СПОСОБ ЗАЩИТЫ И СТАБИЛИЗАЦИИ ТВЕРДОФАЗНЫХ РЕАГЕНТОВ ИММУНОАНАЛИТИЧЕСКИХ СИСТЕМ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области иммунобиотехнологии и может быть использовано в изготовлении твердофазных реагентов (ТР) при производстве различных тест-систем для (качественного и количественного) определения антигенов, антител и других иммунореактивных соединений, а также в технологии изготовления надежных диагностикумов для анализов, основанных на стереоспецифических взаимодействиях, таких как иммунохимические, генно-гибридизационные и лиганд-рецепторные. Предполагаемая область применения изобретения включает практически все виды инструментальных и неинструментальных аналитических систем, применяемых в диагностике ряда заболеваний, в том числе и особо опасных: СПИД, гепатит, хламидиоз, ботулизм, столбняк, диабет и т.д., в анализе соматических состояний: ранняя диагностика беременности, определение сроков овуляции и др., в научно-аналитических работах исследовательских лабораторий и пр.

Одним из важнейших, а зачастую определяющих компонентов аналитических тест-систем, выполненных в формате твердофазного анализа, является твердофазный реагент. Как правило, это твердая подложка, представляющая собой непористый материал (чаще всего - полистирол) или пористый (мембрана из нитроцеллюлозы, ацетатцеллюлозы, PVDF и т.д.), с сорбированными на их поверхности антилигандами - веществами, специфичными определяемому лиганду. И те и другие могут представлять собой различные белковые молекулы: способные к специфическому взаимодействию соединения, такие как белок А, белок G, стрептавидин; антигены, антитела, ферменты, субстраты, ингибиторы ферментов и кофакторы; нуклеиновые кислоты и нуклеотидные зонды и др. Механизмами сорбции в подавляющем числе случаев являются гидрофобные и электростатические взаимодействия. Сорбированные на подложке антилиганды и образуют твердофазные реагенты. Указанные механизмы вполне способны сами по себе обеспечить достаточно прочное связывание антилигандов с твердой фазой. Однако совершенно ясно, что одно это обстоятельство не обеспечивает надежность всей тест-системы без исследования и разработки специальных условий, которые необходимо соблюдать для обеспечения ее сохранности в течение достаточного времени особенно при транспортировке и хранении за пределами специализированных учреждений.

В состав ТР входят белковые соединения. Очевидно, что они являются объектами протеазной атаки в условиях бактериальной контаминации, избежать которой практически невозможно в условиях нестерильного производства и применения. При транспортировке и хранении готовых тест-систем неизбежно нахождение их в течение какого-то времени в условиях, отличных от идеальных. Отклонение температуры хранения от +4°С в сторону повышения ведет к резкой активации бактериального метаболизма с неизбежным появлением протеолиза, приводящего к биодеградации белковых антилигандов. Так, например, комплекс литических ферментов, продуцируемых Streptomyces levoris, в состав которого входят эндо-N-ацетилмурамидаза, эндопептидаза, нелитическая N-ацетилглюкозаминидаза и ряд пептидаз различной литической активности, способен быстро привести к деградации любые пептидные соединения вне зависимости от их конформационного состояния. Кроме того, температурные колебания, изменение влажности окружающей среды вызывают механическую деформацию пористого материала подложки, что также приводит к деструкции ТР. Фактически, это основные причины нестабильности тест-систем, плохой воспроизводимости результатов анализа, снижения чувствительности и специфичности и, как следствие, негативного отношения со стороны пользователей к тест-системам, выпускаемым отечественными производителями.

В инструкциях по применению отечественных тест-наборов указываются сроки хранения невскрытых наборов в течение времени, не превышающем 6 месяцев при строгом соблюдении температурного режима: +2-8°С. Данные по срокам хранения различных тест-систем приведены в табл.1.

