ПЭГИЛИРОВАННЫЙ ПОЛИПЕПТИД Т20 Российский патент 2007 года по МПК C07K14/16 A61K38/16 A61P31/18 

Описание патента на изобретение RU2296769C2

Настоящее изобретение относится к пэгилированным соединениям полипептида Т20, а также к способам применения и получения таких соединений, например, в фармацевтических композициях и терапевтических способах лечения.

Некоторые вирусы, особенно ВИЧ, должны пройти сложный процесс, называемый слиянием, для того чтобы проникнуть в клетку хозяина и репродуцироваться. В ходе слияния наружная мембрана вируса сливается с мембраной клетки хозяина. В случае ВИЧ в ходе репродукции наружная мембрана вируса сливается с мембраной Т-клеток CD4+.

Т20 является членом нового класса антивирусных средств, которые ингибируют вирус/мембранное слияние. В случае ВИЧ это приводит к двум полезным эффектам: блокируется репродукция ВИЧ и в результате не происходит гибели Т-клеток CD4+.

Данные двух больших, проведенных на международном уровне, испытаний III фазы показывают, что комбинированная терапия, включавшая Т20, приводила к редукции ВИЧ до недиагностируемых уровней содержания в крови, по меньшей мере, у вдвое большего в процентном выражении числа больных и обеспечивала улучшенный иммунный ответ на 24 недели, по сравнению с больными, которые получали комбинированную терапию без Т20. Кроме того, больные, получавшие Т20, были менее подвержены вирусному повреждению организма или рецидиву на протяжении 24 недель.

В первом испытании III фазы, проведенном в Северной Америке и Бразилии, у 37 процентов больных, которых лечили с применением Т-20 в комбинации с оптимизированной фоновой схемой лечения, на протяжении 24 недель сохранялись недиагностируемые уровни ВИЧ в крови (менее 400 копий/мл), по сравнению с 16 процентами, которые получали только оптимизированную фоновую схему лечения (Р<0,0001). Комбинированная терапия с применением Т20 также уменьшала вирусную нагрузку ВИЧ до уровня ниже чем 50 копий/мл у 20% больных по сравнению с 7%, получавшими только комбинированную терапию (Р=0,0002).

Конечной точкой оценки первичной эффективности для настоящего исследования, а именно минимальным различием в величине уменьшения ВИЧ между двумя группами в исследовании, было значение 0,934 log 10 копий/мл (Р<0,0001). Больные, которые получали Т-20 в качестве части схемы комбинированной терапии, достигали уменьшения уровней ВИЧ до 1,697 log 10 копий/мл, по сравнению с показателем 0,763 log 10 копий/мл у больных в контрольной группе. Более того, у 52% больных, получавших Т-20, проявлялось 1,0 log 10 или более значительное снижение уровней ВИЧ, по сравнению с 29% больных, которые не получали Т-20 (Р<0,0001). Больные в группе, получавшей Т-20, показали среднее увеличение содержания CD4+ клеток до 76 клеток/мм3, по сравнению с 32 клетками/мм3 у больных в контрольной группе (Р<0,0001).

Результаты второго клинического испытания III фазы, проведенного в Европе и Австралии, были сопоставимы с выводами первого исследования. У 28% больных, в лечении которых применяли Т-20 в комбинации с оптимизированной фоновой схемой лечения, отмечался недиагностируемый уровень ВИЧ в крови (менее 400 копий/мл) в течение 24 недель, по сравнению с 14%, получавшими только оптимизированную фоновую схему лечения (Р<0,0001). Комбинированная терапия с применением Т20, кроме того, уменьшала вирусную нагрузку ВИЧ до уровня менее 50 копий/мл у 12% больных, по сравнению с 5%, получавшими только комбинированную терапию (Р=0,0099).

Среднее различие по величине уменьшения ВИЧ между двумя группами в течение 24 недель составило 0,78 log 10 копий/мл (Р<0,0001). Больные, которые получали Т-20 как часть их комбинированной схемы лечения, достигали среднего снижения уровней ВИЧ до значения 1,43 log 10 копий/мл, по сравнению со средним значением 0,65 log 10 копий/мл у больных в контрольной группе. Более того, 43% больных, получавших Т20, испытывали 1,0 log 10 или более значительное снижение уровня ВИЧ по сравнению с 21% больных, которые не получали Т-20 (Р<0,0001). Больные в группе, получавшей Т-20, испытывали среднее увеличение CD4+ клеток до 65 клеток/мм3, по сравнению с 38 клетками/мм3 у больных в контрольной группе (Р=0,023).

Предварительно оптимизированную фоновую схему лечения (содержащую от трех до пяти лекарственных средств, включающую до двух недавно одобренных или исследуемых лекарственных средств, если это необходимо) подбирали для каждого больного на основании истории лечения и исследования антиретровирусной резистентности. После подбора схемы лечения больных рандомизировали в отношении 2:1 для получения либо схемы лечения в комбинации с Т-20, либо только одной схемы лечения. Больные, рандомизированные в группу, в которой применяли Т-20, получали Т-20, вводимый по 90 мг в качестве одной подкожной самоинъекции два раза в сутки.

Устойчивость вирусов к современным одобренным лекарственным средствам против ВИЧ является существенной проблемой в клинической практике в отношении ВИЧ в настоящее время. У многих больных, начинающих комбинированное антиретровирусное лечение одобренными в настоящее время препаратами, со временем развивается устойчивость к одному или нескольким из этих средств. Однако исследования показывают, что развитие устойчивости к любому из одобренных в настоящее время лекарственных средств антиретровирусных классов вероятно не затрагивает Т20. (Данные представлены на 5-ом Международном семинаре по лекарственной устойчивости и стратегии лечения в Скоттсдейле, Аризона, 4-8 июня, 2001 г.). Дополнительные исследования показывают, что на активность Т20 in vitro не влияют мутации, связанные с устойчивостью к ингибиторам обратной транскриптазы и ингибиторам протеазы.

Подобно многим полипептидным терапевтическим средствам Т20 обычно вводят путем инъекции. Современные лечебные протоколы часто включают более одной инъекции в сутки.

