СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ ФИБРИНОГЕНА ПЛАЗМЫ КРОВИ Российский патент 2007 года по МПК G01N33/86 

К настоящему моменту накоплены многочисленные данные о важной патогенетической роли процесса перекисного окисления липидов, являющегося неотъемлемой составляющей окислительного стресса, в инициации и развитии многих острых и хронических заболеваний. Однако активные кислородные метаболиты (АКМ), наряду с окислительной модификацией липидов, вызывают также и одновременную окислительную модификацию белков, приводящую к патологическим изменениям их свойств и функций, к фрагментации и агрегации [1]. Обсуждение окислительной модификации белков в организме до недавнего времени носило, в основном, теоретический характер и только в нескольких исследованиях этот процесс рассматривался как одна из возможных причин нарушения функций ферментов и изменения структуры некоторых важных белковых молекул при окислительном стрессе. При окислительной модификации белков в них образуются альдегидные и кетоновые группы аминокислотных остатков (карбонильные группы), повышенный уровень которых, наряду с гидроперекисями липидов, также является показателем-маркером свободнорадикального окисления и окислительного стресса [2].

Применительно к процессам окислительной модификации белков при патологии сердечно-сосудистой системы атеросклеротического генеза большой интерес представляет на сегодняшний день окисление гликопротеина фибриногена крови. Поскольку повышенный уровень фибриногена является диагностически и прогностически значимым маркером не только атеросклероза, но и многих других хронических воспалительных заболеваний, то его окислительная модификация еще более значительно потенцирует нарушения системы гемостаза, сопряженные с эндотелиальной дисфункцией, что в конечном итоге приводит к нарушению агрегации тромбоцитов и эритроцитов и к повышенной секреции цитокинов [3].

Исследования и разработки в области этой проблемы сегодня носят приоритетный характер и входят в перечень основных заданий-тем к научным исследованиям в рамках ФЦНТП Роснауки и Федерального агентства науки и инноваций РФ «Исследования и разработки по приоритетным направлениям», раздел «Технологии живых систем» на 2005 (2 очередь, лот №11 «Регистрация маркеров окислительного стресса - окисленных липидов и белков - для оценки тяжести сердечно-сосудистых заболеваний, прогноза их течения и характеристики эффективности терапии»). В рамках указанной темы и на основании имеющегося научного задела проведена разработка заявляемого изобретения.

Изобретение относится к клинической биохимии, а именно к способам определения окисленных белков и предназначается для оценки степени окислительной модификации фибриногена в результате воздействия факторов окислительного стресса.

Известен гравиметрический метод определения концентрации фибриногена по Рутберг [4], при котором сначала оценивается содержание в плазмы крови фибрина, образовавшегося в результате реакции полимеризации после отщепления от фибриногена двух фибринопептидов и, далее, с использованием стандартного коэффициента пересчета 0,222 масса фибрина (мг) пересчитывается на содержание фибриногена в плазме (в мг/мл или г/л). Кратко: из 1 мл цитратной (3,8% цитрата) плазмы крови выделяется фибрин-полимер методом осаждения при добавлении 0,5 мл 20 мМ раствора CaCl₂, далее проба инкубируется на водяной бане при 37°С 10 минут, образовавшийся сгусток высушивается на бумажном фильтре и взвешивается на торсионных весах. Метод широко используется в клинических биохимических лабораториях, является простым и быстрым, не требует наличия дорогостоящих биохимических приборов.

Из методов оценки интенсивности окислительной модификации белков в тканях наиболее известным и фундаментальным является метод Levine R.L. и соавторов [5], принцип которого основан на реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков (карбонильных групп) белков с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) с образованием производных 2,4-динитрофенилгидразона. Метод является сложно компонентным, длительным и применим для тканей и клеточных культур в фундаментальной экспериментальной биохимии, но не для сыворотки или плазмы крови. Поэтому впоследствии была предложена упрощенная модификация этого метода для определения степени окисления белков непосредственно в сыворотке крови [6], которая явилась основой заявляемого изобретения.

Прототипом заявляемого изобретения явился способ определения окислительной модификации белков сыворотки крови [6], при котором к 100 мкл сыворотки крови добавляют 0,9 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) для осаждения и денатурации белков, приливают 1 мл 0,1 М раствора 2,4-динитрофенилгидразина (2,4-ДНФГ) в 2 М растворе HCl, инкубируют пробу при комнатной температуре в течение 1 ч, центрифугируют при 3000 g 20 минут, осадок промывают 3 раза 1 мл раствора этанол: этилацетат (1:1) для экстракции избытка 2,4-ДНФГ, не прореагировавшего с карбонильными группами окисленных белков, осадок высушивают и далее растворяют в 2,5 мл 8 М раствора мочевины с добавлением 15 мкл 2 М раствора HCl. В контрольную пробу добавляют вместо 2,4-ДНФГ 1 мл 2 М раствора HCl. Степень окислительной модификации белков определяют измерением оптической плотности образовавшихся динитрофенилгидразонов спектрофотометрическим методом при длине волны 363 нм. Результаты выражают в Ед оптической плотности/мл сыворотки.

