Способ оценки уровня окислительной модификации белков молочных смесей для детского питания Российский патент 2025 года по МПК G01N21/33 

Изобретение относится к пищевой биотехнологии, а именно к биохимии молока и молочных продуктов, и может быть использовано для определения выраженности окислительной модификации белков молочных смесей для детского питания и адаптированных молочных смесей, предназначенных для детского питания.

Известен способ комплексной оценки содержания продуктов окислительной модификации белков в тканях и биологических жидкостях, включающий определение количества карбонильных продуктов. Оценку степени окислительной модификации белков (ОМБ) в биологическом материале осуществляют при расчете площади под кривой спектра ОМБ, которая равна сумме площадей альдегид-динитрофенилгидразонов (АДНФГ) и кетон-динитрофенилгидразонов (КДНФГ) нейтрального и основного характера:

где

[Патент №2524667 G01N 33/52].

Недостатком известного способа оценки является большой фактический материал, перегруженный числовыми значениями, что затрудняет оценку и анализ полученного материала.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является способ оценки показателей окислительной модификации белков женского и коровьего молока включающий определение содержания карбонилированных белков по реакции взаимодействия окисленных остатков с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) и образованием производных 2,4-динитрофенилгидразона. Оптическую плотность образовавшихся динитрофенилгидразонов в молоке регистрировали спектрофотометрически при следующих длинах волн: 274, 356, 370, 430 и 530 нм. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0. [Соколова М.А., Высокогорский В.Е., Розенфельд Ю.Г., Антонов О.В., Комарова А.А., Подольникова Ю.А. Интенсивность процессов окислительной модификации белков женского и коровьего молока // Вопросы питания. 2022. №4 стр. 83-89]

Недостатками данного способа являются отсутствие сведений о возможности использования аналогичного подхода к определению уровня окислительной модификации белков молочных смесей для детского питания, высокая трудоемкость способа.

Техническим результатом данного способа является возможность использования способа к определению уровня окислительной модификации белков молочных смесей для детского питания, снижение трудоемкости способа.

Результат достигается тем, что способ оценки уровня окислительной модификации белков молочных смесей для детского питания, включающий определение содержания карбонилированных белков, оценку уровня осуществляют по коэффициенту антиокислительного резерва молочных продуктов, который рассчитывают по формуле:

К_р=С_АДНФГuv/С_КДНФГuv,

где, К_р - коэффициент антиокислительного резерва молочных продуктов;

С_АДНФГuv ^_ показатель экстинкции альдегид-динитрофенилгидразонов в ультрафиолетовой части спектра у.е./мл;

С_КДНФГuv - показатель экстинкции кетон-динитрофенилгидразонов в ультрафиолетовой части спектра у.е./мл;

причем К_р=0,8-1,2 указывает на низкий уровень антиокислительного резерва молочного продукта;

К_р=1,3-1,8 указывает на средний уровень антиокислительного резерва молочного продукта;

К_р=1,9-2,2 указывает на высокий уровень антиокислительного резерва молочного продукта.

Использование в способе, для оценки уровня окислительной модификации белков предложенной формулы, позволяет оценить степень окислительной модификации белков молочных смесей для детского питания, а также снижает трудоемкость способа за счет определения меньшего количества показателей.

В основе способа определения продуктов окислительной модификации белков лежит метод R.L. Levine в модификации Е.Е. Дубининой.

Оценка уровня окислительной модификации белков молочных смесей для детского питания осуществляется следующим образом.

Способ применяют для исследования молочных смесей для детского питания на основе молока животного происхождения.

Молочные смеси для детского питания для исследования готовят согласно инструкции в количестве 40 мл. После чего берут две пробирки и вносят 0,2 мл подготовленной молочной смеси для детского питания. В первую - контрольную пробирку добавляют 1 мл 20% ТХУ кислоты и 1 мл 2М раствор HCl, в опытную пробирку добавляют 10 мМ -FeSO₄ и 0,3 мМ Н₂О₂, после чего пробирку инкубируют в течение 15 минут при температуре 37°С. После инкубации во вторую пробирку, добавляют 1 мл 20% ТХУ кислоты и 1 мл 2,4-ДНФГ. Далее обе пробирки контрольную и опытную инкубируют при температуре 19-24°С в течение 1 часа. Затем пробы центрифугируют 10 мин со скоростью 3000 об/мин. Надосадочную жидкость пробирок сливают, осадок трижды промывают смесью этанол-этилацетата (1:1) для экстракции липидов и остатка 2,4-ДНФГ, который не прореагировал с карбонильными группами окисленных белков. Осадок пробирок подсушивают с целью удаления остатков этанол-этилацетата. К подсушенному осадку добавляют по 5 мл 8М мочевины и кипятят до полного растворения осадка.

