Способ синтеза олиго/поли/ нуклеотидов и устройство для его осуществления Советский патент 1992 года по МПК C07H21/00 

Изобретение относится к области био- рганической химии и может быть использовано в молекулярной биологии, генетической инженерии, медицине.

Известен способ синтеза олиго(по- ли)нуклеотидов и синтезатор, применяемый для реализации этого способа, который включает реактор в виде сосуда проточного типа, внутри которого размещен твердофазный носитель, блок подачи реагентов, блок смешивания мономера и активирующего агента, который выполнен в виде последовательно соединенных емкости, клапана и трубопровода.

Недостатки способа и устройства заключаются в малой производительности из- за длительного процесса смешивания и подачи смеси в реактор, а также повышенного расхода реагентов

Известен способ синтеза полинуклеоти- дов и устройство для его реализации, взятые

за наиболее близкие. Способ заключается в смешивании З -Н-фосфонатов защищенных нуклеозидов с дегидратирующим агентом, конденсации с 5 -ОН-концевой группой защищенного нуклеозида, связанного с твердым носителем, с последующим удалением б -О-защитной группы, повторении этих операций до получения полинуклеотида с необходимым числом мономерных звеньев, окислении полинуклеотид-Н-фосфоната и отделении его от носителя.

Синтезатор, с помощью которого осуществляется способ синтеза, включает реактор в виде сосуда проточного типа, внутри которого размещен твердофазный носитель, блоки размещения и подачи оснопных и вспомогательных реагентов, выполненные в виде сосудов и трубопроводов, клапанов смешивания и газовой системы. Смешивание исходного мономера и активирующего агента осуществляется в канале,

N vj

CJ

ю

IGK i

вход которого связан с выходом блоча размещения и подачи реактивов, а выход - с входом реактора

Недостатком способа и устройства является низкая производительность и повышенный расход исходных компонентов из-за большого времени, предусмотренного для смешивания реагентов и их подачи в реактор.

Цель изобретения состоит в повышении производительности способа и устройства за счет сокращения времени проведения синтеза и экономии используемых реагентов

Поставленная цель достигается тем, что в способе синтеза олиго(поли)нуклеогидов, включающем промывку носителя с закрепленным на нем нуклеозидом, смешивание 5 -0-защищенчого нуклеозид-З -Н-фосфона- та с дегидратирующим агентом, конденсацию с 5 -ОН-группой нуклеозидного компонента, закрепленного на носителе, последующее удаление 5 -0-ззщитной i руп- пы, повторение этих операций до получения полинуклеотид-Н-фосфоната с нужным числом мономерных звеньев, окисление пол инуклеотид-Н-фосфоната до полинук- леотида, отщепление его от носителя, в качестве дегидратирующего агента используют хлорангидриды кислот в соотношении 0,9-1,5экв. на 1 экв. нуклеозид-З -Н-фосфо- ната, их смешивание и подачу на носитель проводят за время tcw. (0,01-1,0) с, а конденсацию - за время (0,5-2,5) с, причем эти операции повторяют 2-20 раз при температуре реагентов на всех стадиях синтеза 30- 65°С.

Поставленная цель достигается тем, что устройство для синтеза олиго(поли)нуклео- тидоз, содержащее реактор проточного типа, где размещен носитель, связанный с нуклеозидом, блок размещения и подачи основных реактивов, блок размещения и подачи вспомогательных реактивов, блок управления, смеситель, вход которого соединен с выходом блока размещения и подачи основных реактивов, а выход смесителя соединен с входом реактора, запорный клапан, соединенный с выходом реактора дополнительно содержит блок нагрева и поддержания заданной температуры растворов реагентов, смеситель содержит камеру и пористую перегородку из нейтрального материала, которая расположена непосредственно на входе реактора, причем размеры смесителя соответствуют условию 0,01 V0 S VCM 1,0 V0, где VCM - объем жидкости, который может вместить смеси- тель, VQ - объем смеси реактивов, подаваемых в реактор за 1 с, выход блока

размещения и подачи вспомогательных реактивов соединен с камерой смесителя.

Сущность заявляемых технических решений основана на обнаруженном эффекте,

который не мог быть достигнут на основании известных закономерностей протекания химических реакций.

Как показали исследования, эффективность проведения синтеза существенным

0 образом зависит от времени, прошедшего после смешивания реагентов,

Сокращение времени смешивания и подачи мономеров и конденсирующего агента, а также сокращения избытка кон5 денсирующего агента, приводят к более аффективному образованию межнуклео- тидной связи на твердофазном носителе, что позволяет использовать значительно меньшее количество дефицитных реакти0 BOB.