Таблица 1.Сроки хранения различных тест-систем до и после вскрытия.№Тест-системыСрок хранения невскрытого набораСрок хранения вскрытого набора1.Набор реактивов для иммуноферментного анализа интерлейкина-10 человека «ИФА-IL-10», ООО «Цитокин», Санкт-Петербург, Россия.6 месяцев2 недели2.Набор реактивов для иммуноферментного анализа интерферона-гамма человека «ИФА-IFN-gamma», ООО «Цитокин», Санкт-Петербург, Россия.6 месяцев2 недели3.Набор реактивов для иммуноферментного анализа интерлейкина-4 человека «ИФА-IL-4», ООО «Цитокин», Санкт-Петербург, Россия.6 месяцев2 недели4.Набор реагентов «IgG-ИФА-БЕСТ-стрип», ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск, Россия.6 месяцев7 дней5.Набор реактивов для иммуноферментного анализа фактора некроза опухоли человека «ИФА-TNF-alfa», ООО «Цитокин», Санкт-Петербург, Россия.6 месяцев2 недели6.Набор реактивов для иммуноферментного анализа рецепторного антагониста интерлейкина-1 человека «ELISA-IL-1 Ra», ООО «Цитокин», Санкт-Петербург, Россия.6 месяцев2 недели7.Набор реактивов для иммуноферментного анализа «DRG IGF-1 600 ELISA», DRG Instruments GmbH, Германия.12 месяцев6 недель8.Иммуноферментный тест для количественного определения инсулина в сыворотке и плазме крови человека Insulin ELISA, Mercodia AB, Швеция.12 месяцев8 недель9.Иммуноферментный тест для количественного определения специфических антител класса IgG Helicobacter pylory GAP - IgG, «BIOMERICA», США.12 месяцев8 недель10.Иммуноферментный тест для количественного определения прогестерона в сыворотке или плазме крови человека Progesteron, HUMAN GmbH, Германия.12 месяцев8 недель

Отсутствие в доступной литературе каких бы то ни было сведений о способах стабилизации и защиты ТР, входящих в состав аналитических тест-систем, свидетельствует о чрезвычайной важности этой информации. В то же время, строгие условия хранения и транспортировки готовых наборов, выпускаемых отечественными фирмами, чрезвычайно короткий срок хранения вскрытых компонентов наборов однозначно говорят об отсутствии разработанных способов защиты ТР. Единственной формой относительной защиты можно считать герметичную упаковку твердофазного реагента в полиэтиленовые пакеты, в пакеты из фольгированного материала или флаконы [1-10].

Изобретение направлено на решение задачи стабилизации и защиты твердофазных реагентов, увеличения надежности и воспроизводимости аналитических тест-систем.

Поставленную задачу решают путем обработки твердофазного реагента олигосахаридами, предпочтительно, раствором сахарозы. Предлагаемые вещества химически инертны как к поверхности твердой фазы, так и по отношению к соединениям, выступающим в роли антилигандов, сорбируемым на поверхности твердой фазы, чрезвычайно легко растворяются в любых водных растворителях даже без использования детергентов. При этом сахароза легко доступна, относительно дешева и не требует никакой специальной стадии подготовки перед непосредственным использованием, а процедура обработки чрезвычайно проста и надежна.

После нанесения антилигандов на поверхность твердой фазы согласно существующим приемам и способам полученные твердофазные реагенты помещают в раствор сахарозы. Если речь идет о пористых носителях, то их просто помещают в емкости, заполненные раствором. Лунки непористых носителей, поверхность которых сенсибилизирована соответствующими антилигандами, просто заполняют раствором сахарозы. После инкубации твердофазные реагенты освобождают от присутствия раствора сахарозы и сушат при комнатной температуре.

Описанная процедура приводит к тому, что вся поверхность твердофазных реагентов оказывается под слоем высушенной сахарозы, молекулы которой являются, по сути, протектором, защищающим сорбированные антилиганды от внешнего вмешательства. Более того, «молекулярная сетка» сахарозы значительно улучшает механические свойства пористых носителей, защищая ТР от деформирующего воздействия.

В дальнейшем, перед непосредственным использованием в структуре аналитической процедуры обработанные описанным способом ТР помещают в любой отмывающий раствор, рекомендованный для конкретной тест-системы, вне зависимости от его состава. 15-минутной промывки на обычном шейкере с трехкратной сменой промывающего раствора достаточно для полного удаления сахарозы с поверхности твердофазного реагента.

В результате заявляемый способ позволяет получить твердофазные реагенты, входящие в структуру аналитических тест-систем, способны в течение длительного времени сохранять все свои свойства даже при существенных изменений условий окружающей среды.

Нижеследующие примеры распространяются не только на сахарозу, но и на другие соединения из класса олигосахаридов.

Способ защиты и стабилизации твердофазных реагентов иммуноаналитических систем иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Способ защиты и стабилизации твердофазных реагентов на основе пористых материалов.

В работе использовали полоски нитроцеллюлозы (Bio-Rad) с размерами пор 0,45 мкм, на которые наносили в виде пятен IgG человека, выполняющие роль антианалитов, из разведений, кратных двум, в 0,15 М фосфатном буферном растворе рН 7,25, начиная с концентрации 0,1 мг/мл в объеме 3 мкл. После полного высушивания полученных подобным образом ТР их помещали в водный раствор сахарозы с концентрацией 30%. Инкубацию осуществляли при комнатной температуре на шейкере с качающейся платформой в течение 60 минут. Обработанные ТР извлекали из раствора сахарозы, сушили при комнатной температуре и помещали на хранение при температуре +4°С и +22°С в пластиковых пакетах.