Недостатком данного способа является отсутствие информации об окислительной модификации отдельных белков, поскольку оценивается степень окисления общей (суммарной) фракции всех белков сыворотки крови. В связи с этим невозможно объективно и точно оценить подверженность белков, относящихся к разным классам и звеньям метаболизма, к окислению при различных заболеваниях, сопряженных с окислительным стрессом.

Заявляемый способ отличается от известного тем, что вместо суммарной фракции белков сыворотки крови степень окислительной модификации измеряют относительно отдельного гликопротеина крови - фибриногена. Сначала определяют концентрацию фибриногена: из 1 мл нитратной (3,8% цитрата) плазмы крови выделяют фибрин-полимер методом осаждения при добавлении 0,5 мл 20 мМ раствора CaCl₂, далее пробу инкубируют на водяной бане при 37°С 10 минут, образовавшийся сгусток высушивают на бумажном фильтре, взвешивают на торсионных весах и пересчитывают его массу на фибриноген. Затем к сгустку добавляют 0,5 мл 0,9% раствора NaCl и такой же объем 20% раствора ТХУ для денатурации и дополнительного осаждения белка. Такое соотношение растворов (1:1) нами было определено после серии экспериментов как оптимальное, наиболее приближенное к физиологическим условиям и к необходимому конечному объему пробы. Далее определяют окислительную модификацию сгустка по вышеописанному способу-прототипу изобретения [6]. Результаты выражают в Ед оптической плотности/мг фибриногена/мл плазмы.

Преимуществом предлагаемого способа является его высокая информативность и диагностическая значимость в отношении окислительной модификации фибриногена, которая дополнительно усугубляет его патологически повышенный уровень, являющийся одним из ключевых маркеров воспаления, эндотелиальной дисфункции, нарушений гемостаза, то есть основных патогенетических звеньев сердечно-сосудистой патологии атеросклеротического генеза. Кроме того, выявление повышенной окислительной модификации фибриногена позволит комплексно, в дополнение к оценке интенсивности процессов перекисного окисления липидов, оценить степень выраженности окислительного стресса в организме.

Проведено сравнительное исследование между показателями известного способа [6] определения окислительной модификации белков сыворотки крови и предлагаемого способа определения окислительной модификации фибриногена при обследовании 76 пациентов в возрасте 35-60 лет, в том числе 38 больных ИБС со стенокардией напряжения II-III ФК (у 10 из 38 человек - инфаркт миокарда в анамнезе) и 38 лиц того же возраста и пола, но без ИБС. Были получены следующие результаты. У лиц с ИБС окислительная модификация белков сыворотки крови была в целом выше на 14% в сравнении с лицами без ИБС (4,1±0,2 и 3,6±0,2 Ед оптической плотности (ЕД)/мл сыворотки, р<0,05, соответственно). В то же время, у этих пациентов степень окислительной модификации фибриногена была выше на 40%, чем в группе сравнения (20,4±1,5 и 14,6±1,2 ЕД/мг фибриногена/мл плазмы, р<0,001, соответственно). Полученные данные, свидетельствующие о более высокой чувствительности предлагаемого нами способа, можно объяснить тем, что не все белки крови подвергаются окислительной модификации. Так, наиболее подверженными воздействию факторов окислительного стресса являются в первую очередь фибриноген и другие гликопротеины, альбумины, аполипопротеины [1, 2]. Поэтому количество выявленных карбонильных групп всех белков (и окисленных и не окисленных) при пересчете на 1 мл сыворотки по известному способу [6] получается меньше и не отражает реально процессы окисления протеинов в организме. В отличие от результатов известного способа [6] полученные результаты заявляемого способа объективно отражают повышенную окислительную модификацию фибриногена при ИБС, патологически потенцирующую дальнейшее развитие и прогрессирование заболевания.

В этом исследовании отмечена положительная корреляция (r=+0,791±0,062, р<0,01) между показателями известного способа оценки окислительной модификации белков и предлагаемого способа определения окислительной модификации фибриногена. Полученный результат свидетельствует о регистрации обоими способами повышенных потенциально атерогенных процессов окисления белков у больных ИБС. Значимой корреляции между показателями содержания фибриногена (мг/мл) в плазме и степени его окислительной модификации нами выявлено не было (r=+0,346±0,041, р>0,05). Последнее указывает на отсутствие взаимосвязи между уровнем фибриногена крови и его окислительной модификацией, что еще раз подчеркивает важность и информативность определения именно степени патологической окислительной модификации фибриногена, а не только его содержания в крови.

