапазон эффективных концентраций реагента - 1-25%, время обработки - от 120 до 480 минут. Полученные конъюгаты освобождают от избытка антианалита центрифугированием или гель-фильтрацией на колонке с Сефарозами (6В, 4В, 2В; CL-6B, CL-4B, CL-2B), Сефакрилом S-300 или другими подходящими гелями (Тойоперлы, Ультрагели и др.), имеющими предел исключения не ниже одного миллиона дальтон для глобулярных белков. Фракции, вышедшие в холостом объеме и содержащие конъюгат, объединяют и добавляют БСА и глицерин до конечных концентраций соответственно 1% и 20%.

По описанной схеме были синтезированы конъюгаты: Белок G - Акридиновый оранжевый, Белок G - Кумасси R-250, Стрептавидин - 2,4-нитродифенилгидразин, Стрептавидин - Кумасси R-250, Анти-ХГЧ антитела (АВ 0421) - Кумасси R-250.

Рабочая концентрация конъюгатов, используемая в анализах, составляет 0,03% в пересчете на сухой вес метки.

Способ определения иммунореактивных соединений иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Иммунохроматографическое определение IgG человека с использованием конъюгата Белок G - Кумасси R-250 в сравнении с Белком А, меченным коллоидным углеродом, и Белком А, меченным коллоидным золотом с размерами частиц 40 нм.

В анализе использовали полоски нитроцеллюлозы (Bio-Rad) с размерами пор 5 мкм с иммобилизованными на них в виде пятен IgG человека (наносимый объем 0,002 мл) из кратных 10 разведений 1 мг/мл, 100 мкг/мл, 10 мкг/мл, 1 мкг/мл, 100 нг/мл, 10 нг/мл, 1 нг/мл, 100 пг/мл. Край полоски, предварительно блокированной в растворе 1% казеина в фосфатном буферном растворе, содержащем 0,05% Твина 20 (ФБР-Тв), помещали в раствор конъюгатов на 10-15 сек (время, достаточное для прохождения за счет капиллярных сил фронтом реагентов расстояния около 10 мм), а затем в ФБР-Тв. По мере прохождения фронтом мигрирующего диагностикума зоны иммобилизации лиганда наблюдали проявление в виде цветных пятен результатов анализа. Чувствительность системы детекции с использованием конъюгата Белок G - Кумасси R-250 составила 2 пг/пятно, с конъюгатом Белок А - Углерод - 20 пг/пятно, с конъюгатом Белок А - Золото - 200 пг/пятно.

Пример 2. Иммунохроматографическое определение IgG человека с использованием конъюгата Белок G - акридиновый оранжевый в сравнении с Белком А, меченным коллоидным углеродом, и Белком А, меченным коллоидным золотом с размерами частиц 40 нм.

В анализе использовали полоски нитроцеллюлозы (Bio-Rad), аналогичные описанным в примере 1. Процедуру сравнительного анализа проводили так же, как в примере 1, но вместо конъюгата Белок G - Кумасси R-250 в качестве детектирующего реагента использовали конъюгат Белок G - акридиновый оранжевый. Чувствительность системы детекции с использованием конъюгата Белок G - акридиновый оранжевый составила 8 пг/пятно, с конъюгатом Белок А - Углерод - 20 пг/пятно, с конъюгатом Белок А - Золото - 200 пг/пятно.

Пример 3. Определение анти-ВИЧ антител на непористой твердой фазе с использованием конъюгата Белок G - Кумасси R-250.