Качество сохранности твердофазных реагентов проверяли через 3 месяца. Для этого образцы хранимых при различных температурных условиях ТР помещали в стандартный фосфатный буферный раствор, содержащий 0,05% Твин 20 (ФБРТ). Обработку вели на шейкере при комнатной температуре в течение 15 минут (суммарно) с трехкратной сменой буфера. После чего отмытые ТР помещали для визуализации на 15 минут в конъюгат белок G - углерод. После промывки ФБРТ наблюдали результаты анализа в местах сорбции антианалитов. Параллельно осуществляли анализ свежеприготовленных ТР, не прошедших стадию обработки сахарозой и хранения. Аналогичные исследования проводили через 6, 9, 12 и 18 месяцев хранения.

Результатом проведения сравнительных экспериментов явилось определение 0,2 мкг/мл IgG человека в виде последней в ряду разведений визуализируемой точки во всех без исключения случаях.

Пример 2. Способ защиты и стабилизации твердофазных реагентов на основе непористых материалов, предназначенных для неинструментального анализа.

В работе использовали планшеты для серийных разведений фирмы Linbro (США), на плоское дно лунок которых наносили IgG человека, выполняющие роль антианалитов, из разведений, кратных двум, в 0,01 М карбонатно-бикарбонатном буферном растворе рН 9,6, начиная с концентрации 0,1 мг/мл каплями объемом 5 мкл. Сорбцию осуществляли во влажной камере при температуре 37°С в течение 30 минут. Капли аспирировали, а в лунки после полного высушивания вносили водный раствор сахарозы с концентрацией 30%.

Инкубацию осуществляли при комнатной температуре на шейкере с качающейся платформой в течение 60 минут. Обработанные ТР освобождали от раствора сахарозы, сушили при комнатной температуре и помещали на хранение при температуре +4°С и +22°С в пластиковых пакетах.

Качество сохранности твердофазных реагентов проверяли через 3 месяца. Для этого в лунки хранимых при различных температурных условиях ТР вносили стандартный фосфатный буферный раствор, содержащий 0,05% Твин 20 (ФБРТ). Обработку вели на шейкере при комнатной температуре в течение 15 минут (суммарно) с трехкратной сменой буфера. После чего в лунки отмытых ТР вносили для визуализации конъюгат белок G -углерод на 15 минут. После промывки ФБРТ наблюдали результаты анализа в виде черных пятен в местах сорбции антианалитов. Параллельно осуществляли анализ свежеприготовленных ТР, не прошедших стадию обработки сахарозой и хранения. Аналогичные исследования проводили через 6, 9, 12 и 18 месяцев хранения.

Результатом проведения сравнительных экспериментов явилось определение 1,5 мкг/мл IgG человека в виде последней в ряду разведений визуализируемой точки во всех без исключения случаях.

Пример 3. Способ защиты и стабилизации твердофазных реагентов на основе непористых материалов, предназначенных для инструментального иммуноферментного анализа.

В работе использовали планшеты для иммунологических реакций фирмы Costar (Великобритания), поверхность лунок которых сенсибилизировали растворами IgG человека, выполняющими роль антианалитов, из разведений, кратных двум, в 0,01 М карбонатно-бикарбонатном буферном растворе рН 9,6, начиная с концентрации 0,1 мг/мл из объемов 100 мкл. Сорбцию осуществляли во влажной камере при температуре 37°С в течение 120 минут. После удаления сенсибилизирующих растворов промывали лунки раствором ФБРТ и после полного высушивания вносили водный раствор сахарозы с концентрацией 30%. Инкубацию осуществляли при комнатной температуре на шейкере с вращательно-орбитальными движениями платформы в течение 60 минут. Обработанные планшеты освобождали от раствора сахарозы, сушили при комнатной температуре и помещали на хранение при температуре +4°С и +22°С в пластиковых пакетах.

Качество сохранности твердофазных реагентов проверяли через 3 месяца. Для этого лунки хранимых при различных температурных условиях планшетов отмывали ФБРТ. Отмывку вели на шейкере при комнатной температуре в течение 15 минут (суммарно) с трехкратной сменой буфера. После чего в лунки отмытых ТР вносили ферментный конъюгат белок G - пероксидаза хрена на 15 минут. В качестве субстрата для проявления ферментной реакции использовали ТМБ в стабилизированном растворе перекиси водорода. В качестве стоп-реагента использовали 0,5 М раствор серной кислоты, который вносили в лунки в количестве 50 мкл. Анализ результатов осуществляли с использованием планшетного фотометра BIOHIT ВР 800 при длине волны 450 нм.

