Изобретение относится к биотехнологии, генной и белковой инженерии. Конкретно - к получению с помощью фагового дисплея пептидов-имитаторов антигенной детерминанты белка gp41 вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1), узнаваемой вируснейтрализующими моноклональными антителами 2F5.
Одной из основных проблем при создании эффективных вакцинных препаратов против СПИДа является высокая антигенная вариабельность ВИЧ. Интенсивное разрушение Т-лимфоцитов, несущих на своей поверхности рецептор CD4+, наряду с мощным антительным ответом на структурные белки р24, gpl20 и gp41 способствует появлению и селекции генетических вариантов ВИЧ-1 даже в течение индивидуального инфекционного процесса [I]. При использовании инактивированных цельновирионных ВИЧ-вакцин существует также опасность аутоиммунных процессов вследствие мимикрии структуры вирусного белка gpl20 под структуру иммуноглобулинов [2].
Решению проблемы может помочь использование при создании вакцин пептидов, отличающихся по аминокислотной последовательности от антигенных детерминант вирусов, но сохраняющих способность связываться с противовирусными антителами. Такие пептиды являются имитаторами антигенных детерминант. Пептиды-имитаторы могут быть достаточно вырожденными и иметь перекрестную реактивность с антителами к разным изолятам вируса. Вырожденные пептиды могут иметь свойство индуцировать при иммунизации антитела, перекрестно реагирующие с антигенными вариантами одного и того же вируса (явление молекулярной мимикрии). Пептиды, мимикрирующие вируснейтрализующие эпитопы вирусов, по-видимому, будут вызывать наработку протективных антител и могут быть вследствие этого использованы при создании вакцин против ВИЧ и других высоковариабельных патогенов. Например, было показано, что имитаторы HBsAg, селектированные с подтип-специфической сывороткой, при иньекции экспериментальным животным способны индуцировать образование антител, не обладающих специфичностью к подтипам вируса гепатита В [3].
Уникальные возможности для получения пептидов-имитаторов природных антигенов предоставляют фаговые библиотеки пептидов, включающие в себя все возможные пептиды заданной длины, экспонированные в составе одного из поверхностных белков нитчатых бактериофагов. При этом в геноме каждого фага такой библиотеки закодирована последовательность только одного из вариантов пептидов. Отбор пептидов осуществляется с помощью антител определенной специфичности (при получении вакцин это должны быть протективные антитела). При этом интересен тот факт, что на моноклональные антитела (МКА) из фаговой пептидной библиотеки обычно отбирается ряд пептидов, отличающихся по аминокислотному составу от оригинального антигена, но имитирующих его по связыванию.
Хорошим примером является работа Keller с соавторами [4], в которой показано, что пептиды из фаговой пептидной библиотеки, селектированные с МКА против gpl20 вируса иммунодефицита человека, могут индуцировать специфичный гуморальный иммунный ответ на gpl20.
Muster с соавторами впервые локализовал консервативный нейтрализующий эпитоп, узнаваемый МКА 2F5, на эктодомене белка gp41 ВИЧ-1, применив стандартный метод картирования эпитопов. Перекрывающиеся фрагменты эктодомена белка gp41 были проклонированы как пептиды, слитые с глютатион-S-трансферазой. Слитые пептиды, реагирующие с МКА 2F5, затем идентифицировали с помощью иммуноблоттинга. Полученные T.Muster данные предполагают, что аминокислотная последовательность ELDKWA является эпитопом, узнаваемым МКА 2F5 на эктодомене белка gp41 ВИЧ-1.
Известны рекомбинантные конструкции, в которых нуклеотидная последовательность, соответствующая эпитопу МКА 2F5, встроена в состав гена гемагглютинина (НА) вируса гриппа и гена глютатион-S-трансферазы (GST) [5, 6], а также в состав поверхностного антигена вируса гепатита В [7].
К существенным недостаткам описанных рекомбинантных конструкций следует отнести низкий уровень экспрессии, сложность культивирования и очистки. К тому же все они используют аминокислотную последовательность нативного эпитопа.
Технической задачей изобретения является поиск пептидов-имитаторов эпитопа белка gp41 ВИЧ-1, узнаваемого МКА 2F5, с помощью фаговых пептидных библиотек. Данный эпитоп является высококонсервативным для генетически различных изолятов ВИЧ-1 нейтрализующим эпитопом и вследствие этого перспективен в плане создания вакцин [8].
