СПОСОБ БИОЛОГИЧЕСКОЙ РЕМЕДИАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ Российский патент 2006 года по МПК B09C1/10 C12N1/26 

Изобретение относится к биотехнологии, ремедиации загрязненных земель и предназначено для восстановления почв, загрязненных сырой нефтью и нефтепродуктами.

Известен способ очистки почвы от нефти и нефтепродуктов, предусматривающий обработку очищаемой почвы от нефти и нефтепродуктов микроорганизмами Rhodococcum erythropolis АС-1339 Д с питательной средой. Перед внесением микроорганизмов с питательной средой в очищаемую почву вносят высокомолекулярные кислоты (ВМК), обладающие ростстимулирующим действием, полученные путем окисления керогена сланцев в водно-щелочных средах (патент РФ №2160718).

Недостатком известного способа является применение дорогостоящих ВМК, полученных путем окисления керогена сланцев в водно-щелочной среде.

Наиболее близким по техническому решению является способ биоремедиации нефтезагрязненных почв путем обработки почвы бакпрепаратами и посев семян бобовых и злаковых культур растений, предварительно обработанных раствором бакпрепаратов, содержащих Actinomycetes sp.1-96A АбЗТ Биофлора №В-05 и Azotobacter chroococcum ВКПМ, некорневой подкормкой вегетирующих растений минеральными удобрениями. Для обработки почвы используют вышеуказанные препараты с добавлением дополнительных бакпрепаратов, включающих Bacillus mucitaginosus ВКПМ В-5987 и консорциум ВКПМ 5972. состоящего из Streptococcus thermophitus. Streptococcus bobis, Lactobacillus salivanius rear. salicinicus, Lactobacillus saliresriums var salicinicus, Lactobacillus saliuarius var salivanius, Lactobacillus thermophilus и использование для роста растений активатора Эль-1 заводского изготовления (патент РФ №2176164).

Недостатком указанного способа является обработка семян жидкими бакпрепаратами, что требует немедленного их внесения в почву, так как от длительного хранения они теряют активность. Поэтому бактериальные препараты можно применять только на ближайшем расстоянии от пункта их приготовления, а на большие расстояния - жидкие препараты изготовлять не рекомендуется. Кроме того, внесение большого количества биопрепаратов (8 видов), а также использование для роста растений активатора Эль-1 заводского изготовления требуются определенные затраты, что удорожает использование данного способа.

Задачей изобретения является разработка технологии биологической ремедиации нефтезагрязненных почв, обеспечивающая разложение нефтепродуктов в почве, с наименьшими затратами как физическими, так и материальными.

Технический результат - создание устойчивого травостоя на почве после разложения нефтепродуктов.

Технический результат поставленной задачи достигается тем, что в способе биологической ремедиации нефтезагрязненных почв, включающий обработку почвы бакпрепаратами, посев смеси семян бобовых и злаковых культур, предварительно обработанных регулятором роста растений, согласно изобретению почву обрабатывают сухим бакпрепаратом с наполнителем в количестве 50 кг/га, в котором в качестве микроорганизмов используют штамм Pseudomonas fluorescens КО ВНИИСХМ Д-619 и штамм Pseudomonas aeruginosa КОА-3 ВНИИСХМ Д-609 в соотношении 1:1, а в качестве наполнителя используют отходы бурого угля, при этом в качестве регулятора роста растений используют сухой бакпрепарат на основе Azotobacter chroococcum Mut-1 ВНИИСХМ В-35 Д, Bacillus megaterium КС-1 ВНИИСХМ В-135 Д в количестве 2 кг/га и соотношении бактериальных культур 1:1.

При этом бакпрепараты Azotobacter chroococcum Mut-1 ВНИИСХМ В-35 Д Bacillus megaterium КС-1 ВНИИСХМ В-135 Д содержат гуминовые, карбоновые, аминокислоты, полисахариды, витамины группы В.

Штамм микроорганизмов Pseudomonas fluorescens КО ВНИИСХМ Д-619 депонирован 20.04.2004 под регистрационным номером Д-619 в группе эпифитных, микроорганизмов и находится в коллекции ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии.