Параллельно осуществляли анализ свеже сенсибилизированных планшетов, не прошедших стадию обработки сахарозой и хранения. Аналогичные исследования проводили через 6, 9, 12 и 18 месяцев хранения.

Результатом проведения сравнительных экспериментов явилось определение 0,05 мкг/мл в виде последней в ряду разведений точки, в два раза отличной от фона, во всех без исключения случаях.

Результаты аналогичных экспериментов с другими представителями класса олигосахаридов были идентичными.

Полученные результаты однозначно свидетельствуют о том, что использование предлагаемого изобретения чрезвычайно эффективно позволяет защищать сенсибилизированные поверхности твердофазных реагентов. Тот факт, что хранение ТР в течение 18 месяцев при комнатной температуре (+22°С) не влияет на качество анализа, позволяет определенно говорить о как минимум трехгодичном сроке успешной сохранности его при +4°С. Ни один из существующих тест-наборов из категории твердофазных аналитических систем не обладает сроком хранения, превышающим 12 месяцев.

Технико-экономическая эффективность предлагаемого изобретения заключается в существенном увеличении сроков эффективного хранения твердофазных реагентов, входящих в состав широкого спектра иммуноаналитических систем. При этом не имеет значения ни формат, ни аранжировка, ни характер аналитической направленности диагностикумов. Более того, практическая реализация предлагаемого изобретения позволяет решить проблему транспортировки готовых тест-наборов в течение длительного времени с возможными отклонениями от рекомендованных температурных режимов. Существенно удлиняется срок годности вскрытых наборов, позволяя фрагментарно использовать его, не ожидая сбора исчерпывающего количества тестируемых проб. Все это предопределяет решение наиболее важных проблем диагностического тестирования - надежности и воспроизводимости, существенным моментом которых является защищенность от ложноположительных и ложноотрицательных результатов, что особенно важно в отношении особо опасных и социально значимых заболеваний.

Источники информации

1. Инструкция по применению набора реактивов для иммуноферментного анализа интерлейкина-10 человека «ИФА-IL-IO», ООО «Цитокин», Санкт-Петербург, Россия.

2. Инструкция по применению набора реактивов для иммуноферментного анализа интерферона-гамма человека «ИФА-IFN-gamma», ООО «Цитокин», Санкт-Петербург, Россия.

3. Инструкция по применению набора реактивов для иммуноферментного анализа интерлейкина-4 человека «ИФА-Il-4», ООО «Цитокин», Санкт-Петербург, Россия.

4. Инструкция по применению набора реагентов «IgG-ИФА-БЕСТ-стрип», ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск, Россия.

5. Инструкция по применению набора реактивов для иммуноферментного анализа фактора некроза опухоли человека «ИФА-TNF-alfa», ООО «Цитокин», Санкт-Петербург, Россия.

6. Инструкция по применению набора реактивов для иммуноферментного анализа рецепторного антагониста интерлейкина-1 человека «ELISA-IL-1Ra», ООО «Цитокин», Санкт-Петербург, Россия.

7. Инструкция по применению набора реактивов для иммуноферментного анализа «DRG IGF-1 600 ELISA», DRG Instruments GmbH, Германия.

8. Иммуноферментный тест для количественного определения инсулина в сыворотке и плазме крови человека Insulin ELISA, Mercodia AB, Швеция.

9. Иммуноферментный тест для количественного определения специфических антител класса IgG Helicobacter pylory GAP - IgG, «BIOMERICA», США.

10. Иммуноферментный тест для количественного определения прогестерона в сыворотке или плазме крови человека Progesteron, HUMAN GmbH, Германия.

Настоящее изобретение относится к области иммунобиотехнологии, а именно к способу защиты и стабилизации твердофазных реагентов (ТР), входящих в состав аналитических тест-систем. Предложенный способ заключается в том, что ТР после сорбции на них антианалита и высушивания инкубируют в 30% водном растворе олигосахаридов, в частности сахарозе, в течение 60 минут при комнатной температуре в условиях перемешивания, после чего извлекают из указанного раствора и выдерживают при комнатной температуре до полного высушивания поверхности твердой фазы. Использование способа позволяет повысить срок хранения систем на основе ТР, даже при возможных отклонениях от оптимальных условий хранения, за счет образования долговременного защитного покрытия. 1 табл.

Способ защиты и стабилизации твердофазных реагентов иммуноаналитических систем, заключающийся в сорбции антианалита на твердой фазе и полном высушивании сенсибилизированной поверхности, отличающийся тем, что после сорбции и высушивания твердофазные реагенты инкубируют в 30% водном растворе олигосахаридов, в частности сахарозы, в течение 60 мин при комнатной температуре в условиях перемешивания, после чего извлекают из указанного раствора и выдерживают при комнатной температуре до полного высушивания поверхности твердой фазы.