Поставленная цель достигается путем аффинной селекции из фаговых пептидных библиотек, содержащих десятки миллионов разных пептидов длиной 15 а.о, тех пептидов, которые способны связываться с моноклональными антителами 2F5 (МКА 2F5) к нейтрализующему эпитопу белка gp41 ВИЧ-1. Пептиды в библиотеке экспонированы на поверхности бактериофагов в составе минорного белка оболочки pIII, при этом каждая фаговая частица содержит 5 копий одного пептида [9] .
Метод аффинной селекции заключается в следующем.
Биотинилированные моноклональные антитела иммобилизуются на пластиковой поверхности, обработанной стрептавидином, и к ним добавляется фаговая библиотека. После наступления кинетического равновесия несвязавшиеся фаги отмываются буфером, а связавшиеся с антителами фаги элюируются и размножаются для нового цикла селекции. Трех раундов аффинной селекции обычно достаточно для получения обогащенной популяции фагов, содержащих целевые последовательности [10, II]. Для отбора всех вариантов специфичных клонов в первом раунде селекции используют насыщающее по отношению к фаговым частицам количество МКА. Для создания конкуренции между фагами за связывание с МКА и отбора наиболее специфичных вариантов во втором и третьем раундах селекции используют меньшие по отношению к фагам концентрации антител. Обогащение фаговой популяции определяют по увеличению выхода фагов после каждого раунда селекции. Из обогащенной таким образом фаговой библиотеки после 1, 2, 3-го раундов аффинной селекции отбирают индивидуальные фаговые клоны и определяют специфичность их связывания с соответствующими МКА в ИФА. По результатам ИФА отбирают эффективно взаимодействующие с МКА фаги. Аминокислотный состав специфичных к МКА пептидов, расположенных на поверхности фаговых частиц, определяют секвенированием фаговых ДНК по модифицированному методу Сэнгера [12] в кодирующей пептид области. В дальнейшем проводят анализ сходства аминокислотных последовательностей пептидов с последовательностью эпитопа, с которым связывают МКА.
Практическое использование
Для практического использования селектированные нами пептиды-миметики можно получать химическим синтезом или, что более экономично, с использованием рекомбинантной технологии в составе различных белков-носителей. Использование в качестве белка-носителя экспрессионного вектора на основе нитчатых бактериофагов (M13,fd), позволяющего экспонировать чужеродные пептиды на поверхности вириона, является наиболее эффективным и практичным:
- фаг, размножаясь в E.Coli, выходит в культуральную среду, не лизируя клетку хозяина, что упрощает процедуру его очистки;
- фаг накапливается в культуральной среде в концентрации 1012 вирионов на миллилитр, поэтому его легко наработать в больших количествах;
- конформация пептида, отобранного в составе фага, является оптимальной и при использовании других белков-носителей может сильно меняться;
- при встраивании пептида в поверхностный белок фага (2700 копий на вирион) получается очень эффективная мультимерная система презентации, позволяющая преодолеть проблему слабой иммуногенности пептидов. По своей эффективности такая система часто превосходит такие системы, как НВс-антиген.
Сущность изобретения заключается в том, что селектированные из фаговой пептидной библиотеки пептиды обладают свойством связываться с нейтрализующими ВИЧ-1 МКА 2F5, но отличаются по аминокислотному составу от нативного эпитопа (см. фиг.3).
Таким образом, впервые получены пептиды-имитаторы консервативного эпитопа белка gp41 ВИЧ-1, узнаваемого вируснейтрализующими антителами 2F5. Пептиды экспонированы на поверхности нитчатых бактериофагов в составе минорного белка оболочки pIII, при этом каждая фаговая частица содержит 5 копий одного пептида.
Изобретение иллюстрируется следующими фигурами.
Фиг. 1. Схема аффинной селекции.
Фиг. 2. Результаты взаимодействия фаговых клонов в ИФА. В качестве отрицательного контроля взят фаг fuse2, который не экспонирует рандомизованный пептид.
Фиг. 3. Сравнение аминокислотных последовательностей отобранных клонов с последовательностью белка gpl60 ВИЧ-1 (ВН10). Выделены совпадающие аминокислотные остатки.
Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения ниже следуют примеры его осуществления.