Известные технические решения основаны на проведении операции смешивания реагентов в смесительных камерах или трубопроводах с последующей подачей их в

5 реактор. В предложенном решении смешивание происходит непосредственно при подаче растворов в реактор, в основном, на пористом слое из нейтрального материала. Процесс смешивания происходит за время

0 продаоливания растворов через слой из пористого материала весьма эффективно, а подобранные режимы и размеры смесителя, а также размещение слоя из пористого материала в виде перегородки, разделяющей ка5 меру смесителя и рабочий объем реактора, позволило сократить время транспортировки смеси и обеспечить ее быструю подачу на нуклеотидный компонент для конденсации Как видно из табл. 1, при задержке под0 ачи смеси более 1,0 с эффективность синтеза падает. Время 0,01 с определяет минимальное время, за которое происходит продавливание реагентов через пористый слой.

5

Рассмотрим требования, предъявляемые к отдельным узлам устройства, способного реализовать предложенный способ. Чтобы осуществить быстрое смешиыание

0 мономера и дегидратирующего агента и подачу смеси в реактор, необходимы определенные соотношения между характеристиками отдельных узлов синтезатора, в частности, между объемом смесителя VCM и

5 объемом реагентов, необходимых для проведения процесса конденсации в реакторе Уконд.

Обозначим через V0- объем смеси активированного мономера, подаваемого в реактор непрерывно в течение 1 с. Тогда

время подачи т.цмп.реагентов объемом Уконд будет

1имп.

УКОНД.

Vn

При заданном времени смешивания

tcM.:

j

1имп. ° ten.

V,

конд.

Vc

ъ

так как через смеситель должен пройти весь объем Уконд.

Сравнивая (1) и (2),-находим:15

VCM ten Vc

для tcM. - (0,01-1,0) с; VCM (0,01-1,0)V0.

Это соотношение определяет конструк- ционные особенности смесителя предложенного устройства. Так, для режима подачи реагентов V0 20-50 мкл/с для режима смешивания tCM 0,1 с объем смесителя должен быть 2-5 мкл. Такой объем, смесителя удалось Получить, разъединив общие участки каналов подачи основных и вспомогательных реактивов.

Устройство для реализации предложенного способа, представленное на чертеже состоит из нескольких основных частей: блока размещения и подачи основных реактивов 1, блока размещения и подачи вспомогательных реактивов 2, смесителя 3, реактора 4, блока 5 нагрева и поддержания заданной температуры реактивов, блока управления 6. Блоки 1 и 2 включают в свой состав системы 7 продавливания растворов, сосуды для растворов 8, запорные клапаны 9, трубопроводы 10. В рабочем объеме 13 проточного реактора 4 размещен носитель с закрепленным на нем нуклеотидом 14, а на выходе реактора -фильтр 15 и клапан 16.

В качестве блока управления 6 могут быть использованы мини-ЭВМ или пер- сональные компьютеры и выходные усилители, связанные с соответствующими приводами. Клапаны могут быть различньГ- ми по конструкции. Обычно используют электромагнитные клапаны, предназначен- ные для работы с агрессивными жидкостями. Входы клапанов 9 соединены с выходами сосудов 8, входы которых подсоединены к системе продавливания растворов 7. Система 7 включает в себя баллон с инертным газом, например гелием, под давлением, редуктор, клапаны и трубопроводы, позволяющие создать необходимое избыточное давление в полостях сосудов 8. Сме

10

15

20 25

3035 40

45 50 55ситель 3 имеет полость 11, к которой подведены трубопроводы 10 блоков 1 и 2 Каждый из входов трубопроводов 10 подключен к соответствующим выходам клапанов 9 На выходе смесителя размещен слой из нейтрального пористого материала 12, выполненный в виде перегородки, перекрывающей входное отверстие реактора 4. Размеры полости и проницаемость пористой перегородки выбирают из условия, чтобы время контакта смешиваемых компонентов при заданном режиме поступления реагентов в смеситель не превышало 1 с до подачи смеси Ъ рабочий объем реактора. В то же время эффективного смешивания за время менее 0,01 с не происходит. Поэтому весь объем реагентов, попавших в смеситель, должен быть вытеснен в реактор за время Тем. (0,01-1,0) с.

Реактор выполнен в виде цилиндра или воронки, открытые концы которых являются входом и выходом реактора. Корпус реактора выполнен из химически стойкого материала металла, стекла и т п. Выходное отверстие реактора перекрыто фильтром, удерживающим твердофазный носитель 14 и пропускающим растворы реагентов. Полость реактора 13 заполнена твердофазным носителем 14, в качестве которого могут быть использованы макропористый селика- гель, пористое стекло, и т.п.