Штамм микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa КОА-3 ВНИИСХМ Д-609 депонирован 02.08.2002 под регистрационным номером "Д-609 ВНИИСХМ" в группе эпифитных микроорганизмов и находится в коллекции ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии.

Штамм Bacillus megaterium КС-1 ВНИИСХМ В-135 Д депонирован 14.05.1999 г.в группе споровых микроорганизмов под регистрационным номером "ВНИИСХМ В-135 Д" 14 мая 1999 г.в коллекции ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии.

Штамм Azotobacter chroococcum Mut-1 ВНИИСХМ В-35 Д депонирован 14.05 1999 г. под регистрационным номером "ВНИИСХМ В-35 Д" в группе азотфиксирующих микроорганизмов в коллекции ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии.

Использование сухих бактериальных препаратов Pseudomonas aeruginosa КОА-3 ВНИИСХМ Д-609, Pseudomonas fluorescens КО ВНИИСХМ Д-619 для биологической ремедиации нефтезагрязненных почв с наполнителем совместно с обработкой семян перед посевом бакпрепаратом, содержищим Azotobacter chroococcum Mut-1 ВНИИСХМ В-35 Д, Bacillus megaterium КС-1 ВНИИСХМ В-135 Д, позволяет не только уменьшить затраты материальные и физические по ремедиации, но и добиться разложения нефтепродуктов в почве, при этом осуществить это за вегетационный период и создать устойчивый травостой.

Заявляемый способ реализуется следующим образом.

Пример 1. Почву, загрязненную мазутом (содержание мазута 13%) на спланированном и выровненном участке, обрабатывали сухим бакпрепаратом с наполнителем, содержащим бактериальные культуры Pseudomonas fluorescens КО ВНИИСХМ Д-619 и Pseudomonas aeruginosa КОА-3 ВНИИСХМ Д-609, взятых в соотношении 1:1, а в качестве наполнителя использовали отходы бурого угля, содержащие комплекс всех микроэлементов, необходимых для роста и развития растений.

Количество препарата по сухому весу составило 50 кг/га. Бактериальный титр равен 10⁹.

После внесения в почву сухих бактериальных препаратов проводили рыхление на глубину корнеобитаемого слоя ˜15 см для улучшения физического режима влагоемкости и улучшения аэрации. Через неделю (7 дней) обработанный участок засевали смесью семян, состоящей из овсяницы луговой - 40%, вики, гороха, овса по 20%, предварительно обрабатанных сухим бакпрепаратом, содержащим культуру Azotobacter chroococcum Mut-1 ВНИИСХМ В-35 Д, содержащей регуляторы роста растений (гуминовые, карбоновые, аминокислоты, полисахариды, витамины группы В), и культуру Bacillus megaterium КС-1 ВНИИСХМ В-135 Д, также стимулирующей рост растений. Бактериальные культуры Azotobacter chroococcum Mut-1 ВНИИСХМ В-35 Д Bacillus megaterium КС-1 ВНИИСХМ В-135 Д берут в соотношении 1:1.

Количество сухого препарата, содержащего культуру Azotobacter chroococcum Mut-1 ВНИИСХМ В-35 Д и культуру Bacillus megaterium КС-1 ВНИИСХМ В-135 Д с содержанием бактериальных клеток в 1 г - 10⁹ составило 2 кг/га. Соотношение бактериальных культур в препарате 1:1.

Контрольный участок загрязненной земли засевали тем же составом семян в том же количестве, без обработки бактериальными препаратами.

Опыт проводили в диапазоне температуры от 17 до 25°С. Всходы на опытном участке появились на 5-7 день.

Морфофизиологические и биометрические обследования посевов проводили в процессе роста и развития растений при определении динамики содержания нефтезагрязнителя в почве и микробиологическом анализе почвы.

Результаты представлены в таблице 1.