Пример 1. Способ проведения аффинной селекции пептидов, имитирующих высококонсервативный эпитоп белка gp41 ВИЧ-1, узнаваемый моноклональными антителами 2F5.
Первый раунд аффинной селекции фаговой библиотеки проводят по следующей схеме [10] . На пластиковую чашку Петри диаметром 35 мм наносят 900 мкл дистиллированной воды и 100 мкл 1М NaHCO3, pH 8.6, добавлют 10 мкл водного стрептавидина (1мг/мл). Чашку Петри инкубируют ночь при 4oC, сливают стрептавидин и заливают 1 мл блокирующего раствора (0,1М NaHCO3, 5 мг/мл BSA, 0,1 мкг/мл стрептавидина, 0,02% азида натрия), инкубируют чашку при 4oC в течение 1 ч. Отмывают чашку 6 раз буфером TBS/Tween (50мМ трис-HCl, рН7.5, Tween-20 0,5% v/v) и добавляют 400 мкл TBS/Tween, содержащий BSA (1 мг/мл) и 0,02% азид натрия, биотинилированные антитела (конечная концентрация в растворе 250нМ), инкубируют чашку в течение 2 ч при 4oC, затем добавляют 4 мкл 10мМ биотина, выдерживают при 4oC в течение 1ч, отмывают чашку 6 раз с TBS/Tween, наносят 400 мкл TBS/Tween, 4 мкл 10мМ биотина и 5 мкл исходной фаговой библиотеки (5•1011 вирионов). Чашку инкубируют при 4oC в течение 4 ч, отмывают 10 раз TBS/Tween, наносят 400 мкл элюирующего буфера (О, IN HC1, рН доводится глицином до 2.2, 1 мг/мл BSA), инкубируют 10 мин, элюат переносят в пластиковые пробирки, содержащие 75 мкл 1М Трис-НС1 рН 9.1 для нейтрализации кислоты, конечный рН раствора (7-8.5) проверяют индикаторной бумагой. Амплификацию фагового элюата проводят добавлением суспензии элюированных фагов к аликвоте клеток Escherichia coli K91Kan, выращенных на ТВ-среде (1,2% бактотриптон, 2,4% дрожжевой экстракт, 0,5% глицерин, 1,7мМ КН2РO4, 7,2мМ К2 НРO4). Фаги выращивают в LB среде [10]. Фаги титруют с использованием клеток K91Kan, выращенных на ТВ-среде, с последующим высевом на чашки с агаром, содержащим канамицин (100 мкг/мл) и тетрациклин (40 мкг/мл) и подсчетом выросших колоний. Титр фагов определют по числу колоний (трансдуцирующих единиц (TU)) по G.P.Smith [10]. Количество фаговых частиц рассчитывают по формуле 1 TU = 20 вирионов. Второй и третий раунды аффинной селекции проводят следующим образом. В пластиковую пробирку вносят 100 мкл фаговой суспензии (1011 TU), биотинилированных МКА (конечная концентрация антител во втором раунде составлет 100нМ, в третьем - 0,1нМ), инкубируют в течение ночи при 4oC, добавляют 400 мкл TBS/Tween и немедленно наносят на стрептавидин-обработанную чашку (как описано выше), инкубируют 10 мин при комнатной температуре. Чашку отмывают TBS/Tween, связавшиеся фаги элюируют, титруют и амплифицируют, как описано выше. После третьего раунда селекции получают индивидуальные фаговые колонии, которые используют для наработки одноцепочечной ДНК и фагов для имммуноферментного анализа (ИФА). Определение последовательности ДНК проводят по модифицированному методу Сэнгера [12]. В качестве праймера используют олигонуклеотид 5'-TGAATTTTCTGTATGAGG [10].
Пример 2. Анализ связывания пептидов, имитирующих высококонсервативный эпитоп белка gp41 ВИЧ-1, с моноклональными антителами 2F5 методом ИФА
Подтверждение специфичности связывания выделенных фагов с МКА проводят методом непрямого иммуноферментного анализа [11].