Перед началом синтеза заполняют сосуды 8 соответствующими растворами рсаген- тов, задают рабочее давление в этих сосудах, вводят в память блока управления 6 программу, определяющую последовательность проведения операций.

Сигна, управления сначала подается на привод клапана 9 в блоке 2, который, открываясь, обеспечивает подзчу детритилирую- щего раствора, например, хлористого метилена стрифторуксусной кислотой из сосуда блока 2 черзз смеситель 3 в полость 13 реактора 4 для промывки твердофазного носителя 14 в течение 2-30 с. После промывки клапан, регулирующий подачу детритилиру- ющего раствора, закрывают и открывают клапан, обеспечивающий подачу другого растворителя из блока 2 - абсолютного, например, ацетонитрила или хлористого метилена, которым промывают твердофазный носитель от детритилирующего раствора, Одновременно происходит промызка смесителя. Затем этот клапан также закрывают и открывают одновременно два клапана 9 в блоке 1. В зависимости от заданной структуры полинуклеотида в процессе синтеза открывают соответствующую пару, например, клапан для подачи 5 -0-диметокситри- тил-6-бензоил-3-П-фосфоната-2-дезоксиэде

нозина и клапан для подачи раствора дегидратирующего реагента хлорангидрида. Растворы реагентов поступают в камеру смесителя, где происходит их предварительное смешивание, Из-за малого времени перемешивания растворы смешиваются неравномерно. Равномерная смесь, обеспечивающая эффективность использования реагентов, образуется на слое из пористого нейтрального материала Проходя через поры этого слоя,смесь реагентов поступает в полость реактора 13 до заполнения рабочего объема, в котором размещен носитель 14, после чего клапаны закрывают. Выходным клапаном 16 регулируют время нахождения растворов и слива их из рабочего объема реактора 13. Эти операции повторяют заданное число раз. Затем по сигналу с блока управления открывается клапан блока 2, обеспечивающий подачу кэпирующего раствора, например, сизопропилфосфитом, которым обрабатывают полость реактора с носителем. После закрытия этого клапана аналогичным образом смеситель 3 и рабочий объем реактора 13 промывают абсолютным растворителем.

Примеры конкретного исполнения.

Пример 1. Синтез 60-членного пол- инуклеотида следующего .состаля (GATCCAGTACCTCCCTTTCCACACGCAACA

CTCTCTTTCCCCCAGATCCCTTCTCGATCA).

Для синтеза применяли установку, изготовленную в соотве гствии с чертежом. Реактор был выполнен в виде воронки, В качестве твердофазного носителя использовали СРС-1350 (фирма Serva, ФРГ) с емкостью нуклеозида 10 мкмоль/г. Объем реактора 5 мкл. Пористая перегородка между камерой смесителя и реактором была выполнена из двух сеток, между которыми находились частицы фторопласта. Режим срабатывания электромагнитных клапанов задавали с помощью ЭВМ Электроника-60. Перед началом синтеза заполняли сосуды необходимыми реагентами. Блок термоста- тирования обеспечивал температуру реагентов на всех стадиях синтеза с точностью (1-2)°С.

Детритилирование проводили раствором 1%-ной трифторуксусной кислоты в дихлорметане. Промывку проводили ацето- нитрилом.

Ввод растворов мономера и конденсирующего агента и реакция конденсации, смешивали 0,01-0,03 М нуклеозид-3 -Н-фос- фонат и 0,01-0,03 М пивалоилхлорид в смеси ацетонитрилпиридин. Подачу проводили импульсами при одновременном открывании клапанов, управляющих подачей растворов мономеров и конденсирующего

агента. Таких чередующихся импульсов и пауз было 5. Время импульса 0,1 с, пауза между импульсами - 2 с. Общее время реакции конденсации 10,5 с. Время конденсации определялось суммой времен импульсов и пауз между ними. Затем промывали систему ацетонитрилом.

Таким образом, общее время цикла синтеза составило 16,5 с, а средний выход на

0 стадию присоединения одного мономерного звена (определяли по поглощению диме- токситритильного катиона при А 400 нм) 99%.

Необходимо отметить, что задание оди5 пакового температурного режима при быстром синтезе на всех его стадиях имеет важное значение. Это связано с тем, что при малых временах конденсации поступающие в реактор порции смеси не успевают про0 греться и охлаждают носитель, что ухудшает эффективность синтеза. Поэтому нами было применено термостатирование емкостей с реагентами и всех узлов, через которые эти реагенты проходят.

5 Все операции проводили при термоста- тировании используемых растворов и реактора (40°С).

В таком режиме были проведены последующие 59 циклов синтеза.

