СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НА NEOSPORA CANINUM Российский патент 2006 года по МПК G01N33/569 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к серологическому выявлению инфекции Neospora caninum посредством реакции сыворотки субъекта с белком, реагирующим с N.caninum.

Предпосылки создания изобретения

Neospora caninum и Toxoplasma gondii представляют собой близкородственные простейшие паразиты, вызывающие заболевание у множества животных. N.caninum рассматривают как причину выкидыша, дефектов конечностей неврологического характера и неонатальной смертности у крупного рогатого скота и других животных. T.gondii является основной причиной выкидыша у овец. Для эффективной борьбы с неоспорозом и токсоплазмозом требуется быстрая диагностика. В этой связи развитие эффективных диагностических тестов на N.caninum представляет собой решающий фактор.

Имеется ряд признанных тестов, доступных для выявления наличия у животного N.caninum. Однако диагностические тесты и методики для дифференциации между животными, которые являются по природе серопозитивными по N.caninum, и животными, которые подверглись вакцинации N.caninum и/или представляют собой серонегативные по N.caninum (невакцинированные) животные, до настоящего времени отсутствовали.

Краткое описание сущности изобретения

Настоящее изобретение, в первую очередь, относится к способу дифференциации по природе серопозитивного по N.caninum животного и животного, вакцинированного вакциной с N.caninum.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу выявления антител к Neospora caninum в образце сыворотки при контакте сыворотки с белком Toxoplasma gondii и к анализу сыворотки на наличие связанных антител.

Краткое описание фигур

На фиг. 1. показана реактивность вестерн-блоттов в сравнении с усеченным BAG1-GST.

Полоса 1: антисыворотка кролика, индуцированного полноразмерным BAG1-GST (положительный контроль).

Полоса 2: сыворотка от неиммунизированной серонегативной коровы (отрицательный контроль).

Полоса 3: объединенная антисыворотка, отобранная на 49 день от коров, иммунизированных убитой вакциной N.caninum.

Полоса 4: объединенная антисыворотка, отобранная на 49 день от коров, иммунизированных ослабленной вакциной N.caninum.

Полоса 5: объединенная антисыворотка, отобранная от природно-инфицированных серопозитивных коров.

Полоса 6: Маркеры молекулярной массы (кДа).

На фиг.2 показана реактивность вестерн-блоттов в сравнении с усеченным и полноразмерным BAG1-GST.

Полосы 1-4: усеченный антиген BAG1-GST.

Полоса 5: маркеры молекулярной массы (кДа).

Полосы 6-9: полноразмерный антиген BAG1-GST.

Полосы 1, 6: сыворотка от неиммунизированной серонегативной коровы (отрицательный контроль).

Полосы 2, 7: объединенная антисыворотка, отобранная на 119 день от коров, иммунизированных убитой вакциной N.caninum.

Полосы 3, 8: объединенная антисыворотка, отобранная на 119 день от коров, иммунизированных ослабленной вакциной N.caninum.

Полосы 4, 9: объединенная антисыворотка, отобранная от природно-инфицированных серопозитивных коров.

Полоса 5: маркеры молекулярной массы (кДа).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к аналитической системе, которая способна осуществлять дифференциацию между вакцинированными и по природе содержащими Neospora-положительными животными. В настоящем изобретении показано, что белки Toxoplasma gondii и N.caninum присутствуют только у серопозитивных по природе животных. Серонегативные по N.caninum животные и животные, которые предварительно подверглись вакцинации вакцинами на основе Neospora (см., например, серийную заявку на патент США № 09/260414 "Attenuated Live Neospora Vaccine", включенную в настоящее описание в качестве ссылки, и серийную заявку на патент США № 09/138985 "Neospora Vaccine", включенную в настоящее описание в качестве ссылки), могут быть теперь идентифицированы и отделены от серопозитивных (т.е. по природе содержащих) животных на основании результатов анализа, проводимого в соответствии со способами согласно настоящему изобретению.

Сыворотки от животных, содержащих N.caninum, будут реагировать с белками Toxoplasma gondii и N.caninum и их фрагментами. Термин «реагировать» означает наличие выявляемого комплекса антиген-антитело. Образование комплекса антиген-антитело является показательным для животного, природно-инфицированного N.caninum. Сыворотки от животных, предварительно вакцинированных N.caninum, и сыворотки от животных, которые являются по природе серонегативными по N.caninum, не будут реагировать с белками Toxoplasma gondii и N.caninum и их фрагментами. Соответственно, настоящее изобретение относится к способу дифференциации между вакцинированными (серонегативными) и по природе содержащими Neospora caninum серопозитивными животными.

Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением, серопозитивные по N.caninum животные могут быть, при желании, вакцинированы на основании результатов анализа согласно настоящему изобретению. Животные, охватываемые настоящим изобретением, включают в себя крупный рогатый скот, телят, быков, коров и волов. Предпочтительно способ согласно настоящему изобретению применим к коровам и наиболее предпочтительно, к телятам.

В соответствии с настоящим изобретением, любой очищенный, нативный или рекомбинантный брадизоитный антиген или его фрагмент из Toxoplasma gondii или Neospora caninum может использоваться в качестве выявляемого антигена в рамках серологического анализа согласно настоящему изобретению. Термин «фрагмент» означает пептидную часть полноразмерного белка из T.gondii или N.caninum, который содержит эпитоп, распознаваемый антителами, имеющимися в сыворотках животных. Усеченные формы полноразмерных белков из T.gondii и N.caninum также охватываются понятием фрагменты согласно настоящему изобретению.

В одном варианте осуществления изобретения полноразмерный брадизоитный антиген, представляющий собой белок слияния глютатион-S-трансферазы (GST) и BAG-1, является выявляемым антигеном (SEQ ID NO.2). В другом варианте осуществления изобретения усеченный белок слияния BAG-1-GST, лишенный 28 аминокислот на N-конце BAG-1, является выявляемым антигеном (SEQ ID NO.3). BAG-1 также известен в данной области как BAG-5. В настоящем изобретении утверждается, что антисыворотки из животного, природно-инфицированного N.caninum, или антисыворотки из животного, вакцинированного N.caninum, или неинфицированные антисыворотки могут быть использованы в качестве образца для тестирования.

Реактивность брадизоитного антигена или его фрагмента при иммобилизации на твердой подложке можно определить по способу, основанному на обнаружении антител к N.caninum в соответствии с настоящим изобретением. Конкретно, способы согласно изобретению могут быть осуществлены посредством контакта образца сыворотки животного с брадизоитным белком или его фрагментном, которые затем вступают в реакцию с образованием комплекса антиген-антитело, с последующим анализом полученного в результате реакции комплекса традиционными методами выявления и количественной оценки. Термин «антитело» означает молекулу иммуноглобулина, способную связываться с определенным эпитопом на антигене. Антитела могут представлять собой смесь поликлональных антител или могут быть моноклональными. Антитела могут представлять собой интактные иммуноглобулины, полученные из природных источников или из рекомбинантных источников, и могут представлять собой иммунологически реактивные части интактных иммуноглобулинов.

Известны многочисленные способы определения количества и/или наличия или отсутствия комплекса антиген-антитело, и все они охватываются настоящим изобретением. Например, может проводиться вестерн-блоттинг путем присоединения антигена к твердой подложке, такой как нитроцеллюлозная бумага, инкубирования бумаги с образцом исследуемой сыворотки, с последующим определением на нитроцеллюлозной бумаге наличия или отсутствия определенной полосы белка с ожидаемой молекулярной массой, соответствующей полноразмерному белку (примерно 55 кДа) или усеченному белку (примерно 51 кДа) BAG1-GST из T.gondii. Наличие полосы в положении, соответствующем любой ожидаемой молекулярной массе, указывает на то, что исследуемое животное является серопозитивным по N.caninum. И наоборот, отсутствие полосы в положении, соответствующем любой ожидаемой молекулярной массе, указывает на то, что исследуемое животное вакцинировано.

Настоящее изобретение относится также к вестерн-блотт-анализу, при котором антиген присоединяют к нитроцеллюлозной бумаге и антиген окрашивают антителом, которое содержит присоединенный к нему краситель. Может также использоваться иммуноферментный твердофазный анализ (ИФТФА, ELISA), при котором антиген или антитело метят ферментом. Настоящее изобретение также относится к радиоиммуноанализу, при котором антиген или антитело метят радиоактивным элементом.

Настоящее изобретение относится к способу исследования сыворотки животного с целью определения наличия/количества или отсутствия антител к N.caninum. Так, в соответствии с настоящим изобретением может быть подготовлен диагностический набор, содержащий реактивы и контроли для обнаружения положительных и/или отрицательных реакций.