Поэтому было бы полезно предусмотреть полипептиды Т20 и фармацевтические композиции с улучшенным действием и фармакокинетическими характеристиками.

Особенно полезно было бы предусмотреть Т20 с более низкими терапевтическими дозами, менее частыми введениями и/или пролонгированным действием.

Эти и другие задачи настоящего изобретения более детально описываются ниже.

Настоящее изобретение предлагает соединение формулы

где R1 обозначает кэп-группу,

m обозначает число от 1 до 17,

n обозначает число от 10 до 1000,

p обозначает число от 1 до 3 и

NHT20 представляет собой полипептид Т20, ковалентно присоединенный к концевой α-аминогруппе.

В одном из вариантов осуществления изобретения в предлагаемом в нем соединении R1 обозначает метоксигруппу, m обозначает 1, n обозначает число от 100 до 750 и р обозначает 3.

Также предлагается фармацевтическая композиция, включающая, в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом, соединение формулы (I), в которой R1, m, n, р и NHT20 имеют указанные выше значения.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в фармацевтической композиции R1 обозначает метоксигруппу, m обозначает 1, n обозначает число от 100 до 750 и р обозначает 3.

Настоящее изобретение также предусматривает способ ингибирования ВИЧ-инфекции, заключающийся во введении фармацевтической композиции, включающей, в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом, соединение формулы (I), в которой R1, m, n, р и NHT20 имеют указанные выше значения.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в способе ингибирования ВИЧ-инфекции R1 обозначает метоксигруппу, m обозначает 1, n обозначает число от 100 до 750 и р обозначает 3.

Если настоящее изобретение относится к "способу получения", подразумевается "процесс получения".

Более того, предлагается способ получения пэгилированного полипептида Т20, заключающийся во взаимодействии полипептида Т20 с альдегидом полиэтиленгликоля формулы

в которой R1, m, n и р имеют указанные выше значения, с получением соединения формулы (I), в которой молекула альдегида полиэтиленгликоля присоединена к N-концевой аминогруппе полипептида Т20.

Если настоящее изобретение относится к "способу ингибирования ВИЧ-инфекции, включающему соединение", подразумевается "применение соединения для приготовления лекарственного средства для ингибирования ВИЧ".

В изобретении также предлагается соединение формулы

в которой n обозначает число от 10 до 1000 и NHT20 обозначает полипептид Т20, ковалентно связанный через концевую α-аминогруппу.

Кроме того, в изобретении предлагается фармацевтическая композиция, включающая, в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом, соединение формулы (III), в которой n обозначает число от 10 до 1000 и NHT20 обозначает полипептид Т20, ковалентно связанный через концевую α-аминогруппу.

Также предлагается способ ингибирования ВИЧ-инфекции, заключающийся в введении фармацевтической композиции, включающей, в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом, соединение формулы (III), в которой n обозначает число от 10 до 1000 и NHT20 обозначает полипептид Т20, ковалентно связанный через концевую α-аминогруппу.

Как указано выше, Т20 является полипептидом - "ингибитором слияния". Т20 состоит из 36 аминокислот. Полипептид Т20 имеет следующую аминокислотную последовательность:

YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF [SEQ.ID. №1]

N-концевой (или аминоконцевой) аминокислотой является тирозин (Y). С-концевой (или карбоксиконцевой) аминокислотой является фенилаланин (F).

Как показано на фиг.1 в патенте US 5464933 (SEQ ID:1), который включен в настоящее изобретение в качестве ссылки, последовательность полипептида Т20 можно заблокировать/изменить на одном или обоих его концах (амино- и карбокси-). Как указано в патенте US 5464933 тирозиновый аминоконец можно заблокировать/изменить путем введения ацильной группы и фенилаланиновый карбоксиконец можно заблокировать/изменить путем введения аминогруппы (последнее приводит к превращению -СООН→-CONH2).

В контексте настоящего описания под "Т20" подразумевается [SEQ ID №], необязательно заблокированный аминогруппой на фенилаланиновом С-конце. Другими словами, при ссылке на "Т20" подразумевается, что фенилаланиновый С-конец представляет собой либо -СООН, либо -CONH2.

Настоящее изобретение предлагает пэгилированные соединения Т20 следующей формулы

где R1 обозначает кэп-группу,

m обозначает число от 1 до 17,

n обозначает число от 10 до 1000,

р обозначает число от 1 до 3 и

NHT20 представляет собой полипептид Т20, ковалентно присоединенный посредством своей концевой α-аминогруппы.

В контексте настоящего описания термин R1-"кэп-группа" обозначает любую приемлемую химическую группу, которая, в зависимости от того, что предпочтительнее, является обычно нереакционноспособной или обычно способной вступать в реакцию с другими химическими частями. В приведенном выше соединении полиэтиленгликоль ковалентно присоединен к α-аминогруппе полипептида Т20. R1-кэп-группа подбирается так, чтобы разрешить или же предотвратить бифункциональность, например ковалентное присоединение ко второй, представляющей интерес, химической части.

В том случае, когда кэп-группа является обычно неспособной вступать в реакцию с другими химическими частями, R1 является относительно инертным и поэтому не будет ковалентно присоединяться к другой химической части. Приемлемые, обычно нереакционноспособные, R1-кэп-группы включают водород, гидроксил, низший алкил, низшую алкоксигруппу, низший циклоалкил, низший алкенил, низший циклоалкенил, арил и гетероарил.

В контексте настоящего описания под термином "низший алкил" подразумевается замещенная или незамещенная, с прямой или разветвленной цепью алкильная группа, содержащая от 1 до 7, предпочтительно от 1 до 4 атомов углерода, такая как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, н-гексил, н-гептил и им подобные.

Термин "низшая алкоксигрупа" означает низшую алкильную группу, указанную ранее, которая присоединена через атом кислорода; примерами низших алкоксигрупп являются метоксигруппа, этоксигруппа, н-пропоксигруппа, изопропоксигруппа, н-бутоксигруппа, втор-бутоксигруппа, трет-бутоксигрутта, н-пентоксигруппа и им подобные.

