АППАРАТ ДЛЯ СИНТЕЗА ОЛИГО(ПОЛИ)НУКЛЕОТИДОВ Российский патент 2007 года по МПК C12M1/00 

Изобретение относится к устройствам, предназначенным для синтеза фрагментов молекул ДНК в автоматическом режиме, и может использоваться в молекулярной биологии, генной инженерии, медицине.

Известны аппараты для синтеза олиго(поли)нуклеотидов, в основу которых положены реакторы проточного типа.

Например, известен синтезатор полинуклеотидов, содержащий реактор проточного типа, внутри которого размещен твердофазный носитель, блоки размещения и подачи основных и вспомогательных реагентов, блок смешивания мономера и активирующего агента, который выполнен в виде последовательно соединенных емкости, клапана и канала [Патент США N 4483964, МПК С12М 1/00, 1984]. Поскольку для синтеза используется только один реактор, этот синтезатор не позволяет синтезировать несколько полинуклеотидов различной структуры одновременно, также он имеет высокий расход дорогостоящих реактивов.

Известен также другой синтезатор олиго(поли)нуклеотидов, содержащий реактор проточного типа, в рабочем объеме которого размещен твердофазный носитель, связанный с нуклеотидным компонентом, смеситель для быстрого смешивания реагентов, содержащий камеру на входе и пористую перегородку, размещенную на входе реактора, блоки размещения и подачи реагентов, и размещения и подачи промывающей жидкости, блок нагрева и поддержания заданной температуры реактивов, микродозатор и блок управления [Патент РФ № 2073008 МПК С07Н 21/00, С12М 1/00]. У этого синтезатора за счет использования микродозатора и подогрева реагентов до заданной температуры расход реагентов существенно ниже, чем у упомянутого выше аппарата, однако возможность одновременного синтеза различных по структуре олиго(поли) нуклеотидов также отсутствует, так как синтез осуществляется только в одном реакторе.

Известен аппарат, требующий меньшего объема реагентов для выхода синтезируемого продукта, эквивалентного описанным выше аппаратам. Этот аппарат предназначен для модификации молекул, прикрепленных к твердофазному носителю, который включает множество носителей субстрата (субстратом является упомянутая модифицируемая молекула на твердофазном носителе), множество камер, каждая из которых содержит отдельный реагент, способный участвовать в процессе модификации молекулы, средство для индивидуального переноса множества выбранных носителей субстрата для последовательного контакта со множеством выбранных реагентов, содержащихся в соответствующих камерах [Патент США N 5288468, МПК С12М 001/00; G05B 013/00]. Каждый из множества носителей субстрата последовательно контактирует со множеством реагентов, располагающихся в отдельных камерах. В результате таких последовательных контактов на твердофазном носителе получается желаемая молекула. Недостатком этого аппарата является высокая вероятность загрязнения одного реагента другим или другими. При его работе носитель субстрата последовательно погружается в камеры с различными реагентами. Между погружениями каждый носитель субстрата погружается в промывочный реактив, однако и после этого на нем могут оставаться следы другого, предыдущего реагента, что отрицательно сказывается на качестве синтеза и снижает выход синтезируемого продукта.

Известен аппарат, позволяющий синтезировать множество олигонуклеотидов различной структуры одновременно. Аппарат содержит реакционную камеру, внутри которой располагаются реакционные колонки, открытые в атмосферу реакционной камеры, систему подачи химических реагентов, включающую резервуары для химических реагентов, трубопроводную арматуру с клапанами и выходную линию подачи, выходящую во внутреннее пространство камеры [Патент США № 5368823, МПК С12М 001/00]. Трубопроводная арматура соединяет резервуары, содержащие химические реагенты, с выходной линией подачи так, что указанная линия подачи может быть заполнена одним или несколькими указанными химическими реагентами. В реакционные колонки помещается носитель для выращивания на нем целевой молекулы или фрагмента ДНК. Выходная линия подачи химических реагентов перемещается внутри реакционной камеры с помощью движущего устройства от одной реакционной колонки к другой, подавая в них химические реактивы в заданной последовательности. В результате в реакционных колонках на носителе образуется целевой продукт. Химические реагенты после этого из реакционных ячеек удаляются с помощью вакуумного насоса.

Этот аппарат является ближайшим аналогом предлагаемого аппарата для синтеза олиго(поли)нуклеотидов и принят за прототип изобретения. В прототипе химические реагенты подаются в реакционные ячейки последовательно, а удаляются одновременно. Последовательная подача удлиняет время цикла синтеза, а одновременное удаление отработанных реактивов приводит к тому, что в разных колонках одни и те же химические реакции протекают за различное время, поэтому не для всех колонок, а соответственно не для всех синтезируемых олиго(поли)нуклеотидов, время проведения реакции будет оптимальным, что может привести к получению нестабильных олиго(поли)нуклеотидов.