В таблице 1 приведены результаты роста опытных растений в контроле (без обработки бакпрепаратами) и в опыте (предлагаемым способом). Результаты опыта сравнивались с прототипом. Из таблицы видно, что в контроле появление всходов было единичным. В прототипе всходы появились на 7-10 день, в опыте на 4-6 день. Плотность травостоя в контроле через 30 дней составила в количестве 5 шт. на 1 дм², в прототипе - 49 шт., в опыте - 75 шт. После перезимовки рост растений в контроле отсутствует, а в прототипе - сплошной газон, в опыте - гутой сплошной газон.

В таблице 2 приведены результаты разложения мазута микроорганизмами.

Были проведены следующие варианты опытов: на почве, не загрязненной мазутом, контроль, без обработки препаратами, по прототипу, предлагаемым способом. Как видно из таблицы, в почве, не загрязненной мазутом, количество бактерий после обработки почвы бакпрепаратами через 3 месяца возросло с 5,2·10⁶ до 6,8·10⁶ в 1 г почвы. Количество мазута в контроле через 3 месяца снизилось со 100 до 98,7%, в прототипе - со 100 до 11,7%, в предлагаемом способе - со 100 до 0,08%. В такой же степени наблюдалось увеличение численности микроорганизмов в почве, т.е. в контроле количество микроорганизмов повысилось незначительно за 3 месяца с 0,1·10⁴ до 0,1·10⁵. В прототипе количество микроорганизмов повысилось с 0,2·10⁵ до 0,5·10⁵. В предлагаемом способе отмечалось значительное повышение количества микроорганизмов с 0,1·10⁴ до 3,7·10⁶.

Таблица 1Варианты опытаПоявление всходов, шт.Плотность травостоя на 1 дм² через 30 дней, шт.Число растений после перезимовкиКонтрольЕдиничные5"Черный пар"Прототипна 7-10 день49Сплошной газонПредлагаемый способна 4-6 день75Густой сплошной газонТаблица 2Варианты опытаСодержание мазута в почве через:Динамика численности микроорганизмов в почве (в 1 г) через:до обработки, %3 недели, %№ месяца, %до обработки3 недели3 месяцаПочва не загрязненная---5,2·10⁶6,3·10⁶6,8·10⁶Контроль10010098,70,1·10⁴0,1·10⁵0,1·10⁵Прототип10088,311,70,2·10⁵0,2·10⁵0,5·10⁵Предлагаемый способ10075,40,080,1·10⁴0,4·10⁶3,7·10⁶

Пример 2.

Почву, загрязненную гудроном (11%), подготовленную и обработанную сухим бакпрепаратом, содержащим бактериальные культуры Pseudomonas fluorescens КО ВНИ-ИСХМ Д-619 и Pseudomonas aeruginosa КОА-3 ВНИИСХМ Д-609, взятых в соотношении 1:1, и наполнитель, в качестве которого использовали отходы бурого угля, содержащие комплекс всех микроэлементов, необходимых для роста и развития растений. Количество бакпрепарата составило 50 кг/га с бактериальным титром 10⁹. После внесения в почву сухих бакпрепаратов на опытных участках проводилось рыхление на глубину корнеобитаемого слоя ˜15 см. Через неделю (7 дней) обработанный участок засевали смесью семян, состоящей из овсяницы луговой - 50%, вики - 40%, житняка - 10%, обработанных сухим бактериальным препаратом, содержащим культуру Azotobacter chroococcum Mut-1 ВНИИСХМ В-35 Д и культуру Bacillus megaterium КС-1 ВНИИСХМ В-135 Д. Количество препарата составило 2 кг/га, содержание бактериальных клеток в 1 г - 10⁹. Соотношение бактериальных культур в препарате 1:1. Результаты представлены в таблице 3.

Из таблицы 3 видно, что в контроле, без обработки почвы бакпрепаратами появление всходов отмечалось единичное: плотность травостоя через 30 дней была минимальной - 3 шт. на 1 дм². В прототипе появление всходов растений было на 9-11 день; плотность травостоя через 30 дней была 38 шт. на 1 дм². После перезимовки на участке был почти сплошной газон. В опыте по предлагаемому всходы взошли на 7-8 день, плотность травостоя на 1 дм² через 30 дней равнялась 54 шт., а после перезимовки - рос сплошной газон.