Для специалистов в данной области очевидно, что в настоящее изобретение могут быть введены различные вариации и/или модификации, как видно из приведенных конкретных вариантов его осуществления, без отступления от принципов и тематики настоящего изобретения, которое следует рассматривать в широком диапазоне. Исходя из этого, приведенные конкретные варианты его осуществления следует рассматривать во всех отношениях как иллюстративные и не ограничивающие настоящее изобретение.

ПРИМЕР 1

Антисыворотка из серонегативных по N.caninum,

вакцинированных с использованием N.caninum животных

Может использоваться любой образец сыворотки от серонегативного или ПЦР-негативного животного, которому впоследствии вводят тахизоитную живую модифицированную, убитую вакцину N.caninum или ее субъединичный вариант. В данном примере было определено, что четырехмесячные телята являются серонегативными на основании диагностики методом ИФТФА, проведенной в квалифицированной ветеринарной диагностической лаборатории (Washington State Diagnostic Lab, Pullman, WA). Телят вакцинируют на день 0 и 21 день тахизоитной либо i) модифицированной живой ослабленной вакциной Neospora (серийная заявка на патент USPTO 09/260414 "Attenuated Live Neospora Vaccine", включенная в настоящее описание в качестве ссылки), либо ii) инактивированной вакциной из гомогената цельных клеток Neospora (серийная заявка на патент USPTO 09/138985 "Neospora Vaccine", включенная в настоящее описание в качестве ссылки). Обе вакцины основаны на тахизоитных антигенах в качестве защитного компонента вакцины. Модифицированная живая ослабленная вакцина N.caninum содержит 5×10⁷ Ncts-8 тахизоитов на дозу, ее вводят подкожно 3 серонегативным животным. Инактивированную вакцину на основе гомогената N.caninum, которая содержит 100 мкг общего белка тахизоита/дозу, приготовлена на основе сапонинового адъюванта (750 мкг Quil A/150 мкг холестерина), вводят подкожно 3 серонегативным животным. На 49 и 119 день после вакцинации отбирают сыворотку у трех телят в каждой группе, рассчитанной на каждый вариант вакцины, объединяют и замораживают в аликвотах при -20°С до момента исследования методом серологического анализа (см. пример 4).

ПРИМЕР 2

Антисыворотки из природно инфицированных

N.caninum, серопозитивных животных

Может использоваться любой образец сыворотки от природно-инфицированного, серопозитивного или ПЦР-позитивного животного. В данном примере серологический статус индивидуальных животных из коммерческой фермы (в стаде крупного рогатого скота) определяют на основании диагностики методом ИФТФА, проведенной в квалифицированной ветеринарной диагностической лаборатории (Washington State Diagnostic Lab, Pullman, WA). Двадцать одно животное было идентифицировано по результатам данного теста как серопозитивное. Отбирают образец сыворотки у каждого серопозитивного животного, объединяют образцы и замораживают в аликвотах при -20°С до момента исследования методом серологического анализа (см. пример 4).

ПРИМЕР 3

Брадизоитный антиген, использованный

в серологическом тесте с Neospora

Может использоваться любой очищенный нативный или рекомбинантный брадизоитный белок из Neospora caninum или Toxoplasma gondii (брадизоитный белок BAG1 из T.gondii, номер хранения в Генбанке (Genebank) № U23944). В данном примере используют две различные рекомбинантные формы брадизоитного антигена из T.gondii, BAG1 (также известный как BAG5). Первая форма представляет собой полноразмерный белок слияния BAG1-глутатион-S-трансферазы (GST), который экспрессируется в E.coli и был выделен из нее и очищен с помощью аффинной хроматографии (S.F.Parmley, et al. 1995. Mol. Biochem. Parasit. 73: 253-257, включенная в настоящее описание в качестве ссылки). Вторая форма представляет собой усеченный белок слияния BAG1-GST, лишенный первых 28 аминокислот, который экспрессируется в E.coli и был выделен из нее и очищен с помощью аффинной хроматографии (Parmley, et al. 1995). Очищенный рекомбинантный полноразмерный белок BAG1-GST и усеченный белок BAG1-GST хранят в замороженном состоянии при -20°С до момента исследования методом серологического анализа (см. пример 4).