Предлагаемое изобретение решает задачу создания аппарата для синтеза олиго(поли)нуклеотидов, который позволяет выполнять синтез большого количества олиго(поли)нуклеотидов разной структуры одновременно, сократить время цикла синтеза, и, соответственно, сократить общее время синтеза, а также обеспечить стабильность синтезированных олиго(поли)нуклеотидов.

Поставленная задача решается тем, что предлагается аппарат для синтеза олиго(поли)нуклеотидов, включающий реакционную камеру, имеющую внутреннее пространство, заполненное инертным газом, в котором размещены отдельные реакционные ячейки в форме емкостей, открытых во внутреннее пространство названной реакционной камеры, а также средство подачи химических реагентов в названные реакционные ячейки и средство удаления химических реагентов из них, у которого средство подачи химических реагентов в реакционные ячейки содержит отдельные питающие элементы, контейнеры с химическими реагентами, выполненные с возможностью размещения в них названных питающих элементов, и манипулятор, установленный во внутреннем пространстве реакционной камеры и выполненный с возможностью присоединения к нему наполненных химическими реагентами питающих элементов и удаления из присоединенных к нему питающих элементов названных химических реагентов, причем названные манипулятор, контейнеры с химическими реагентами и реакционные ячейки установлены с возможностью изменения их взаимного пространственного положения таким образом, что манипулятор устанавливается напротив одного из контейнеров с химическими реагентами при присоединении к нему питающих элементов и устанавливается напротив реакционных ячеек при удалении из питающих элементов химических реагентов.

Для изменения взаимного пространственного положения манипулятора, контейнеров с химическими реагентами и реакционных ячеек может быть установлен манипулятор с возможностью перемещения в горизонтальном и/или вертикальном направлении, или могут быть установлены контейнеры с химическим реагентом и реакционные ячейки с возможностью их перемещения в горизонтальном и/или вертикальном направлении.

Реакционные ячейки для экономии места целесообразно располагать рядами.

Питающие элементы целесообразно располагать в контейнере с химическим реагентом вертикально для обеспечения одинакового наполнения их химическим реагентом, так как общий уровень реагента в контейнере должен поддерживаться постоянным, а также это упрощает подсоединение питающих элементов к манипулятору. В этом случае питающие элементы целесообразно располагать рядами, аналогично рядам реакционных ячеек, что значительно упрощает наполнение реакционных ячеек химическими реагентами.

Питающие элементы могут располагаться также и наклонно, под углом к вертикали - в этом случае одинаковое наполнение их химическим реагентом также обеспечивается.

Питающие элементы должны присоединяться к манипулятору таким образом, чтобы при удалении из них химических реагентов они попадали в соответствующие реакционные ячейки, поэтому они могут располагаться, например, соосно с этими ячейками, если питающие элементы расположены вертикально.

Питающие элементы могут присоединяться к манипулятору с помощью управляемого разъемного средства, позволяющего подключать к манипулятору в определенный момент процесса только требуемые питающие элементы.

Удаление из питающих элементов химического реагента и перемещение его в реакционные ячейки целесообразно осуществлять за счет избыточного давления.

В аппарате используется несколько контейнеров с химическими реагентами и каждый из них может соединяться со своим резервуаром каналом для обеспечения непрерывной подпитки и поддержания уровня жидкости в контейнере. Также контейнеры могут наполняться вручную, сверху.

Съемные питающие элементы могут быть выполнены различной удобной для выполнения их функций формы, например они могут иметь форму трубок цилиндрической или конической формы.

Поскольку аппарат выполняет множество сложных операций, его целесообразно снабдить средством управления и контроля, которое может быть выполнено в форме программируемой ЭВМ или контроллеров.

Средство удаления химических реагентов из реакционных ячеек может быть выполнено в виде источника вакуума, например вакуумного насоса, соединенного с реакционными ячейками через емкость для сбора отработанных реактивов.

Один из вариантов выполнения предлагаемого аппарата изображен на чертеже, где 1 - реакционная камера, 2 - реакционная ячейка, 3 - манипулятор, 4 - питающий элемент, 5 - контейнер с химическим регентом, 6 - средство управления и контроля, 7 - сливная камера, 8 - вакуумный насос, 9 - дозирующее средство, 10 - резервуар с химическим реагентом, 11 - емкость для сбора отработанных химических реагентов, 12 - источник инертного газа, 13 - жидкостный трубопровод, 14 - жидкостный клапан, 15 - сливной клапан, 16 - газовый клапан, 17 - газовый клапан, 18 - газовый трубопровод, 19 - газовый клапан, 20 - разъемное средство, 21 - сливная камера.