Термин "низший циклоалкил" означает замещенную или незамещенную циклоалкильную группу, содержащую от 3 до 7, предпочтительно от 4 до 6, атомов углерода, т.е. циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил или циклогептил.

В контексте настоящего описания под термином "низший алкенил" подразумевают замещенную или незамещенную алкенильную группу с прямой или разветвленной цепью, содержащую от 2 до 7, предпочтительно от 2 до 5, атомов углерода, например этенил, бутенил, пентенил, гексенил и им подобные.

Термин "низший циклоалкенил" означает замещенную или незамещенную циклоалкенильную группу, содержащую от 4 до 7 атомов углерода, например циклобутенил, циклопентенил, циклогексенил и им подобные.

Термин "арил" означает фенильную и нафтильную группу, которая является незамещенной или необязательно моно- или многозамещенной галогеном, низшим алкилом, низшей алкоксигруппой, трифторметилом, гидроксилом, карбоновой кислотой, сложным эфиром карбоновой кислоты, нитрогруппой, аминогруппой или фенилом, в частности галогеном, низшим алкилом, низшей алкоксигруппой, трифторметилом, гидроксилом, нитрогруппой, аминогруппой или фенилом.

Под термином "гетероарил" подразумевают 5- или 6-членную гетероароматическую группу, которая содержит один или несколько гетероатомов, выбранных из N, S и О, и которая может быть конденсирована с бензольным ядром и/или замещена тем же способом, что и указанный выше "арил".

Предпочтительные обычно инертные R1-кэп-группы включают метоксигруппу, гидроксил или бензилоксигруппу. Особенно предпочтительной R1-кэп-группой является метоксигруппа. Когда R1 представляет собой метоксигруппу, пэгилированные полипептидные соединения иногда указываются в настоящем изобретении, частично как "мПЭГ-соединения", где м обозначает метоксигруппу.

Если R1-кэп-группа представляет собой группу, обычно вступающую в реакции с другими химическими группами, тогда R1 является функциональной группой, способной к взаимодействию с некоторыми функциональными группами, такими как амино и/или сульфгидрил в пептиде и/или белке. В таком случае R1 может быть функциональной группой, которая может легко взаимодействовать с электрофильными или нуклеофильными группами в других молекулах, в противоположность группам, которым для вступления в реакцию требуются сильные катализаторы или трудновыполнимые условия реакции. Если R1 является относительно химически активным радикалом, альдегид полиэтиленгликоля может ковалентно присоединяться к другой химической части.

Примеры приемлемых обычно химически активных R1-кэп-групп включают галоген, эпоксид, имид малеиновой кислоты, орто-пиридилдисульфид, тозилат, изоцианат, гидразингидрат, циануровый галид, N-сукцинимидилоксигруппу, сульфо-N-сукцинимидилоксигруппу, 1-бензотриазолилоксигруппу, 1-имидазолилоксигруппу, пара-нитрофенилоксигруппу и

Термин "галоген" означает фтор, хлор, бром и иод. Предпочтительной обычно химически активной R1-кэп-группой является

Когда присутствует данная R1-кэп-группа, следует принимать во внимание, что в соединениях настоящего изобретения первые m, n и/или р могут совпадать или отличаться от вторых m, n и/или р в формуле. Предпочтительнее, однако, когда оба m имеют одно и то же значение, оба n имеют одно и то же значение и оба р имеют одно и то же значение.

В настоящем изобретении m обозначает число от 1 до 17. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения m обозначает число от 1 до 14. Более предпочтительно, когда m обозначает число от 1 до 7, и еще более предпочтительно, когда m обозначает число от 1 до 4. Наиболее предпочтительно, когда m обозначает 1.

В настоящем изобретении n обозначает число от 10 до 1000. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения n обозначает число от 20 до 1000. Более предпочтительно, когда n обозначает от 50 до 1000, и еще более предпочтительно, когда n обозначает от 75 до 1000. Наиболее предпочтительно, когда n обозначает число от 100 до 750.

В настоящем изобретении р обозначает число от 1 до 3. Предпочтительно, когда р обозначает 3.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения р обозначает 3, R1 обозначает метоксигруппу, m обозначает 1 и n обозначает число от 100 до 750 или р обозначает 2, R1 обозначает метоксигруппу, m обозначает 1 и n обозначает число от 100 до 750, или р обозначает 1, R1 обозначает метоксигруппу, m обозначает 1 и n обозначает число от 100 до 750.

В вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривается формула (I), в которой R1 обозначает метоксигруппу, m обозначает 1, n обозначает число от 100 до 750, р обозначает 3 и NHT20 обозначает полипептит Т20, ковалентно связанный с концевой α-аминогруппой.

Как отмечалось выше, в пэгилированных соединениях Т20 настоящего изобретения концевая α-аминогруппа Т20 ковалентно присоединена к производному полиэтиленгликоля, имеющему особую структуру. Пэгилированные соединения можно получать любым желаемым способом, но обычно их получают путем химического взаимодействия Т20 с отдельно полученными производными полиэтиленгликоля.

Полипептид Т20 можно получать любым приемлемым способом. Например, данные соединения можно синтезировать, применяя традиционные методы твердофазного синтеза Меррифилда, включая твердофазный метод с использованием Вос-аминокислоты (Chem. Soc., 85, 1963, с.2149), с применением ручного или автоматизированного процессов, применяя твердофазный метод с использованием Fmoc- аминокислоты (R.C.Sheppard и др., J.Chem. Soc. Chem. Comm., 1985, cc.165-166), используя прибор Advanced Chemtech, модель 200, фирмы Advanced Chemtech., Луисвилль, США, штат Кентукки, используя Millipore 9050 фирмы Millipore, Bedford Mass, или другие доступные приборы.