На спектрофотометре производят замер оптической плотности опытной пробы против контрольной пробы при длинах волн: 270 и 363 нм в кварцевых кюветах с толщиной оптического слоя 1 см.

Определяют С_АДНФГuv (λ=270 нм) - показатель экстинкции альдегид-динитрофенилгидразонов в ультрафиолетовой части спектра у.е./мл;

С_КДНФГuv (λ=363 нм) - показатель экстинкции кетон динитрофенилгидразонов в ультрафиолетовой части спектра у.е./мл.

По полученным данным определяют коэффициент антиокислительного резерва молочной смеси, который рассчитывают по формуле:

Кр=С_АДНФГuv/_{СКДНФГuv}, где,

К_р - коэффициент антиокислительного резерва молочных продуктов;

С_АДНФГuv - показатель экстинкции альдегид-динитрофенилгидразонов в ультрафиолетовой части спектра у.е./мл;

С_КДНФГuv ^_ показатель экстинкции кетон-динитрофенилгидразоны в ультрафиолетовой части спектра у.е./мл;

Если коэффициент антиокислительного резерва в молочных смесях для детского питания окажется Кр=0,8-1,2 - это свидетельствует о низком уровне антиокислительной активности, который наблюдается при значительном воздействии абиогенных и биогенных факторов и свидетельствует о высокой степени деструкции белков молока, что может приводить к снижению усвоения белков молока [Van Lieshout G. A. A. et al. How processing can affect milk protein digestion and general physiological results: a systematic review // Critical reviews in the field of food science and Dietetics. - 2020. - Vol. 60. - no. 14. - pp. 2422-2445]; если Kp=l,3-1,8 - свидетельствует о среднем уровне антиокислительной активности, который наблюдается при умеренном воздействии абиогенных и биогенных факторов и свидетельствует об умеренной степени окислительной деструкции белков молока. Значения Кр=1,8-2,2 - свидетельствует о высоком уровне антиокислительной активности, что соответствует грудному молоку, не подвергнутому каким-либо абиогенными факторами.

Пример 1. Молочную смесь для детского питания «NAN комфорт» для исследования готовят, согласно инструкции в количестве 40 мл дают, настояться в течение 10 минут.

Настоявшуюся молочную смесь для детского питания по 0,2 мл вносят в две пробирки. В первую - контрольную пробирку добавляют 1 мл 20% ТХУ кислоты и 1 мл 2 М раствор HCl, во вторую пробирку добавляют 10 мМ FeSO₄ и 0,3 мМ Н₂О₂, и ставят пробирку на инкубацию в течение 15 минут при температуре 37°С. После инкубации во вторую - опытную пробирку добавляют 1 мл 20% ТХУ кислоты и 1 мл 2,4-ДНФГ. Далее осуществляют инкубацию обеих пробирок контрольной и опытной при температуре 19-24°С в течение 1 часа. Затем пробы двух пробирок центрифугируют 10 мин со скоростью 3000 об/мин.

Надосадочную жидкость обеих пробирок сливают, осадок трижды промывают смесью этанол-этилацетат (1:1) для экстракции липидов и остатка 2,4-ДНФГ, который не прореагировал с карбонильными группами окисленных белков. Отмытый осадок обеих пробирок подсушивают с целью удаления остатков этанол-этилацетата. К подсушенному осадку обеих пробирок добавляют по 5 мл 8М мочевины и выдерживают 5 мин в кипящей бане до полного растворения осадка.

На спектрофотометре производят замеры оптической плотности опытной пробы против контрольной пробы при длинах волн: 270 и 363 нм в кварцевых кюветах с толщиной оптического слоя 1 см.

По полученным данным определяют коэффициент антиокислительного резерва молочной смеси, который рассчитывают по формуле:

Кр=С_АДНФГuv/С_КДНФГuv, где,

где, К_р - коэффициент антиокислительного резерва молочных продуктов;

С_АДНФГuv - показатель экстинкции альдегид-динитрофенилгидразонов в ультрафиолетовой части спектра у.е./мл;

С_КДНФГuv - показатель экстинкции кетон-динитрофенилгидразоны в ультрафиолетовой части спектра у.е./мл.

После расчета коэффициента получили результат Кр=1,67, что свидетельствует о среднем уровне антиокислительной активности молочной смеси для детского питания «NAN комфорт», который наблюдается при умеренном воздействии абиогенных и биогенных факторов и свидетельствует об умеренной степени окислительной деструкции белков молока.

Аналогично для молочных смесей «Малютка», «Nutrilon Premium» и «Беллакт», были проведены исследования и рассчитан коэффициент антиокислительного резерва 1,52, 1,35 и 1,36 соответственно.

Это свидетельствует о среднем уровне антиокислительной активности, и наблюдается при умеренном воздействии абиогенных и биогенных факторов степени окислительной деструкции белков молочных смесей для детского питания.