ПРИМЕР 4

Серологический анализ

Может использоваться любой известный в данной области тест, основанный на выявлении антитела (ИФТФА, метод конкурентного ИФТФА, РИА, вестерн-блоттинг и т.п.). В данном примере используют вестерн-блоттинг. Подвергают оттаиванию всего 5 мг рекомбинантного полноразмерного белка BAG1-GST или усеченного BAG1-GST из T.gondii, смешивают с 5X денатурирующим буфером для образца (Pierce, IL) и наносят на преформированный Трис-глициновый непрерывный гель в градиенте 4-20% (1 мм × 2 ячейки) (Novex, San Diego, CA). Гель разгоняют в соответствии с инструкцией производителя под напряжением 125 В в течение 1,5 часа. Далее гель переносят на 20 мкМ нитроцеллюлозные пластины (Bio-Read, Hercules, CA) при 25 В в течение 1 часа. Пластины сушат и нарезают на равные по длине/ширине полоски. Полоски инкубируют в течение ночи при комнатной температуре в блокирующем растворе (5% сепарированное молоко в фосфатно-буферном растворе (ФБР)), промывают ФБР и затем инкубируют с образцом исследуемой сыворотки (из приведенного выше примера 1 или 2).

Аликвоты образцов исследуемой сыворотки из примера 1 или 2 подвергают оттаиванию при комнатной температуре, и делают разбавление 1:200 свежеприготовленным ФБР. Сыворотку от неиммунизированной серонегативной коровы используют в качестве отрицательного контроля (разбавление 1:200). Антисыворотку кролика против полноразмерного BAG1-GST используют в качестве положительного контроля (любезно была предоставлена M.McAllister; M.McAllister, et al, 1996. J. Parasitol. 82(2): 354-355), разбавляя ее 1:12500 ФБР перед использованием.

Добавляют к каждому образцу разбавленной сыворотки индивидуальную тест-полоску (приготовленную в примере 3) и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре. Полоски быстро промывают два раза ФБР, содержащим 0,05% Твин 20 (PBST) и добавляют к раствору, содержащему в разбавлении 1:400 (в ФБР) очищенный методом аффинной хроматографии меченный фосфатазой козий анти-бычий IgG (KPL, Gaithersburg, MD). После 1-часовой инкубации при комнатной температуре указанные полоски быстро промывают два раза в PBST и затем инкубируют в фосфатазном субстрате, BCIP/NBT (KPL, Gaithersburg, MD). После развития соответствующей окраски (примерно через 10 минут) ферментативную реакцию останавливают, помещая полоски ненадолго в дистиллированную воду. Затем полоски сушат на воздухе. Результаты анализа проиллюстрированы на фиг. 1.

ПРИМЕР 5

Интерпретация результатов серологического анализа

Положительный результат серологического анализа указывает на наличие специфической реакции между образцом исследуемой сыворотки и брадизоитным антигеном из N.caninum или T.gondii. В данном примере полоски, использованные в примере 4, изучают с целью выявления специфической реакции, определяя наличие специфических полос, соответствующих ожидаемой молекулярной массе полноразмерного белка BAG1-GST (примерно 55 кДа) или усеченного белка BAG1-GST (51 кДа) из T.gondii.

Как видно из фиг. 1, линия 5, полоса, соответствующая примерно 52-55 кДа, отмечается в полоске, инкубированной с объединенными сыворотками из природно содержащих N.caninum, инфицированных животных (крупный рогатый скот), указывая на наличие специфической реакции между природно содержащим N.caninum, инфицированным серопозитивным образцом и усеченным брадизоитным антигеном BAG1-GST. И наоборот, в линиях 3 и 4 на фиг. 1 не отмечается реактивности против белка BAG1-GST размером 55 кДа, что указывает на отсутствие специфической реакции с любым образцом, взятым после вакцинации N. caninum.

Как видно из фиг.2, линии 4 и 9, полоса, соответствующая примерно 52-55 кДа, отмечается в полосках, инкубированных с объединенными сыворотками из природно содержащих N.caninum, инфицированных животных (крупный рогатый скот), что указывает на наличие специфической реакции между природно содержащим N.caninum, инфицированным серопозитивным образцом и усеченным (линия 4) или полноразмерным (линия 9) брадизоитным антигеном BAG1-GST. И наоборот, в линиях 2 и 7 на фиг. 2 не отмечается реактивности ни против какой из форм белка BAG1-GST при использовании объединенной антисыворотки, отобранной на 119 день у коров, иммунизированных убитой вакциной N.caninum. Аналогично, в линиях 3 и 8 на фиг. 2 не отмечается реактивности против какой бы то ни было из форм белка BAG1-GST при использовании объединенной антисыворотки, отобранной на 119 день у коров, иммунизированных ослабленной вакциной N. caninum.