На 96-луночный планшет для ИФА (ВНИИ Медбиополимер) наносят по 50 мкл в лунку фагового препарата (1010вирионов) и инкубируют в течение ночи в холодильнике. После 3-кратной промывки PBS/Tween в каждую лунку добавляют по 150 мкл блокирующего буфера (1% раствор казеина в PBS), блокируют неспецифические места сорбции на пластике 1 ч при 37oС, промывают 3 раза PBS/Tween и добавляют по 1 мкг биотинилированных МКА в объеме 50 мкл. После инкубации в течение суток в холодильнике промывают 3 раза PBS/Tween и добавляют по 50 мкл разбавленного в 500 раз (в блокирующем буфере) конъюгата стрептавидин-пероксидаза хрена. Реакцию проводят 30 мин при 37oС, промывают планшет 6 раз PBS/Tween и добавляют по 50 мкл ЦФБ с ОФД. Выдерживают планшет 20 мин в темноте при комнатной температуре и останавливают реакцию добавлением 50 мкл 2Н раствора серной кислоты. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре Multiscan (Labsystem).
Превышение значений оптической плотности над контролем в несколько раз позволяет считать, что отобраные фаговые клоны действительно эффективно взаимодействуют с МКА и имитируют узнаваемые МКА эпитопы белка gp41 BИЧ-1.
Таким образом, впервые получены пептиды-имитаторы консервативного эпитопа белка gp41 ВИЧ-1, узнаваемого вируснейтрализующими антителами 2F5.
Литература
1. Coffin J.M.// Science.-1995.-Vol.267.-P.483-489.
2. Allan H. , Gerstenm M. J., Salk P. L., Salk J.// Immunol. Today., 1993., Vol. 14., p. 200-202.
3. Delmastro P., Meola A., Monaci P., Cortese R., Golfre G. //Vaccine., 1997.,Aug;15(ll),p. 1276-1285.
4. Keller P.M., Arnold B.A., Show A.R., Tolman R.L., Van-Middlesworth F. , Bondy S. , Rusiecki V.K, Koening S., et al.// Virology, 1993, V. 193, p. 709-716.
5. Muster Т., Steindl F., Purtscher M., Trkola A., Klima A., Himmler G., Ruker F. and Katinger H. // J. Virol., 1993, V. 67, p.6642-6647.
6. Muster Т., R. Guinea, A. Trkola, M. Purtscher, A. Kiima, F. Steindl, P.Palese and H. Katinger. // J. Virol. 1994, V. 68, p.4031-4034.
7. Eckhart L., Raffelsberger W., Ferco В., Klima A., Purtscher M., Katinger H., Ruker F.// J. General Virol., 1996., V. 77, p. 2001-2008.
8. Buchacher A., Predl R., Strutzenberger К., Trkola A., Purtscher M et al.//AIDS Res. Hum. Retroviruses, 1994, V. 10, 359-369.
9. Scott J.K., Smith G.P. Searching for peptide ligands with an epitope library.// Science., 1990., V. 249, p. 386-390.
10. G.P. Smith Cloning in fuse vectors (laboratory manual)//1992.
11. Motti с., Nuzzo M., Meola A., Galfre G., Felici F., Cortese R., Nicosia M. And Monaci P. //Gene, 1994, V.146, P.191-198.
12. Kretz K., Callen W., Hedden V. Cycle sequencing// Methods of Enzimology. V. 154. P. 527-536.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при создании эффективных вакцинных препаратов против СПИДа. Описано 12 пептидов-имитаторов консервативного эпитопа белка gp41 вируса иммунодефицита человека типа 1, полученных путем аффинной селекции из фаговых пептидных библиотек. Данные пептиды отличаются по аминокислотной последовательности от консервативного эпитопа белка gp41 ВИЧ-1, но сохраняют способность связываться с вируснейтрализующими моноклональными антителами 2F5. Изобретение позволяет получать высокоэффективные вакцины против ВИЧ на основе указанных пептидов. 12 с.п. ф-лы, 3 ил.
YFCYANCDKWVLKGD.
GAIYGSPPXDRWSAV.
RDWSFDRWSLSEFWL.
SSGFRDAFRGWDGSA.
RNVPPIFNDVYWIAF.
VKLSLDRWPPSHLT.
YLFYPSVTFDRWGYL.
VTLDRWHAVTARPFG.
GRSFLDRWSKVPRDP.
GNPGLERWAPRPLFA.
WGHIDADRWAGIVGS.
LGRANLSFLESLGFF.
| WO 9007119 А1, 28.06.1990 | |||
| WO 9429339 A1, 23.12.1994 | |||
| US 5241047 А, 31.08.1993. |