Т20 можно получать путем включения кДНК, кодирующей соединения настоящего изобретения, в функционально активные векторы на основе вирусной или кольцевой плазмидной ДНК. Векторы или плазмиды можно использовать для трансфекции или трансформации выбранных микроорганизмов. После трансформации или трансфекции микроорганизмы можно культивировать в условиях, способствующих экспрессии последовательностей трансмиссивной ДНК, и из питательной среды можно осуществлять выделение искомых пептидов (см., например, патент US 5955422, суть которого включена в настоящее изобретение в качестве ссылки).

Т20 можно также получать посредством традиционной генной инженерии с использованием хорошо известных в данной области методов. Например, эти методы описаны Sambrook и др. в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-ое издание (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк), или Ausubel и др. в Current Protocols в Molecular Biology, John Wiley и Sons, Нью-Йорк, 1995; они включены в настоящее изобретение в качестве ссылок.

Особый метод получения Т20 описан в патенте US 6015881, который включен в настоящее изобретение.

После расщепления и удаления защитной группы можно проводить очистку Т20 любыми приемлемыми способами. Например, для очистки Т20 полной длины от его фрагментов можно применять ионообменную, гель-фильтрационную хроматографию и/или колонку с обращенной фазой/систему ВЭЖХ. В том случае, когда сначала получают предшественника Т20 с блокирующей/защитной группой, присоединенной к N-концу (например, ацильной группой) и/или С-концу (например, аминогруппой), одну или обе из этих групп можно удалить, используя известные приемы.

Последовательность аминокислот в Т20 можно подтвердить или идентифицировать, применяя традиционный аминокислотный анализ, а также ручное или автоматизированное расщепление белков по Эдману и определение каждой аминокислоты. Чтобы проконтролировать получение Т20 можно также использовать ВЭЖХ-анализ и масс-спектрометрию.

Альдегидные соединения полиэтиленгликоля, которые можно подвергать взаимодействию с Т20, также можно получать любым желаемым способом. Предпочтительно, однако, когда полиэтиленгликоль получают в соответствии с методами, описанными в одновременно поданной заявке на патент US 60/398196, зарегистрированной 24 июля 2002 г, озаглавленной "Альдегиды полиэтиленгликоля", сущность которой включена в настоящее изобретение в качестве ссылки.

Обычно для пэгилирования Т20 применяется альдегид полиэтиленгликоля формулы

в которой R1, m, n и р имеют указанные выше значения.

Альдегид полиэтиленгликоля, применяемый для пэгилирования Т20, можно получать любыми приемлемыми способами. Один из предпочтительных альдегидов полиэтиленгликоля получают следующим способом.

Варьирующие по размеру альдегиды полиэтиленгликоля (например, различающиеся значениями n) можно получать по следующей вышеуказанной общей схеме реакций.

Пэгилированные соединения Т20 настоящего изобретения можно получать любыми приемлемыми способами. Однако более предпочтительным по настоящему изобретению является способ пэгилирования полипептида Т20, заключающийся в химическом взаимодействии полипептида Т20, NHT20 с альдегидом полиэтиленгликоля формулы

в которой R1, m, n и р имеют указанные выше значения,

с образованием соединения формулы

в которой молекула альдегида полиэтиленгликоля присоединена к N-концевой аминогруппе полипептида Т20.

Пэгилированный Т20 получают добавлением Т20 и реагента ПЭГ в диапазоне молярных отношений от 1:1 до 1:100. Т20 имеет свободную α-аминогруппу (удалена какая-либо из ацильных групп) и либо свободную карбоксигруппу, либо аминозащищенную карбоксигруппу, как обсуждалось выше. Реакционную смесь помещают в боратный, фосфатный или трис-буфер при комнатной температуре или при температуре 4°С приблизительно на 5-24 ч при диапазоне рН от 5,5 до 7,4. Молярное отношение реагента ПЭГ к пептиду/белкам составляет от 1:1 до 100:1. Концентрация пептида/белков составляет от 1 до 10 мг/мл. Концентрация буфера обычно составляет от 10 до 500 мМ.

Для очистки Т20 берут реакционную смесь пэгилированных Т20 и разбавляют ее уравновешивающим буфером (20 мМ трис, рН 7,5). Затем полученную смесь наносят на колонку с Q-сефарозой. После нанесения смеси на QA-колонку ее промывают уравновешивающим буфером, элюируют 75 мМ NaCl, элюируют 200 мМ NaCl, элюируют 1 М NaCl и регенерируют 1 М НОАС + 1 М NaCl и 0,5 М NaOH.

Используя ВЭЖХ с обращенной фазой можно без труда отделить и выделить N-концевой монопэгилированный продукт из смеси с другими побочными продуктами.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения в предлагаемых в нем пэгилированных полипептидах Т20 р обозначает 3, R1 обозначает метил, m обозначает 1 и n обозначает число от 100 до 750 или р обозначает 2, R1 обозначает метоксигруппу, m обозначает 1 и n обозначает число от 100 до 750, или р обозначает 1, R1 обозначает метоксигруппу, m обозначает 1 и n обозначает число от 100 до 750.

В настоящем изобретении также предлагается пэгилированный полипептид Т20 следующей формулы:

в которой n обозначает число от 10 до 1000 и NHT20 обозначает полипептид Т20, ковалентно связанный с концевой α-аминогруппой. В одном из вариантов осуществления изобретения n обозначает число, близкое 225, например 227.

Этот пэгилированный полипептид Т20 может быть получен любым желаемым способом, предпочтительно его получают способом, описанным в примере 3.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения включают, в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом, соединение формулы (I), в которой R1, m, n, p и NHT20 имеют указанные выше значения.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения, включающие пэгилированные полипептиды Т20 или их соли, можно получать любым желаемым способом, например путем традиционных процессов смешивания, инкапсулирования, растворения, гранулирования, эмульгирования, улавливания или лиофилизации. Эти фармацевтические препараты могут быть приготовлены в смеси с терапевтически неактивными неорганическими или органическими эксципиентами или носителями. Приемлемые для инъекции эксципиенты включают воду, спирты, высокомолекулярные спирты, глицерин, растительные масла, фосфолипиды и поверхностно-активные вещества.