0 Окисление проводили в течение 5 мкл смеси, полученной при смешивании насыщенного раствора йода в ледяной уксусной кислоте и пиридине (в соотношении 1:1), затем промывали 200 мкл пиридина.

5 Снятие полинуклеотида с твердого носителя. После окисления реактор промывали 25%-ным водным раствором аммиака (1 мл) в течение 30 мин. Собранный раствор выдерживали 1 ч при 100°С и выделяли пол0 инуклеотид известными способами: высокоэффективной жидкостной хроматографией на колонке с обращенной фазой или электрофорезом в денатурирующем полиакрила- мидом геле.

5

Выход 60-членного полинуклеотида - 1.2 О.Е.260 (2 наномоля). При этом расход реагентов и растворителей сократился более чем в 10 раз, по сравнению с известным

0 решением.

В таблице приведены примеры для различных значений основных параметров синтеза олиго(поли)нуклеотидов на присоединение одного мономерного звена.

5 Условия проведения синтеза такие же, как в примере 1.

Как видно из таблицы, увеличение времени конденсации более 2,5 с и увеличение количества циклов более 20 не повышает эффективность, но удлиняет время синтеза

и тем самым снижает производительность способа и устройства.

В синтезаторе-прототипе время одного цикла существенно больше, чем в предложенном решении (240 и 15-30 с соответст- венно), что при синтезе многочленного полинуклеотида дает значительный выигрыш в производительности.

Экономия реагентов и растворителей при применении предложенного способа и устройства возникает из-за быстрого смешивания в компактно выполненной системе смешивания и подачи реагентов малыми порциями.

Формула изобретения

1. Способ синтеза олиго(поли)нуклеоти- дов на, твердофазном диспергированном носителе, включающий промывку носителя с закрепленным на нем нуклеозидом, смешивание 5 -0-защищенного З -Н-фосфоната нуклеотидного компонента с дегидратирующим агентом, конденсацию с. б -ОН-группой нуклеозидного компонента, закрепленного на носителе, последующее удаление 5 -0-за- щитной группы, повторение этих операций до получения олиго(поли)нуклеотида с нужным числом мономерных звеньев, окисление олиго(поли)нуклеотид-Н-фосфоната, отщепление олиго(поли)нуклеотида от носителя, отличающийся тем, что, с целью повышения производительности способа путем сокращения времени синтеза и экономии используемых реагентов, в качестве дегидратирующего агента используют хло- рангидриды кислот в соотношении 0,9-1,5

эквивалента на 1 эквивалент нуклеозид-3 -Н-фосфоната. их смешивание и подачу на носитель проводят за время tCM (0,01-1,0) с, а конденсацию - за время Тконд (0,5-2,5) с, причем эти операции повторяют 2-20 раз при температуре реагентов на всех стадиях синтеза Т (30-65)°С.

2. Устройство для синтеза олиго(по- ли)нуклеотидов, содержащее реактор проточного типа, в рабочем объеме которого размещен носитель, связанный с нуклео- зидным компонентом, блок размещения и подачи вспомогательных реактивов, блок управления, смеситель, вход которого соединен с выходом блока размещения и подачи основных реактивов, а выход смесителя соединен с входом реактора, запорный клапан, соединенный с выходом реактора, отличающееся тем, что, с целью повышения производительности путем сокращения времени синтеза и экономии используемых реагентов, оно дополнительно содержит блок нагрева и поддержания заданной температуры растворов реагентов на всех стадиях синтеза, смеситель состоит из камеры на входе и пористой перегородки из нейтрального материала, которая расположена непосредственно на входе реактора, причем размеры смесителя соответствуют условию VCM (0,01-1,0) V0, где VCM - максимальный объем жидкости, который вмещает смеситель, Vo - объем подачи смеси реактивов в реактор за 1 с, а выход блока размещения и подачи вспомогательных реактивов соединен с камерой смесителя.

Использование: в молекулярной биологии, генной инженерии и медицинр. Сущность изобретения: продукт: ол и г опол ину клеотид состава (GATCCAGTACCTCCCTTTCCACAC GCAACACTCTCTTT-CCCCCAGATCCCTTC TCGATCA), выход 1.20.Е.260 (2 наномоля). Реагент 1:5 -0-защищенным З -Н-фосфонзт нуклеотидного компонента. Реагент 2 хло- рангидриды кислот при соотношении 0,9- 1.5 зкв.: 1 экв. нуклеозид-З -Н-фосфоната. Условия реакции: смешивание проводят за 0,01-1,0 с, конденсацию за 0,5-2,5 с при 30- ббЧ причем операции повторяют 2-20 раз. 2 н п ф-лы, 1 ил , 1 табл. (Л С