В реакционной камере 1 размещены контейнеры с химическими реагентами 5, манипулятор 3 и реакционные ячейки 2.

Каждый контейнер с химическим реагентом 5 соединен с соответствующим резервуаром с химическим реагентом 10 посредством жидкостного трубопровода 13 через жидкостный клапан 14 таким образом, что в каждом контейнере с химическим реагентом 5 может поддерживаться необходимый уровень реагента за счет регулируемой подачи реагента из резервуара 10 в контейнер 5 под действием избыточного давления газа, поступающего по трубопроводу 18 от источника инертного газа 12 через газовый клапан 19. В каждом контейнере 5 размещены питающие элементы 4.

Манипулятор 3 имеет управляемое разъемное средство 20 для подсоединения к нему питающих элементов 4. Манипулятор снабжен также дозирующим средством 9 для заполнения химическим реагентом и опустошения подсоединенных к нему питающих элементов 4 и может перемещаться вертикально и горизонтально.

Реакционные ячейки 2 располагаются в реакционной камере 1 таким образом, что их входы открыты в пространство реакционной камеры 1, а их выходы открыты в сливную камеру 21.

В сливной камере 21 непосредственно под реакционными ячейками 2 расположен сливной коллектор 7, соединенный через сливной клапан 15 с емкостью для сбора отработанных химических реагентов 11, которая в свою очередь подключена к вакуумному насосу 8.

Источник инертного газа 12 соединен с реакционной камерой 1 через газовый клапан 16 и к сливной камере - через газовый клапан 17 для заполнения реакционной камеры инертным газом и выравнивания давления между реакционной и сливной камерами после прокачки химических реагентов через реакционные ячейки 2.

Манипулятор 3, вакуумный насос 8, дозирующее средство 9, клапаны 14, 15, 16, 17, 19 и разъемное средство 20 управляются с помощью средства управления и контроля (ЭВМ) 6.

В позиции А манипулятор находится над контейнером с химическим реагентом, где происходит присоединение к нему питающих элементов и наполнение питающих элементов соответствующим химическим реактивом с помощью дозирующего средства 9.

В позиции Б манипулятор находится над реакционными ячейками, где происходит выпуск из питающих элементов химических реагентов в соответствующие реакционные ячейки.

Предлагаемый аппарат работает следующим образом.

Внутреннее пространство реакционной камеры 1 от источника 12 заполняется инертным газом.

В реакционные ячейки 2 помещается носитель, на котором осуществляется синтез целевого олиго(поли)нуклеотида, который может быть выполнен из стекла, пластика и других пригодных для этих целей материалов. Питающие элементы 4 помещаются в контейнеры с химическими реагентами 5. Количество контейнеров равно количеству реагентов, необходимых для выполнения процесса синтеза.

Манипулятор 3 по команде средства управления и контроля (ЭВМ) 6 устанавливается в позицию А напротив контейнера 5 с первым реагентом. Перемещаясь в вертикальном направлении, манипулятор опускается и подсоединяет к себе питающие элементы 4. Следует отметить, что манипулятор может подсоединять питающие элементы выборочно, как запрограммировано средством управления и контроля. Далее происходит заполнение питающих элементов химическим реагентом, после чего манипулятор поднимается вертикально, затем перемещается в горизонтальном направлении по заданной ему средством управления и контроля 6 траектории и устанавливается напротив реакционных ячеек 2 в позицию Б таким образом, что питающие элементы располагаются соосно с реакционными ячейками. С помощью дозирующего средства 9 из всех питающих элементов выдавливается химический реагент в соответствующие реакционные ячейки. После этого манипулятор перемещается обратно в позицию А и возвращает питающие элементы на исходное место в контейнер с реагентом. После заданного средством управления интервала времени, необходимого для протекания химической реакции, включается вакуумный насос 8, открывается клапан 15, соединяющий сливной коллектор 7 с емкостью для сбора отработанных реагентов 11, в которую одновременно из всех реакционных ячеек сливается отработанный реагент.

Далее аналогичным образом в реакционные ячейки подаются другие химические реагенты в последовательности, необходимой для выполнения процесса синтеза. При этом манипулятор выполняет те же действия с другими контейнерами, питающими элементами и, соответственно, другими химическими реагентами, которые в итоге все попадают в соответствующие реакционные ячейки в необходимом количестве и необходимой последовательности. После этого полученные олиго(поли)нуклеотиды вместе с носителем извлекаются из реакционных ячеек.