Фармацевтические препараты могут также содержать консерванты, солюбилизаторы, стабилизаторы, увлажнители, эмульгаторы, подсластители, красители, ароматизаторы, соли для изменения осмотического давления, буферы, вещества для покрытия и антиоксиданты. Они также могут содержать другие терапевтически ценные вещества, включая дополнительные действующие вещества.

Составы, пригодные для парентерального (включая подкожное, внутримышечное, внутривенное, внутрикожное, внутритрахейное, эпидуральное) введения могут быть традиционно представлены в удобной форме разовой дозы и могут быть приготовлены традиционными фармацевтическими методами. Такие методы включают стадию внесения в ассоциацию пэгилированных полипептидов Т20 и фармацевтических носителя (носителей) и эксципиента (эксципиентов). Обычно композиции готовят путем равномерного и однородного внесения в ассоциацию пэгилированных полипептидов Т20 с жидкими носителями. Составы, приемлемые для парентерального введения, включают водные и неводные стерильные инъекционные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатики и растворенные вещества, придающие композиции изотоничность с кровью предполагаемого реципиента, водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие вещества и загустители. Составы могут быть представлены в контейнерах с разовыми или множественными дозами, например в запаянных ампулах и флаконах, и их можно хранить в лиофилизированных состояниях, требующих только добавления стерильного жидкого носителя, например воды для инъекций, непосредственно перед использованием.

Предпочтительными разовыми дозами лекарственных составов являются те, которые содержат суточную дозу или единицу, суточную субдозу, как изложено в настоящем описании выше, или адекватную часть дозы вводимого вещества.

Предпочтительно, когда пэгилированный полипептид Т20 представлен в форме разовой дозы. В контексте настоящего описания под выражением "форма разовой дозы" подразумевается, что количество, соответствующее разовой дозе пэгилированного полипептида Т20, представлено в предварительно рассчитанной и/или расфасованной форме. Это обеспечивает удобную подготовку пэгилированного полипептида Т20 для введения и учитывает даже возможность самовведения препарата больными. Очевидно, что количество разовых доз будет зависеть от количества пэгилированного полипептида Т20, которое необходимо ввести, и частоты введения.

Пэгилированный полипептид Т20 может быть также предусмотрен в форме лиофилизированного порошка в количестве разовой дозы, пригодном для разбавления фармацевтически приемлемым эксципиентом непосредственно перед введением.

Одна из фармацевтических композиций изобретения включает, в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом, соединение формулы (I), в которой R1 обозначает метоксигруппу, m обозначает 1, n обозначает число от 100 до 750 и р обозначает 3.

Другая фармацевтическая композиция изобретения является фармацевтической композицией, включающей, в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом, соединение формулы (III), в которой n обозначает число от 100 до 1000 и NHT20 обозначает полипептид Т20, ковалентно связанный с концевой α-аминогруппой. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения n обозначает число, близкое 225, например 227.

Настоящее изобретение также предлагает способы ингибирования ВИЧ-инфекции, заключающиеся во введении больному фармацевтической композиции, включающей, в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом, соединение формулы (I), в которой R1, m, n, p и NHT20 имеют указанные выше значения.

Пэгилированные полипептиды Т20 обычно вводят способом, которым в настоящее время вводят (непэгилированные) полипептиды Т20. Однако допустимы модификации, позволяющие использовать преимущества улучшенных фармакокинетических показателей пэгилированных полипептидов Т20.

В способе ингибирования ВИЧ настоящего изобретения фармацевтическую композицию можно вводить любым приемлемым способом и путем. В предпочтительном способе пэгилированный полипептид Т20 вводят в форме инъеционного раствора или суспензии. Предпочтительно, когда инъецируемый раствор или суспензию вводят путем подкожной инъекции или внутривенно.

В другом предпочтительном способе пэгилированный полипептид Т20 вводят посредством трансдермальной системы доставки, например путем трансдермальной аппликации.

В способе ингибирования ВИЧ настоящего изобретения фармацевтическую композицию можно вводить в любых приемлемых дозах и режимах. Фармацевтические композиции настоящего изобретения можно вводить в любой форме и любым путем по желанию. Обычно, однако, пэгилированные полипептиды Т20 настоящего изобретения вводят парентерально, например, в форме инъекционных растворов.

Определение терапевтически эффективного количества зависит от степени компетентности в данной области, и терапевтически эффективное количество или доза пэгилированного полипептида Т20 в соответствии с настоящим изобретением может вырьировать и подбирается на основании индивидуальных потребностей в каждом конкретном случае. В общем, в случае парентерального введения взрослым людям, весом около 70 кг, должна быть приемлемой суточная доза от приблизительно 5 мг до приблизительно 300 мг, предпочтительно от приблизительно 50 мг до приблизительно 200 мг, хотя верхний предел по показанию можно превышать. Дозировку можно вводить в качестве однократной дозы, разделенной общей дозы или путем непрерывного вливания. Можно применять ежедневные и, что более предпочтительно, еженедельные введения.

Настоящее изобретение также предлагает способ ингибирования ВИЧ-инфекции, заключающийся во введении фармацевтической композиции, включающей, в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом, соединение формулы (I), в которой R1 обозначает метоксигруппу, m обозначает 1, n обозначает число от 100 до 750 и р обозначает 3.

В рамках изобретения также рассматривается способ ингибирования ВИЧ-инфекции, заключающийся во введении фармацевтической композиции, включающей, в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом, соединение формулы (III), в которой n обозначает число от 10 до 1000 и NHT20 обозначает полипептид Т20, ковалентно связанный с концевой α-аминогруппой. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения n обозначает число, близкое 225, например 227.

Для дополнительной иллюстрации соединений, композиций и способов настоящего изобретения предлагаются следующие примеры. Эти примеры служат только в качестве иллюстрации и никоим образом не предназначены для ограничения рамок настоящего изобретения.