Различие в реактивности по отношении к рекомбинантному брадизоитному антигену из T.gondii, описанное в настоящем изобретении, показывает, что серологический анализ с использованием брадизоитного антигена может использоваться для дифференциации, или диагностики, животного, природно-инфицированного N.caninum, от животного, вакцинированного N.caninum. Любой очищенный, нативный или рекомбинантный брадизоитный антиген или его фрагмент из N.caninum (например, SEQ ID No. 1 или 2) или другой фрагмент из N.caninum (например, SEQ ID No.3 или 4) может использоваться в качестве выявляемого антигена в данном диагностическом тесте. Любые антисыворотки из животных, природно инфицированных N.caninum или вакцинированных N.caninum, могут использоваться в качестве исследуемого образца в данном диагностическом тесте.

Изобретение относится к области ветеринарии и касается серологического анализа на Neospora caninum у животных. Сущность изобретения заключается в выявлении посредством иммуноферментного твердофазного анализа, радиоиммунного анализа, вестерн-блоттинга взаимодействия сыворотки животных с белком, реактивным в отношении Neospora caninum животных, серопозитивных по указанному паразиту. В качестве белка используют нативный или рекомбинатный брадизоитный полноразмерный белок слияния из N. caninum или Toxoplasma gondii или усеченный белок слияния или его фрагмент. Преимущество изобретения заключается в серологическом выявлении животных, серопозитивных по N. caninum, отличных от вакцинированных животных. 4 н. и 10 н.п. ф-лы, 2 ил.

1. Способ дифференциации животного, природно серопозитивного по N.caninum, от животного, вакцинированного вакциной с Neospora, включающий в себя получение образца сыворотки от животного и приведение указанной сыворотки в контакт с брадизоитным белком из Toxoplasma gondii, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, которые затем вступают в реакцию с образованием комплекса антиген - антитело, и анализ сыворотки на наличие связанного антитела, где животное, природно серопозитивное по N. caninum, проявляет специфическую реакцию в отношении указанного антигена в отличие от животного, образец сыворотки которого взят после вакцинации этого животного N. caninum.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный белок из Toxoplasma gondii содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный белок из Toxoplasma gondii представляет собой BAG-1.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный белок из Toxoplasma gondii представляет собой BAG-5.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный белок присоединен к подложке.6. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия анализа белка на наличие связанного антитела проводится методом вестерн-блоттинга.7. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия анализа белка на наличие связанного антитела проводится методом радиоиммуноанализа.8. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия анализа белка на наличие связанного антитела проводится методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).9. Способ по п.1, дополнительно включающий в себя количественное определение уровня антитела, связанного с белком.10. Способ диагностики животного, в отношении которого предполагается инфицирование N.caninum, включающий в себя получение образца сыворотки от указанного животного, приведение указанной сыворотки в контакт с брадизоитным белком из Toxoplasma gondii, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, которые затем вступают в реакцию с образованием комплекса антиген - антитело, и анализ сыворотки методами выявления и количественной оценки, включая методы вестерн-блоттинга, радиоиммуноанализа и ELISA, на наличие связанного антитела, где животное, природно серопозитивное по N.caninum, проявляет специфическую реакцию в отношении указанного антигена в отличие от животного, образец сыворотки которого взят после вакцинации этого животного N.caninum.11. Способ по п.10, отличающийся тем, что указанный белок из Toxoplasma gondii содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.12. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанный белок из Toxoplasma gondii представляет собой BAG-1 или BAG-5.13. Способ выявления антител к Neospora caninum в образце сыворотки, включающий в себя приведение сыворотки в контакт с брадизоитным белком или его фрагментом из Toxoplasma gondii, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, которые затем вступают в реакцию с образованием комплекса антиген - антитело, и анализ сыворотки методами выявления и количественной оценки, включая методы вестерн-блоттинга, радиоиммуноанализа и ELISA, на наличие связанного антитела.14. Способ дифференциации животного, природно серопозитивного по N. caninum, от животного, вакцинированного вакциной с Neospora, включающий в себя получение образца сыворотки от животного, приведение указанной сыворотки в контакт с фрагментом брадизоитного белка из Toxoplasma gondii, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, которые затем вступают в реакцию с образованием комплекса антиген - антитело, и анализ сыворотки методами выявления и количественной оценки, включая методы вестерн-блоттинга, радиоиммуноанализа и ELISA, на наличие связанного антитела, где животное, природно серопозитивное по N. caninum, проявляет специфическую реакцию в отношении указанного антигена в отличие от животного, образец сыворотки которого взят после вакцинации этого животного N.caninum.