В качестве твердой фазы использовали планшеты из белого непрозрачного полистирола, на внутренней поверхности лунок которых сорбировали в виде пятен (дотов) первые антианалиты: "envI", представляющий собой синтезированный в E.coli рекомбинантный полипептид, содержащий антигенные детерминанты гликопротеинов gp120 и gp41 ВИЧ-1; "gagI", представляющий собой синтезированный в Е.coli рекомбинантный полипептид, содержащий антигенные детерминанты белков р24 и р17 ВИЧ-1; "polI", представляющий собой синтезированный в E.coli рекомбинантный полипептид, содержащий антигенные детерминанты полимеразы р51 ВИЧ-1; "envII", представляющий собой синтезированный в E.coli рекомбинантный полипептид, содержащий антигенные детерминанты гликопротеинов gp110 и gp38 ВИЧ-2; контрольный антиген специфичности реакции (внутренний отрицательный контроль), представляющий собой синтезированный в E.coli рекомбинантный полипептид, не содержащий антигенных детерминант ВИЧ-1 и ВИЧ-2, и контрольный антиген правильности проведения реакции (внутренний положительный контроль), представляющий собой IgG человека. В сенсибилизированные лунки вносили по 0,3 мл сыворотки ВИЧ-инфицированного больного из разведений, кратных двум. После 30-минутной инкубации и отмывки ФБР-Тв в лунки вносили конъюгат Белок G - Кумасси R-250 на 15 минут, после чего, удалив конъюгат, наблюдали результаты анализа в виде четких контрастных пятен. Белок G в данном случае выступает в роли второго антианалита по отношению к определяемому иммунореактивному соединению (антитела к ВИЧ). Параллельно связанные антитела определяли Белком А, меченным углеродом, Белком А, меченным пероксидазой хрена, и Белком А, меченным коллоидным золотом с размерами частиц 40 нанометров. Чувствительность анализа оценивали по конечному разведению сыворотки, дающему отличное от фона пятно. В результате сравнительного анализа получили чувствительность определения при помощи конъюгата Белок G - Кумасси R-250 - 1/40960, углеродного конъюгата 1/20.480, с использованием ферментного конъюгата - 1/1.280 (в стандартной процедуре проявления 4-хлорнафтолом) и практически неразличимые результаты определения конъюгатом Белок А - Золото.

Пример 4. Дот-определение анти-ВИЧ антител на пористой твердой фазе с использованием конъюгата Стрептавидин - 2,4-нитродифенилгидразин.

В качестве твердой фазы использовали полоски (4 мм × 45 мм) нитроцеллюлозы (Bio-Rad) с размерами пор 0,45 мкм с иммобилизованными на них в виде поперечных линий первыми антианалитами, теми же, что в примере 3.

Сенсибилизированные полоски помещали в канавки планшета, куда вносили по 1,0 мл, сыворотки ВИЧ-инфицированного больного из разведений, кратных двум. После 30-минутной инкубации и отмывки ФБР-Тв в лунки вносили раствор биотинилированных кроличьих анти-IgG человека антител. Через 30 минут раствор антител удаляли, полоски промывали ФБР-Тв трижды и в канавки вносили конъюгат Стрептавидин - 2,4-нитродифенилгидразин на 15 минут, после чего, удалив конъюгат и промыв полоски ФБР-Тв, наблюдали результаты анализа в виде окрашенных поперечных полосок в зонах иммобилизации первых антианалитов. Чувствительность определения по последней четко визуализируемой окрашенной полоске в ряду серийных разведении ВИЧ-позитивной сыворотки составила 1/128000. Определение в аналогичных условиях с использованием в качестве детектирующего реагента ферментного конъюгата Стрептавидин-Пероксидаза хрена и 4-хлорнафтола в качестве преципитирующего субстрата продемонстрировало чувствительность 1/16000.

Пример 5. Двухсайтное иммунофильтрационное (ИФ) определение хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) с использованием суспензоидного конъюгата анти-ХГЧ антитела (АВ 0421) - Кумасси R-250.

Приготовление связывающих ХГЧ фильтров.

В центр 5-мкм нитроцеллюлозного фильтра диаметром 25 мм с помощью Гамильтоновского шприца наносили моноклональные анти-ХГЧ антитела (АВ 0420) к альфа-субъединице ХГЧ, 1 мг/мл в ФБР в виде вертикальной полоски длинной 10 мм. После подсыхания фильтра через 30 минут наносили в то же место в виде такой же полоски, но перпендикулярно ей, стандарт ХГЧ из раствора концентрации 1 мг/мл в ФБР и через 30 минут подсыхания фильтр блокировали замачиванием в 1% казеине в ФБР-Тв на 1 час при комнатной температуре, после чего отмывали ФБР-Тв и вновь высушивали. Фильтр помещали в приспособление для иммунофильтрации (ИФ), представляющее собой пластиковый цилиндр диаметром 27 мм и высотой 50 мм, имеющий в верхней части «окно» в виде отверстия диаметром 23 мм и заполненный высокопористым бумажным сорбентом с высокой впитывающей способностью.