Пример 1

Приготовление ПЭГ10к-бутаноальдегида

мПЭГ с молекулярным весом 10000 (30,0 г, 3 ммоля) в 240 мл толуола азеотропно сушат нагреванием с обратным холодильником в течение 2 ч с последующим удалением 120 мл толуола. Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры, затем к раствору ПЭГ добавляют трет-бутоксид калия (0,68 г, 6 ммолей) в 20 мл абсолютного трет-бутанола и 20 мл толуола. Полученную смесь перемешивают в течение двух часов при комнатной температуре в атмосфере аргона. К реакционной смеси с помощью шприца добавляют трет-бутилбромацетат (1,00 мл, 6,75 ммолей) и реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона. Затем реакционный раствор конденсируют роторным упариванием. Осаждают добавлением диэтилового простого эфира. Осажденный продукт, мПЭГ10к-трет-бутилкарбоксиметиловый сложный эфир, фильтруют и сушат под вакуумом. Выход 28 г. ЯМР (d6-ДМСО): 1,40 част./млн. (t, 9H, -СН3); 3,21 част./млн. (s, -ОСН3); 3,50 част./млн. (s, -O-CH2CH2-O-); 3.96 част./млн. (s, 2H, -O-СН2-СОО-).

Затем мПЭГ10к-трет-бутилкарбоксиметиловый сложный эфир (26,5 г) растворяют в 350 мл 1 н. гидроксида натрия и перемешивают раствор в течение ночи при комнатной температуре. Доводят рН смеси до 2,5, добавляя 6 н. соляную кислоту, и экстрагируют смесь дихлорметаном. Высушивают органический слой над сульфатом натрия, фильтруют, концентрируют и осаждают диэтиловым простым эфиром. Продукт мПЭГ10к-карбоксиметиловую кислоту собирают фильтрацией и сушат под вакуумом.

Выход 24 г. ЯМР (d6-ДМСО): 3,21 част./млн. (s, -ОСН3); 3,5 част./млн. (s, -O-СН2СН2-O-); 3,99 част./млн. (s, 2H, -О-СН3-СООН).

Затем мПЭГ10к-карбоксиметиловую кислоту (6 г, 0,6 ммолей) растворяют в безводном дихлорметане (30 мл) с последующим добавлением 4-аминобутилальдегиддиэтилацеталя (140 мл, 0,9 ммолей), 1-гидроксибензотриазола (80 мг, 0,6 ммолей) и дициклогексилкарбодиимида (160 мг, 0,78 ммолей). Смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона. Реакционную смесь фильтруют, концентрируют и осаждают смесью 2-пропанола и диэтилового простого эфира (1:1). Продукт мПЭГ10к-бутаноацеталь высушивают в вакууме в течение ночи. Выход 5,4 г. ЯМР (d6-ДМСО): 1,07-1,12 част./млн. (t, 6H, (-O-СН2-СН3)2); 1,46 част./млн. (m, 4H, -NHCH2CH2CH2-CH-); 3,08-3,11 част./млн. (q, 2H, -NHCH2CH2CH2-CH-); 3,21 част./млн. (s, -ОСН3); 3,5 част./млн. (s, -O-CH2CH2-O-); 3,85 част./млн. (s, 2H, -O-CH2-CO-NH-); 4,44 част./млн. (t, 1H, -NHCH2CH2CH2-CH-); 7,67 част./млн. (-NH-).

Затем мПЭГ10к-бутаноацеталь (2 г, 0,2 ммоля) растворяют в 20 мл 80% CF3СООН и перемешивают раствор при комнатной температуре в течение ночи. Доводят рН смеси до 6,0, добавляя 1 н. раствор NaOH, добавляют хлорид натрия (10 мас.%) и затем доводят рН раствора до 7,0 добавлением 1 н. NaOH. Смесь экстрагируют дихлорметаном. Органический слой высушивают над сульфатом натрия, фильтруют, концентрируют и осаждают диэтиловым простым эфиром. Продукт мПЭГ10к-бутаноальдегид собирают фильтрацией и сушат под вакуумом. Выход 1,7 г. ЯМР (d6-ДМСО): 3,21 част./млн. (s, -ОСН3); 3,5 част./млн. (s, -O-CH2CH2-O-); 3,85 част./млн. (s, 2H, -O-CH2-CO-NH-); 7,67 част./млн. (-NH-); 9,66 част./млн. (-СНО-).

Пример 2

Пэгилирование Т20 ПЭГ10к-бутаноальдегидом

Бутаноальдегид ПЭГ 10 кДа (из примера 1) добавляют к 15 мг Т20 (93,7% чистого вещества) в 3,0 мл буфера (50 мМ фосфат калия, рН 6,5) в молярном соотношении 5 молекул реагента на одну молекулу Т20. Полипептид Т20 деацилируют по α-аминоконцу, но защищают по карбоксильному концу группой -NH2. К реакционной смеси добавляют 10% (об./об.) 0,5 М раствора цианоборогидрида натрия в воде и перемешивают в течение 4 ч при комнатной температуре. Пэгилированный Т20 очищают от реакционной смеси с помощью ионообменной хроматографии (QA). Для разделения Т20 и немодифицированного Т20 используют линейный градиент с увеличивающимися концентрациями соли от 150 мМ до 1 М NaCl в 20 мМ Трис, рН 7,5.

Пример 3

Пэгилирование Т20 мПЭГ10к-пропиональдегидом

Используют пропиональдегид ПЭГ 10 кДа, имеющий следующую структуру:

СН3-O-(СН2-СН2-O)227-СН2-СН2-O-СН2-СН2-СНО

150 мг мПЭГ10к-пропиональдегида добавляют к 15 мг Т20 (93,7% чистого вещества) в 3,0 мл буфера (50 мМ фосфат калия, рН 6,5) в молярном отношении 5 молей реагента к 1 молю Т20. Полипептид Т20 деацилируют по α-аминоконцу, но защищают по карбоксильному концу группой -NH2.

