СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ СУММЫ ТРИТЕРПЕНОВЫХ КИСЛОТ Российский патент 2007 года по МПК C07C51/47 A61K36/15 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам выделения биологически активной суммы тритерпеновых кислот из древесной зелени или коры пихты.

Известны способы получения биологически активной суммы тритерпеновых кислот путем экстракции органическим растворителем высушенной зелени, реэкстракции кислот щелочным водным раствором, последующего подкисления водного экстракта кислотой и выделения целевого продукта из подкисленного водного экстракта путем экстракции этилацетатом или трет-бутилметиловым эфиром [Способ получения биологически активной суммы тритерпеновых кислот / Ралдугин В.А., Шевцов С.А., Щукин Г.И., Ляндрес Г.В., Михеев К.А.; Пат. док. 2061487. - Новосиб. ин-т орган, химии СоАН, Сиб. НИИ лес. пром-сти, Дальневост. НИИ лесн. пром-сти - № 4952526/14, заявл. 28.06.91., опубл. 10.06.96, Бюл. №16; Способ получения биологически активной суммы тритерпеновых кислот. / Ралдугин В.А., Друганов А.Г., Климов В.П., Шубин А.Н., Чекуров В.М.; Пат. док. 2108803. - Новосиб. ин-т орган, химии СО РАН - № 97105437/13, заявл. 08.04.97, опубл. 20.04.98]. Данные способы недостаточно эффективны вследствие своей длительности и низкого выхода целевого продукта.

Наиболее близким техническим решением, выбранным за прототип, является способ получения смеси тритерпеновых кислот путем экстракции этилацетатом предварительно обработанного паром растительного сырья (коры или зелени пихты), последующей реэкстракции кислот щелочным раствором и выделения кислот после подкисления щелочного экстракта. Данный способ недостаточно эффективен вследствие длительности предварительной обработки (13-15 часов). Кроме того, на предварительной стадии растительное сырье подвергается высокотемпературному воздействию (109-112°С), в результате чего часть биологически активных соединений может разрушаться [Пат. РФ №2151139. - Открытое акционерное общество "ЭЛХА" - № 99116796/04, заявл. 02.08.99, опубл. 20.06.00].

Задачей изобретения является упрощение процесса, повышение выхода и качества целевого продукта. Решение поставленной задачи достигается благодаря

- повышению эффективности предварительной обработки, направленной на разрушение клеточных стенок, за счет чего облегчается доступ растворителя к клеточному содержимому;

- эффективному удалению балластных веществ (полифенолов и низкомолекулярных органических кислот) на стадии экстракции горячей водой;

- сокращению времени предварительной обработки и экстракции целевых компонентов;

- уменьшению количества используемых органических растворителей:

- повышению чистоты конечного продукта.

Поставленная задача достигается тем. что в заявляемом способе получения биологически активной суммы тритерпеновых кислот, включающем выделение целевого продукта экстракцией органическим растворителем, растительное сырье предварительно механически обрабатывают в присутствии абразивного материала, а именно кварцевого песка, экстрагируют горячей водой балластные вещества, отделяют твердый остаток, сумму тритерпеновых кислот выделяют прямой экстракцией органическим растворителем из полученного твердою остатка.

Предпочтительно используют для обработки смесь сухого растительного сырья и абразивного материала при соотношении компонентов 1:10 соответственно.

Предпочтительно механическую обработку проводят в шаровых мельницах планетарного, вибрационного, виброцентробежного типов, обеспечивающих ускорение воздействующих тел (шаров) от 60 до 400 м/с² и время пребывания в зоне обработки от 1 до 10 минут соответственно.

Предпочтительно в качестве исходного сырья используют зелень или кору пихты.

Предпочтительно в качестве абразивного материала используют кварцевый песок.

Полученную после механической обработки смесь подвергают двукратной экстракции горячей водой при температуре 50-70°С, длительность экстракции составляет 1,0-1,5 часа. Водный экстракт фильтруют или центрифугируют. Твердый остаток после сушки обезжиривают, экстрагируют органическим растворителем, после удаления из органического экстракта получают смесь тритерпеновых кислот.

В результате механохимической обработки происходит тонкое измельчение сырья до размеров частиц 4-35 мкм. Введение абразивного материала, кварцевого песка, значительно увеличивает эффективность измельчения растительного сырья и разрушения клеточных структур, в результате чего при последующей экстракции снимаются диффузионные затруднения, кроме того, частицы растительною сырья не набухают, что значительно облегчает проведение процедуры отделения твердого остатка растительного сырья от экстрактов. Дополнительным преимуществом присутствия в обрабатываемой смеси песка является включение мелких частиц песка в частицы растительного сырья, что приводит к увеличению насыпной плотности получаемого полупродукта. Это облегчает последующие отстаивание, фильтрование или центрифугирование экстрактов.