Пример 2. Ультрапастеризованное коровье молоко «Тема» разводят 1:3 дистиллированной водой для получения 40 мл смеси, затем полученную смесь вносят по 0,2 мл в две пробирки. В первую - контрольную пробирку, добавляют 1 мл 20% ТХУ кислоты и 1 мл 2 М раствор HCl, во вторую - опытную пробирку, добавляют 10 мМ FeSO₄ и 0,3 мМ H₂O₂, ставят пробирку на инкубацию в течение 15 минут при температуре 37°С. После инкубации во вторую пробирку добавляют 1 мл 20% ТХУ кислоты и 1 мл 2,4-ДНФГ. Далее осуществляют инкубацию двух пробирок при температуре 19-24°С в течение 1 часа. Затем пробы двух пробирок центрифугируют 10 мин со скоростью 3000 об/мин.

Надосадочную жидкость обеих пробирок сливают, осадок трижды промывают смесью этанол-этилацетат (1:1) для экстракции липидов и остатка 2,4-ДНФГ, который не прореагировал с карбонильными группами окисленных белков. Отмытый осадок обеих пробирок подсушивают с целью удаления остатков этанол-этилацетата. К подсушенному осадку обеих пробирок добавляют по 5 мл 8М мочевины и выдерживают 5 мин в кипящей бане до полного растворения осадка

На спектрофотометре производят замеры оптической плотности опытной пробы против контрольной пробы при длинах волн: 270 и 363 нм в кварцевых кюветах с толщиной оптического слоя 1 см.

По полученным данным определяют коэффициент антиокислительного резерва молочной смеси, который рассчитывают по формуле:

Кр=С_АДНФГuv/С_КДНФГuv где,

где, К_р - коэффициент антиокислительного резерва молочных продуктов;

С_АДНФГuv - показатель экстинкции альдегид-динитрофенилгидразонов в ультрафиолетовой части спектра у.е./мл;

С_КДНФГuv - показатель экстинкции кетон-динитрофенилгидразоны в ультрафиолетовой части спектра у.е./мл.

После расчета коэффициента получили результат К_р=1,08, что свидетельствует о низком уровне антиокислительной активности ультрапастеризованного коровьего молока «Тема», который наблюдается при значительном воздействии абиогенных и биогенных факторов и свидельствует о высокой степени деструкции белков молока, что может приводить к снижению усвоения белков молока.

Пример 3. Грудное молоко по 0,2 мл и вносят в две пробирки. В первую - контрольную пробирку, добавляют 1 мл 20% ТХУ кислоты и 1 мл 2 М раствор HCl, во вторую - опытную пробирку, вносят 10 мМ FeSO₄ и 0,3 мМ Н₂О₂, ставят вторую пробирку на инкубацию в течение 15 минут при температуре 37°С. После инкубации в опытную пробирку добавляют 1 мл 20% ТХУ кислоты и 1 мл 2,4-ДНФГ. Далее осуществляют инкубацию обеих пробирок при температуре 19-24°С в течение 1 часа. Затем пробы двух пробирок центрифугируют 10 мин со скоростью 3000 об/мин.

Надосадочную жидкость обеих пробирок сливают, осадок трижды промывают смесью этанол-этилацетат (1:1) для экстракции липидов и остатка 2,4-ДНФГ, который не прореагировал с карбонильными группами окисленных белков. Отмытый осадок обеих пробирок подсушивают с целью удаления остатков этанол-этилацетата. К подсушенному осадку обеих пробирок добавляют по 5 мл 8М мочевины и выдерживают 5 мин в кипящей бане до полного растворения осадка

Производили замеры оптической плотности опытной пробы против контрольной пробы при длинах волн: 270 и 363 нм в кварцевых кюветах с толщиной оптического слоя 1 см.

По полученным данным определяют коэффициент антиокислительного резерва грудного молока, который рассчитывают по формуле:

К_р=С_АДНФГuv/С_КДНФГuv, где,

где, К_р - коэффициент антиокислительного резерва молочных продуктов;

С_АДНФГuv - показатель экстинкции альдегид-динитрофенилгидразонов в ультрафиолетовой части спектра у.е./мл;

С_КДНФГuv - показатель экстинкции кетон-динитрофенилгидразоны в ультрафиолетовой части спектра у.е./мл.

После расчета коэффициента получили результат К_р=1,89, что свидетельствует о высоком уровне антиокислительной активности грудного молока, что соответствует грудному молоку, не подвергнутому каким-либо абиогенными факторам.

Для сравнения показателей коэффициент антиокислительного резерва различных молочных продуктов для детского питания представлен в таблице 1.

Из полученных результатов, можно сделать вывод о том, что молочные смеси для детского питания приближены к грудному молоку и у них средний уровень антиокислительной активности, у коровьего молока он на много ниже.