К реакционной смеси добавляют 10% (об./об.) 0,5 М раствора цианоборогидрида натрия в воде и перемешивают в течение 4 ч при комнатной температуре. Пэгилированный Т20 очищают от реакционной смеси с помощью ионообменной хроматографии (QA). Пэгилированный полипептид Т20 имеет следующую структуру:

Для разделения Т20 и немодифицированного Т20 используют линейный градиент с увеличивающимися концентрациями соли от 150 мМ до 1 М NaCl в 20 мМ Трис, рН 7,5.

Пример 4

Ингибирующая концентрация пэгилированного Т20

Фенотипическую чувствительность обычно выражают в значениях IC50 или IC90, показывающих концентрацию лекарственного средства, необходимую для подавления 50% или 90% вирусного роста соответственно.

Результаты ингибирующей концентрации 50 и ингибирующей концентрации 90 пэгилированного ПЭГ10к-пропиональдегидом Т20 (пример 3) и пэгилированного мПЭГ10к-бутаноальдегидом Т20 (пример 2) представлены в таблице.

Значения ингибирующей концентрации 50 и ингибирующей концентрации 90. Значения IC50 и IC90 установлены в соответствии с примером 5Пэгилированный Т20IC50 (мкг/мл)IC90 (мкг/мл)Т20, пэгилированный мПЭГ10к-бутаноальдегидом (пример 3)0,2613,074Т20, пэгилированный ПЭГ10к-пропиональдегидом (пример 2)0,2662,536

Пример 5

cMAGI/MAGI антивирусные исследования

В этих исследованиях оценивают снижение инфекционного вирусного титра с использованием индикаторных клеточных линий MAGI (многоядерная активация галактозидазного индикатора) или производной, ССR5-экспрессирующей, cMAGI. Клеточная линия MAGI была получена от родительских клеток HeLa путем введения генов CD4 и ВИЧ-1-LTK-производного репортера b-gal с использованием амфотропного ретровирусного вектора (J.Kimpton, М.Emerman, J.Virol., 66, 1992, cc.2232-2239). Клеточная линия cMAGI была получена как производное клеточной линии MAGI путем введения гена CCR5, используя амфотропный ретровирусный вектор РА317 (В.Chackerian, E.M. Long, P.A.Luciw, J.Overbaugh, J.Virol., 71, 1997, cc.3932-3939). Клетки cMAGI поддерживают репликацию первичных изолятов NSI (R5) и адаптированных лабораторных вирусов Х4, в то время как клетки MAGI поддерживают репликацию только вирусов Х4. В обеих клеточных линиях используют способность tat ВИЧ-1 к трансактивации экспрессии гена-репортера b-галактозидазы, производного ВИЧ-LTR. Была проведена модификация репортера b-gal для того, чтобы локализовать его в ядре и дать возможность определять с использованием X-gal-субстрата по интенсивному ядерному окрашиванию в пределах нескольких дней после инфицирования. Количество окрашенных ядер можно, таким образом, интерпретировать как равное количеству инфекционных вирионов во вносимом инокулюме при условии, что перед окрашиванием имеет место только один цикл инфицирования.

Через 24 ч после инфицирования добавляют ингибитор инфицирования и межклеточного слияния, например Т20 или Т1249 (C.Wild, T.Greenwell, T.Matthews, AIDS Res. Hum. Retroviruses 9, 1993, cc.1051-1053), чтобы дать возможность снятия показаний, доверительно представляющих единственный цикл инфицирования. Инфицированные клетки подсчитывают, используя ПЗС-аппарат (прибор с зарядовой связью) для визуализации изображений, и оба изолята, первичный и лабораторно адаптированный, в результате показали линейное соотношение между количеством вводимых вирусов и количеством инфицированных клеток, визуализированных с помощью прибора. В анализах с использованием MAGI и cMAGI 50% снижение инфекционного титра (Vn/Vo=0,5) является показательным и служит первичным предельным значением оценки антивирусной активности. 90% снижение инфекционного титра (Vn/Vo) используют как дополнительное предельное значение оценки антивирусной активности.

Разведение каждого из тест-соединений испытывают в двух повторностях в отношении вирусного инокулята, с титром приблизительно 1500-2000 инфицированных клеток на лунку, в 48-луночных планшетах для микротитрования. К клеткам cMAGI или MAGI добавляют тест-соединения, затем вносят вирусный инокулят и спустя 24 ч добавляют ингибитор инфицирования и межклеточного слияния (С.Wild, Т.Greenwell, Т.Matthews в AIDS Res. Hum. Retroviruses, 9, 1993, сс.1051-1053) для предотвращения вторичных циклов инфицирования и распространения вируса от клетки к клетке. С целью определения инфицированных клеток, клетки культивируют белее 2 суток, фиксируют и окрашивают с помощью X-gal-субстрата. Количество инфицированных клеток для каждого разведения контрольного и тест-соединения устанавливают с помощью ПЗС-аппарата для визуализации изображений. IC50 определяют как разведение тест-соединения, вызывающее 50% снижение инфекционного вирусного титра. IC90 определяют как разведение, приводящее к 90% снижению инфекционного титра.

При подобном описании изобретения становится очевидным, что одно и тоже можно варьировать разными способами. Такие вариации не должны расцениваться как отступление за пределы существа и объема изобретения и все подобные модификации предполагается включить в рамках следующих пунктов патентной формулы.