В таблице 4 представлено содержание гудрона в почве в течение вегетационного периода роста растений, через 3 недели и через 3 месяца и динамика численности микроорганизмов в почве до обработки, через 1 и 3 месяца. В почве, не загрязненной гудроном, количество микроорганизмов до обработки составило 6,1·10⁶, через 1 месяц - 6,7·10⁶; через 3 месяца 7,4·10⁶. В контроле без обработки бакпрепаратом количество гудрона за 3 месяца не снизилось. Количество микроорганизмов до обработки составило 0,5·10⁶, через 1 и 3 месяца вырастали единичные колонии микроорганизмов. Количество гудрона в прототипе через 3 недели снизилось со 100 до 85%, через 3 месяца до 68,4%. По предлагаемому способу количество гудрона снизилось в почве через 3 недели до 77,9%, через 3 месяца до 10,0%. Количество микроорганизмов в почве в предлагаемом способе по сравнению с прототипом также резко отличалось как через 1 месяц, так и через 3 месяца обследования. Если в прототипе количество микроорганизмов до обработки было 0,4·10, в предлагаемом - 0,5·10⁶, то через 3 месяца количество микроорганизмов в почве резко отличалось как через 1 месяц, так и через 3 месяца обследования.

Если в прототипе количество микроорганизмов до обработки было 0,4·10⁵, в предлагаемом способе 0,5·10⁶, то через 3 месяца количество микроорганизмов в почве по предлагаемому способу резко возросло до 1,5·10⁶ по сравнению с прототипом (0,6·10⁵), что указывает на хорошие результаты по сравнению с прототипом.

Таблица 3Варианты опытаПоявление всходов, шт.Плотность травостоя на 1 дм² через 30 дней, шт.Число растений после перезимовкиКонтрольЕдиничные3"Черный пар"Прототипна 9-11 день38Почти сплошной газонПредлагаемый способна 7-8 день54Густой сплошной газонТаблица 4Варианты опытаСодержание гудрона в почве через:Динамика численности микроорганизмов в почве (в 1 г) через:до обработки, %3 недели, %№ месяца, %до обработки3 недели3 месяцаПочва не загрязненная---6,1·10⁶6,7·10⁶7,4·10⁶Контроль1001001000,5·10⁶единичные колонииединичные колонииПрототип10085,068,40,4·10⁵0,7·10⁵0,6·10⁵Предлагаемый способ10077,910,00,5·10⁶0,9·10⁵1,5·10⁵

Пример 3.

Почву, загрязненную мазутом (содержание 13%) и гудроном (содержание гудрона 11%), на спланированном и выровненном участке проводили работы аналогично примеру 1.

После внесения в почву бакпрепаратов проводилось рыхление на глубину ˜15 см. Через неделю обработанный участок засевали смесью семян овса, гороха, вики в соотношении 1:1:1, предварительно обработанных сухим препаратом, содержащим культуру Azotobacter chroococcum Mut-1 ВНИИСХМ В-35 Д и культуру Bacillus megaterium КС-1 ВНИИСХМ В-135 Д.

Контрольный участок, содержащий тот же состав (мазут и гудрон), засевали тем же составом семян в том же количестве, но обработку бакпрепаратами не производили. Смесь овса, гороха, и вики была высеяна на участке в соотношении 1:1:1.

Результаты приведены в таблице 5 и 6. Как видно из таблиц 5 и 6, появление всходов растений в контроле (без обработки бакпрепаратами) было единичным и плотность травостоя на 1 дм³ через 30 дней равнялась 4. После перезимовки растения на участке не росли. В опыте по предлагаемому способу появление всходов растений отмечалось на 6-8 день. Плотность травостоя на 1 дм³ через 30 дней составила 70%, а после перезимовки в опыте отмечается сплошной газон растений. Содержание гудрона и мазута в почве в контрольном участке оставалось в течение 3 месяцев в количестве 100%. В опыте через 3 месяца их количество уменьшилось со 100 до 6,0%. Численность микроорганизмов в опыте также значительно увеличилось за 3 месяца с 0,8·10⁶ до 1,7·10⁶. В контроле, наоборот, количество микроорганизмов резко снизилось через 3 месяца. В почве с контрольного участка вырастали только единичные колонии микроорганизмов.