Таким образом описанный аппарат позволяет производить синтез большого количества олиго(поли)нуклеотидов различной структуры одновременно, причем в предлагаемом аппарате химические реактивы подаются во все задействованные на данном шаге синтеза реакционные ячейки одновременно и удаляются изо всех реакционных ячеек тоже одновременно. Поэтому предлагаемый аппарат позволяет минимизировать время цикла синтеза и, как следствие, сократить общее время синтеза. Также предлагаемый аппарат дает возможность выдержать одинаковое и оптимальное время протекания реакции во всех реакционных ячейках и, как следствие, позволяет получить одинаково стабильные олиго(поли)нуклеотиды во всех реакционных ячейках.

Изобретение относится к устройствам, предназначенным для синтеза фрагментов молекул ДНК в автоматическом режиме, и может использоваться в молекулярной биологии, генной инженерии, медицине. Аппарат включает реакционную камеру, в которой размещены реакционные ячейки и средство подачи химических реагентов в реакционные ячейки, содержащее питающие элементы, контейнеры с химическими реагентами, выполненные с возможностью размещения в них питающих элементов, и манипулятор, выполненный с возможностью присоединения к нему питающих элементов, наполнения их химическими реагентами и удаления из них названных химических реагентов, причем манипулятор, контейнеры с химическими реагентами и реакционные ячейки установлены с возможностью изменения их взаимного пространственного положения. Аппарат позволяет выполнять синтез олиго(поли)нуклеотидов разной структуры одновременно, сократить время цикла синтеза, сократить общее время синтеза. 14 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Аппарат для синтеза олиго(поли)нуклеотидов, включающий реакционную камеру, имеющую внутреннее пространство, заполненное инертным газом, в котором размещены отдельные реакционные ячейки в форме емкостей, открытых во внутреннее пространство названной реакционной камеры, а также средство подачи химических реагентов в названные реакционные ячейки и средство удаления химических реагентов из них, отличающийся тем, что средство подачи химических реагентов в реакционные ячейки содержит отдельные питающие элементы, контейнеры с химическими реагентами, выполненные с возможностью размещения в них питающих элементов, и манипулятор, установленный во внутреннем пространстве реакционной камеры и выполненный с возможностью присоединения к нему питающих элементов, наполнения питающих элементов химическими реагентами и удаления из присоединенных к нему питающих элементов названных химических реагентов, причем названные манипулятор, контейнеры с химическими реагентами и реакционные ячейки установлены с возможностью изменения их взаимного пространственного положения таким образом, что манипулятор устанавливается напротив одного из контейнеров с химическими реагентами при присоединении к нему питающих элементов и наполнении их химическим реагентом и устанавливается напротив реакционных ячеек при удалении из питающих элементов химических реагентов.2. Аппарат по п.1, отличающийся тем, что манипулятор установлен с возможностью перемещения в горизонтальном и/или вертикальном направлении.3. Аппарат по п.1, отличающийся тем, что каждый контейнер с химическим реагентом установлен с возможностью перемещения в горизонтальном и/или вертикальном направлении.4. Аппарат по п.1, отличающийся тем, что реакционные ячейки установлены с возможностью перемещения в горизонтальном и/или вертикальном направлении.5. Аппарат по п.1, отличающийся тем, что реакционные ячейки расположены в реакционной камере рядами.6. Аппарат по п.1, отличающийся тем, что питающие элементы располагаются в контейнере с химическим реагентом рядами и вертикально.7. Аппарат по п.1, отличающийся тем, что питающие элементы присоединяются к манипулятору соосно с соответствующими им реакционными ячейками.8. Аппарат по п.1, отличающийся тем, что питающие элементы выполнены в виде цилиндрических или конических трубок.9. Аппарат по п.1, отличающийся тем, что каждый контейнер с химическим реагентом соединен посредством трубопровода с резервуаром, содержащим этот химический реагент.10. Аппарат по п.1, отличающийся тем, что он снабжен средством управления и контроля, выполненным в форме программируемой ЭВМ.11. Аппарат по п.1, отличающийся тем, что средство удаления химических реагентов из реакционных ячеек содержит емкость для химических реагентов, соединенную с каждой реакционной ячейкой, и вакуумный насос, установленный таким образом, чтобы обеспечивать поступление химических реагентов из реакционных ячеек в названную емкость.12. Аппарат по п.1, отличающийся тем, что манипулятор содержит дозирующее средство для наполнения присоединенных к нему питающих элементов химическими реагентами и удаления из них химических реагентов.13. Аппарат по п.12, отличающийся тем, что удаление химического реагента из питающего элемента осуществляется дозирующим средством посредством избыточного давления.14. Аппарат по п.1, отличающийся тем, что манипулятор содержит разъемное средство для присоединения к нему питающих элементов.15. Аппарат по п.14, отличающийся тем, что разъемное средство выполнено с возможностью выборочного присоединения к манипулятору питающих элементов.