Похожие патенты RU2296769C2

название год авторы номер документа
ПЭГИЛИРОВАННЫЙ ПОЛИПЕПТИД Т1249 2003
  • Белон Паскаль Себастьян
  • Вонь Джзиоб
RU2294938C2
ПРОИЗВОДНЫЕ АЛЬДЕГИДА ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЯ 2003
  • Вонь Джзиоб
RU2288212C2
КОНЪЮГАТЫ ЭРИТРОПОЭТИНА И ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЯ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО И/ИЛИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ НАРУШЕНИЙ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЬЮГАТА ИЛИ КОМПОЗИЦИИ 2000
  • Бург Йозеф
  • Хильгер Бернд
  • Йозель Ханс-Петер
RU2232163C2
СОДЕРЖАЩИЕ ПЭГ КОНЪЮГАТЫ HGF-NK4 2002
  • Брандт Михаэль
  • Пападимитриоу Аполлон
RU2293574C2
НОВАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ 2001
  • Аполон Пападимитриоу
RU2281116C2
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ С ПОВЫШЕННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ 2007
  • Ли Юхуа
  • Чиен Бенджамин
RU2427383C2
ГИБРИДНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ С УСИЛЕННЫМИ ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ 2000
  • Барни Шон
  • Гатри Келли И.
  • Мерутка Джен
  • Анвер Мохмед К.
  • Ламберт Деннис М.
RU2279883C2
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ НЕАЛКОГОЛЬНОЙ ЖИРОВОЙ БОЛЕЗНИ ПЕЧЕНИ 2013
  • Лим Се
  • Парк Сан Хи
  • Шин Рён Э
  • Чхой Ин Юнг
  • Квон Се Чан
RU2635966C2
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ДОСТАВКИ ПЕПТИДОВ С ЗАМЕДЛЕННЫМ ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ 2007
  • Ли Юхуа
  • Чиен Бенджамин
RU2456018C2
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ СВЯЗАННЫХ С ГОРМОНОМ РОСТА ЗАБОЛЕВАНИЙ У ЧЕЛОВЕКА 2014
  • Рау Харальд
  • Киндерманн Зузанне
  • Лессманн Торбен
  • Расмуссен Грете Нерсков
  • Херзель Ульрих
  • Вегге Томас
  • Спрогеэ Кеннет
RU2689336C2

Реферат патента 2007 года ПЭГИЛИРОВАННЫЙ ПОЛИПЕПТИД Т20

Изобретение относится к соединениям пэгилированных полипептидов Т20. Также описаны фармацевтические композиции, включающие пэгилированные полипептидные соединения Т20, способы получения и применения таких соединений и композиций. 6 н. и 7 з.п. ф-лы, 1 табл.

Формула изобретения RU 2 296 769 C2

1. Соединение формулы (I)

в которой R1 обозначает метоксигруппу,

m обозначает число от 1 до 17,

n обозначает число от 10 до 1000,

р обозначает число от 1 до 3 и

NHT20 обозначает полипептид Т20, ковалентно связанный через концевую α-аминогруппу.

2. Соединение по п.1, в котором р обозначает 3.3. Соединение по п.1, в котором р обозначает 3, R1 обозначает метоксигруппу, m обозначает 1 и n обозначает число от 100 до 750.4. Соединение формулы

в которой n обозначает число от 10 до 1000 и NHT20 обозначает полипептид Т20, ковалентно связанный через концевую α-аминогруппу.

5. Фармацевтическая композиция, предназначенная для ингибирования ВИЧ-инфекции и включающая в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом соединение формулы

в которой R1 обозначает метоксигруппу,

m обозначает число от 1 до 17,

n обозначает число от 10 до 1000,

р обозначает число от 1 до 3, и

NHT20 обозначает полипептид Т20, ковалентно связанный через концевую α-аминогруппу.

6. Фармацевтическая композиция по п.5, в которой р обозначает 3, R1 обозначает метоксигруппу, m обозначает 1 и n обозначает число от 100 до 750.7. Фармацевтическая композиция по п.5 в форме лиофилизированного порошка.8. Фармацевтическая композиция по п.5 в форме раствора или суспензии для инъекций.9. Применение фармацевтической композиции, включающей в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом соединение формулы I для приготовления лекарственного средства для ингибирования ВИЧ-инфекции

в которой R1 обозначает метоксигруппу,

m обозначает число от 1 до 17,

n обозначает число от 10 до 1000,

р обозначает число от 1 до 3 и

NHT20 обозначает полипептид Т20, ковалентно связанный через концевую α-аминогруппу.

10. Применение фармацевтической композиции для приготовления лекарственного средства по п.9, в котором для ингибирования ВИЧ-инфекции фармацевтическую композицию вводят в количестве приблизительно от 50 мг до приблизительно 200 мг в сутки.11. Применение фармацевтической композиции для приготовления лекарственного средства по п.9, в котором для ингибирования ВИЧ-инфекции фармацевтическую композицию вводят в количестве приблизительно от 300 мг до приблизительно 1500 мг в неделю в однократной дозе.12. Применение фармацевтической композиции, включающей в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом соединение формулы I для приготовления лекарственного средства для ингибирования ВИЧ-инфекции:

в которой R1 обозначает метоксигруппу,

m обозначает 1,

n обозначает число от 100 до 750,

р обозначает 3 и

NHT20 обозначает полипептид Т20, ковалентно связанный через концевую α-аминогруппу.

13. Способ присоединения молекулы полиэтиленгликоля к полипептиду Т20, включающий взаимодействие полипептида Т20 с альдегидом полиэтиленгликоля формулы

в которой R1 обозначает метоксигруппу,

m обозначает число от 1 до 17,

n обозначает число от 10 до 1000,

р обозначает число от 1 до 3,

с получением соединения формулы

в которой молекула альдегида полиэтиленгликоля присоединена к N-концевой аминогруппе полипептида Т20.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2007 года RU2296769C2

ПЕПТИД-ИМИТАТОР КОНСЕРВАТИВНОГО ЭПИТОПА БЕЛКА GP41 ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА ТИПА 1, УЗНАВАЕМОГО ВИРУСНЕЙТРАЛИЗУЮЩИМИ МОНОКЛОНАЛЬНЫМИ АНТИТЕЛАМИ 2F5 (ВАРИАНТЫ) 2000
  • Туманова О.Ю.
  • Кувшинов В.Н.
  • Меламед Н.В.
  • Ушакова Т.А.
  • Машарский А.Э.
  • Ильичев А.А.
  • Климов Н.А.
  • Козлов А.П.
  • Сандахчиев Л.С.
RU2179980C2
WO 9948513 A1, 30.09.1999
WO 9428920 A1, 22.12.1994
Контейнер для перевозки хлебобулочных изделий 1955
  • Панин П.М.
SU102017A1

RU 2 296 769 C2

Авторы

Белон Паскаль Себастьян

Вонь Джзиоб

Даты

2007-04-10Публикация

2003-07-16Подача