Заявляемый способ прост и более экономичен в осуществлении и применим к исследованию уровня окислительной модификации белков в молочных смесях для детского питания. Расчет коэффициента антиокислительного резерва молочных смесей для детского питания позволяет выявить ранние нарушения соотношений производных аминокислот нейтрального и основного характера, что повышает информативную ценность лабораторного исследования.

Заявляемый способ оценки уровня окислительной модификации белков может быть использован в лабораториях для определения стадии развития карбонильного стресса при производстве молочных смесей для детского питания на основе молока животного происхождения.

Рекомендуется для исследования антиокислительный свойств молочных смесей для детского питания, молочных продуктов и адаптированных молочных смесей.

Способ оценки уровня окислительной модификации белков молочных смесей для детского питания апробирован в лаборатории кафедры продуктов питания и пищевой биотехнологии ФГБОУ ВО Омский ГАУ.

Изобретение относится к пищевой биотехнологии, а именно к биохимии молока и молочных продуктов, и может быть использовано для определения выраженности окислительной модификации белков молочных смесей для детского питания и адаптированных молочных смесей, предназначенных для детского питания. Способ оценки уровня окислительной модификации белков молочных смесей для детского питания включает определение содержания карбонилированных белков. В две пробирки вносят по 0,2 мл подготовленной молочной смеси для детского питания, в контрольную пробирку добавляют 1 мл 20% ТХУ кислоты и 1 мл 2М раствора HCl, в опытную пробирку добавляют 10 мМ - FeSO₄ и 0,3 мМ Н₂О₂, затем опытную пробирку инкубируют в течение 15 минут при температуре 37°С и добавляют 1 мл 20% ТХУ кислоты и 1 мл 2,4-ДНФГ, обе пробирки инкубируют при температуре 19-24°С в течение 1 часа, после чего центрифугируют 10 мин со скоростью 3000 об/мин, сливают надосадочную жидкость из пробирок, осадок трижды промывают смесью этанол-этилацетата (1:1) и подсушивают, добавляют по 5 мл 8М мочевины и кипятят до полного растворения осадка, измеряют на спектрофотометре оптическую плотность опытной пробы относительно контрольной пробы при длинах волн 270 и 363 нм, определяют показатель экстинкции альдегид-динитрофенилгидразонов С_АДНФГuv при λ=270 нм и показатель экстинкции кетон-динитрофенилгидразонов С_КДНФГuv при λ=363 нм, рассчитывают коэффициент антиокислительного резерва молочной смеси. Техническим результатом является возможность использования способа для определения уровня окислительной модификации белков молочных смесей для детского питания, снижение трудоемкости способа. 1 табл.

Способ оценки уровня окислительной модификации белков молочных смесей для детского питания, включающий определение содержания карбонилированных белков, отличающийся тем, что в две пробирки вносят по 0,2 мл подготовленной молочной смеси для детского питания, в контрольную пробирку добавляют 1 мл 20% ТХУ кислоты и 1 мл 2М раствора HCl, в опытную пробирку добавляют 10 мМ - FeSO₄ и 0,3 мМ Н₂О₂, затем опытную пробирку инкубируют в течение 15 минут при температуре 37°С и добавляют 1 мл 20% ТХУ кислоты и 1 мл 2,4-ДНФГ, обе пробирки инкубируют при температуре 19-24°С в течение 1 часа, после чего центрифугируют 10 мин со скоростью 3000 об/мин, сливают надосадочную жидкость из пробирок, осадок трижды промывают смесью этанол-этилацетата (1:1) и подсушивают, добавляют по 5 мл 8М мочевины и кипятят до полного растворения осадка, измеряют на спектрофотометре оптическую плотность опытной пробы относительно контрольной пробы при длинах волн 270 и 363 нм, определяют показатель экстинкции альдегид-динитрофенилгидразонов С_АДНФГuv при λ=270 нм и показатель экстинкции кетон-динитрофенилгидразонов С_КДНФГuv при λ=363 нм, рассчитывают коэффициент антиокислительного резерва молочной смеси по формуле:

К_р - коэффициент антиокислительного резерва молочных продуктов;

С_АДНФГuv - показатель экстинкции альдегид-динитрофенилгидразонов в ультрафиолетовой части спектра, у.е./мл;

С_КДНФГuv - показатель экстинкции кетон-динитрофенилгидразонов в ультрафиолетовой части спектра, у.е./мл,

причем К_р=0,8-1,2 свидетельствует о низком уровне антиокислительного резерва молочного продукта;

К_р=1,3-1,8 свидетельствует о среднем уровне антиокислительного резерва молочного продукта;

К_р=1,9-2,2 свидетельствует о высоком уровне антиокислительного резерва молочного продукта.