Определение стандарта ХГЧ.

Стандарт ХГЧ разводили кратно 2 в ФБР-Тв и моче здорового донора, добавленной твином-20 до 0,1%. К 120 мкл стандартных разведении ХГЧ, выполненных в лунках планшета для иммунологических реакций, добавляли по 120 мкл суспензоидного конъюгата анти-ХГЧ антитела (АВ 0421) - Кумасси R-250 в рабочем разведении в ФБР-Тв. Сразу же после этого содержимое лунки переносили на поверхность связывающих фильтров в «окно» приспособления для ИФ. Через 1-2 минуты результаты анализа определяли визуально по наличию (положительный результат: темно-синий рисунок в виде "+" на белом фоне) связывания суспензоидного конъюгата в зоне иммобилизации первых антител. Чувствительность анализа в нескольких сериях испытаний сконструированной системы составила 10 МЕ/л. Данная чувствительность удовлетворяет уровню диагностической потребности иммунохимического определения ранней беременности сроком в 1 неделю.

В случае реальной диагностики при отсутствии в пробе ХГЧ на поверхности фильтра проявляется рисунок в виде "-", что говорит об отрицательном результате пробы на беременность.

ТЕХНИКО-ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ предлагаемого изобретения заключается в увеличении чувствительности и надежности анализа с прямой визуализацией аналитов. Повышенная чувствительность анализа определяется высокой оптической плотностью предлагаемых меток и увеличением количества аффинных групп, пришиваемых к поверхности частиц меток. Надежность, экономичность и простота анализа детерминируются предлагаемым принципиально новым и универсальным способом одноэтапного синтеза реагентов для детекции, который позволяет получать очень стабильные ковалентные конъюгаты антианалитов с цветными суспензоидными метками.

Технология получения конъюгатов цветных суспензоидных меток независима от уникального или дорогостоящего оборудования и объективно дефицитных или дорогих реагентов. Универсальность и надежная воспроизводимость предлагаемого способа доказана в 32 сериях повторных синтезов конъюгатов с различными антианалитами.

Предлагаемый способ определения вследствие высокой чувствительности, надежности, простоты и оперативности может стать незаменимым в очагах эпидемиологического риска, при экстренных ситуациях, связанных с необходимостью переливания крови, в полевых условиях экспедиционных работ медико-санитарных отрядов, особенно в странах жаркого климата, а также в других нештатных ситуациях. Изобретение может служить основой для создания эффективных безынструментальных систем для упрощенного диагностического тестирования и эффективно использоваться в разнообразных "один пациент-один тест" наборах для амбулаторных, пребольничных и больничных анализов, а также в массовых "домашних" системах, пригодных для индивидуального использования.

Изобретение относится к области иммунологии. Сущность изобретения состоит в одноэтапном определении связанного аналита конъюгатом, в состав которого входит стереоспецифичное аналиту соединение (антианалит), ковалентно конъюгированное с суспензоидными частицами водонерастворимых красителей, в качестве которых используют: кумасси R-250, и/или акридиновый желтый, и/или акридиновый оранжевый, и/или 2,4-нитродифенилгидразин, и/или флуоресцеин. Использование в технологии получения конъюгатов для анализа одноэтапного ковалентного связывания антианалита с цветной суспензоидной меткой приводит к существенному упрощению процедуры синтеза, повышению экономичности и воспроизводимости, увеличению чувствительности систем детекции. Технический результат - увеличение чувствительности и надежности стереоспецифического анализа и оптимизация технологии получения используемых в нем реагентов для детекции (стереоспецифичных конъюгатов).

Способ определения иммунореактивных соединений, включающий получение конъюгата частиц цветной метки с детектирующим антианалитом с последующей инкубацией полученного конъюгата с детектируемым иммунореактивным соединением, отличающийся тем, что детектирующий антианалит конъюгируют с кумасси R-250, или акридиновым оранжевым, или 2,4-нитродифенилгидразином.