Таким образом, как показали испытания, количество мазута и гудрона под влиянием внесенных микроорганизмов Pseudomonas fluorescens КО ВНИИСХМ Д-619 и Pseudomonas aeruginosa КОА-3 ВНИИСХМ Д-609 резко снизилось за 3 месяца по сравнению с прототипом, при этом количество микроорганизмов резко возросло за 3 месяца, в прототипе увеличение количества микроорганизмов было незначительным.

Таблица 5Варианты опытаПоявление всходов, шт.Плотность травостоя на 1 дм² через 30 дней, шт.Число растений после перезимовкиКонтрольЕдиничные4"Черный пар"Предлагаемый способна 6-8 день70Сплошной газонТаблица 6Варианты опытаСодержание мазута в почве через:Динамика численности микроорганизмов в почве (в 1 г) через:до обработки, %3 недели, %№ месяца, %до обработки3 недели3 месяцаПочва не загрязненная---5,2·10⁶6,3·10⁶6,8·10⁶Контроль10010098,70,1·10⁴0,1·10⁵0,1·10⁵Прототип10088,311,70,2·10⁵0,2·10⁵0,5·10⁵Предлагаемый способ10075,40,080,1·10⁴0,4·10⁵3,7·10⁶

Предлагаемый способ позволяет резко снизить количество нефтепродуктов (мазута и гудрона) в почве в течение вегетационного периода роста растений (3 месяца), обеспечивает хороший рост и развитие растений, а также повышает численность микроорганизмов в почве. Использование бактериальных культур Azotobacter chroococcum Mut-1 ВНИИСХМ В-35 Д и Bacillus megaterium КС-1 ВНИИСХМ В-135 Д в качестве регуляторов роста растений повышает плодородие земель, загрязненных нефтью при минимальных затратах.

Изобретение относится к биотехнологии, ремедиации загрязненных земель и предназначено для восстановления почв, загрязненных сырой нефтью и нефтепродуктами. Способ заключается в том, что почву обрабатывают сухим бакпрепаратом с наполнителем, в котором в качестве микроорганизмов используют штамм Pseudomonas fluorescens КО (ВНИИСХМ Д-619) и штамм Pseudomonas aeruginosa КОА-3 (ВНИИСХМ Д-609), а в качестве наполнителя используют отходы бурого угля. После обработки почвы ее засевают семенами смеси бобовых и злаковых культур, предварительно обработанных сухим регулятором роста растений, в качестве которого берут бакпрепараты на основе Azotobacter chroococcum Mut-1 (ВНИИСХМ В-35 Д), Bacillus megaterium КС-1 (ВНИИСХМ В-135 Д). Применение изобретения позволяет достичь устойчивого травостоя на почве после разложения нефтепродуктов. 1 з.п. ф-лы, 6 табл.

1. Способ биологической ремедиации нефтезагрязненных почв, включающий обработку почвы бакпрепаратом, посев смеси семян бобовых и злаковых культур, предварительно обработанных регулятором роста растений, отличающийся тем, что почву обрабатывают сухим бакпрепаратом с наполнителем в количестве 50 кг/га, в котором в качестве микроорганизмов используют штамм Pseudomonas fluorescens КО ВНИИСХМ Д-619 и штамм Pseudomonas aeruginosa КОА-3 ВНИИСХМ Д-609 в соотношении 1:1, а в качестве наполнителя используют отходы бурого угля, при этом в качестве регулятора роста растений используют сухой бакпрепарат на основе Azotobacter chroococcum Mut-1 ВНИИСХМ В-35 Д, Bacillus megaterium КС-1 ВНИИСХМ В-135 Д в количестве 2 кг/га и соотношении бактериальных культур 1:1.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что сухой бакпрепарат на основе Azotobacter chroococcum Mut-1 ВНИИСХМ В-35 Д, Bacillus megaterium KC-1 ВНИИСХМ В-135 Д содержит гуминовые, карбоновые, аминокислоты, полисахариды, витамины группы В.