Нами также была проведена оценка воспроизводимости заявляемого способа в слепом исследовании (3 параллельных определения) с использованием плазмы крови 20 пациентов, проходящих амбулаторное обследование и выбранных случайным способом. Результаты исследования показали среднюю (на границе с высокой) воспроизводимость заявляемого способа: процент отклонения результатов от средней ±5,5%, корреляция между параллельными определениями высокая (r=+0,881±0,059, р<0,05). Таким образом, воспроизводимость заявляемого способа хорошая.

Таким образом, заявляемый способ является информативным и диагностически значимым, так как позволяет оценить степень патологической окислительной модификации фибриногена - одного из ключевых маркеров воспаления, эндотелиальной дисфункции, нарушений гемостаза, то есть основных патогенетических звеньев сердечно-сосудистой патологии атеросклеротического генеза.

Предлагаемое изобретение занимает непродолжительное время исследования (около 2 часов), его техническое выполнение весьма простое и работа осуществляется одним врачом-лаборантом, для его выполнения требуется только спектрофотометр и необходимые реактивы. В связи с этим заявляемое изобретение может использоваться в условиях клинических биохимических лабораторий для оценки степени окисления фибриногена, потенцирующего его атерогенные свойства.

Источники принятые во внимание

1. Stadtman E.R., Levine R.L. Protein oxidation. // Annals of N.Y. Academy of Sciences, 2000, 899: 191-208.

2. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньщикова Е.Б. Окислительный стресс: биохимический и патофизиологический аспекты. // М: МАИК «Наука/Интерпериодика», 2001, 343 с.

3. Ройтман Е.В., Азизова О.А., Морозов Ю.А., Асейчев А.В. Влияние окисленного фибриногена на свертывающую систему крови. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2004, 138, 5: 467-469.

4. Рутберг Р.А. Простой и быстрый метод определения содержания фибриногена плазмы. // Лабораторное дело, 1961, 6: 6-7.

5. Levine R.L., Garland D., Oliver C.N. at al. (9 authors). Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins. // Methods of Enzymology, 1990, 186: 464-478.

6. Дубинина Е.Е., Бупмистров С.О., Ходов Д.А., Поротов Г.Е. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения. // Вопросы медицинской химии, 1995, 41, 1: 24-26.

Изобретение относится к клинической биохимии, а именно к способам определения окисленных белков, и предназначается для оценки степени окислительной модификации фибриногена в результате воздействия факторов окислительного стресса. Способ включает обработку исследуемой пробы 20% раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ), добавление к осадку 1 мл 0,1 М 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М HCl, инкубацию при комнатной температуре в течение 1 часа, центрифугирование при 3000 g 20 минут, трехкратное промывание осадка по 1 мл раствором этанол: ацетат, взятых в соотношении 1:1, высушивание осадка, его растворение в 2,5 мл 8 М мочевины с последующей оценкой окислительной модификации белков по уровню образовавшихся динитрофенилгидразонов с помощью спектрофотометрической регистрации оптической плотности, при этом к 1 мл цитратной плазмы крови исследуемой пробы добавляют 0,5 мл 20 мМ раствора CaCl₂, инкубируют на водяной бане при 37°С 10 минут, выделяют сгусток фибрина, высушивают его на бумажном фильтре, взвешивают, пересчитывают на концентрацию фибриногена в мг/мл, а перед обработкой 20% раствором ТХУ к сгустку фибриногена добавляют 0,5 мл 0,9% раствора NaCl и затем раствор ТХУ в соотношении 1:1. Изобретение обеспечивает высокую информативность и специализированную целенаправленность способа, занимает непродолжительное время исследования.

Способ определения окислительной модификации белков крови, включающий обработку исследуемой пробы 20%-ным раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ), добавление к осадку 1 мл 0,1 М 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М HCl, инкубацию при комнатной температуре в течение 1 ч, центрифугирование при 3000 g 20 мин, трехкратное промывание осадка по 1 мл раствором этанол: ацетат, взятых в соотношении 1:1, высушивание осадка, его растворение в 2,5 мл 8 М мочевины с последующей оценкой окислительной модификации белков по уровню образовавшихся динитрофенилгидразонов с помощью спектрофотометрической регистрации оптической плотности, отличающийся тем, что к 1 мл цитратной плазмы крови исследуемой пробы добавляют 0,5 мл 20 мМ раствора CaCl₂, инкубируют на водяной бане при 37°С 10 мин, выделяют сгусток фибрина, высушивают его на бумажном фильтре, взвешивают, пересчитывают на концентрацию фибриногена в мг/мл, а перед обработкой 20%-ным раствором ТХУ к сгустку фибриногена добавляют 0,5 мл 0,9%ным раствора NaCl и затем раствор ТХУ в соотношении 1:1.