Благодаря применению предварительной механической обработки и последующей водной экстракции удается удалить из растительного сырья более 95% водорастворимых веществ, а именно низкомолекулярные компоненты кислой части, фенолы и полифенолы. Известно, что фенольные соединения оказывают существенное влияние на ауксиновый обмен, ряд из них являются сильными ингибиторами роста [Л.П.Сарапуу, В.И.Кефели, Фенольные соединения и рост растений // Фенольные соединения и их биологические функции. Материалы 1-го Всесоюзного симпозиума по фенольным соединениям, 129-138, М.: Наука, 1968]. Присутствие фенольных соединений в конечном продукте крайне нежелательно, поскольку может привести к существенному снижению его биологической активности.

Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что заявленное решение отличается тем, что кору или древесную зелень пихты предварительно механически обрабатывают в присутствии абразивного материала, затем проводят извлечение балластных веществ (низкомолекулярных кислот, полифенолов и др.) горячей водой, отделяют твердый остаток, сумму тритерпеновых кислот выделяют из полученного остатка прямой экстракцией органическим растворителем. Таким образом, за счет применения механической обработки достигается более полное извлечение из сырья целевых компонентов, использование водной экстракции позволяет при меньших расходах растворителей получить более качественный целевой продукт с большим выходом. Поскольку выход конечного продукта существенно увеличивается, в качестве сырьевой базы можно использовать даже лежалые кору или зелень - сырье с пониженным содержанием тритерпеновых кислот.

Заявленное решение осуществляется следующим образом.

Свежее или лежалое растительное сырье (древесную зелень или кору) механически обрабатывают в присутствии абразивного материала, полученную тонко измельченную массу (4-35 мкм) промывают горячей водой, твердый остаток отделяют фильтрованием или центрифугированием, сушат, сухой остаток (влажность 2-20%) обезжиривают гексаном или петролейным эфиром или бензином, затем экстрагируют сумму тритерпеновых кислот этилацетатом или трет-бутилметиловым эфиром, после удаления растворителя получают целевой продукт.

Пример 1.

Растительное сырье - древесную зелень - сушат до влажности не более 5%. Смесь высушенного растительного сырья (65 мас.%) механически обрабатывают с кварцевым песком (35 мас.%) в планетарной мельнице серии АПФ (ИХТТМ СО РАН). Из полученной тонко измельченной массы (800 г), размер частиц не более 35 мкм, дважды экстрагируют водорастворимые вещества водой (гидромодуль 6-10) при температуре 50-70°С. Твердый остаток отделяют путем фильтрования под вакуумом или центрифугированием. Водные вытяжки объединяют, дают отстояться, отделяют пихтовое масло. Полученный твердый остаток сушат до влажности 2,5-3,5%. Высушенный остаток (670 г) обезжиривают, для этого его экстрагируют в течение 1,5-2 часов гексаном (1,2-1,4 литра) или петролейным эфиром (1,0-1,2 литра) или бензином марки БР-1 или БР-2 (1,0-1,2 литра). После отделения путем фильтрования от органического экстракта твердого остатка, последний сушат. Полученную массу (640 г) экстрагируют этилацетатом (2,0-2,2 литра) в течение 1,5-2 часов. Органический растворитель отделяют от твердого остатка. После удаления из экстракта растворителя получают целевой продукт - светлый порошок зеленоватого цвета. Выход 4,8% в пересчете на высушенное растительное сырье.

Пример 2.

Осуществляют в условиях примера 1, вместо этилацетата используют трет-бутилметиловый эфир, а механическую обработку проводят в виброцентробежной мельнице ЦЭМ-7 (ИХТТМ СО РАН). Результаты приведены в таблице, выходы приведены в пересчете на высушенное растительное сырье.

Пример 3.

Из древесной зелени выделяют сумму тритерпеновых кислот в условиях примера 1, но без предварительной механической обработки. Выход 2,8%.

Пример 4.

Осуществляется в условиях примера 1. В качестве исходного сырья используют свежую кору пихты. Выход продукта - светло-коричневого порошка - 3,0%.

Пример 5.

Осуществляется в условиях примера 1. В качестве исходного сырья используют свежую кору пихты, а механическую обработку проводят в мельнице ЦЭМ-7 (ИХТТМ СО РАН). Предварительную стадию механической обработки не проводят. Выход продукта в пересчете на высушенную кору 1,5%.

Пример 6.

В качестве исходного сырья используют лежалые отходы пихты сибирской (зелень или кора) лесоперерабатывающих комбинатов. Соотношение компонентов в смеси для механической обработки - растительное сырье: песок составляет для коры 5,6-5,7, для зелени - 4,0. Механическую обработку проводят в виброцентробежной мельнице ЦЭМ-20 Полученную после механической обработки массу однократно промывают горячей водой при температуре 45-55°С (гидромодуль 5-6). Твердый остаток отделяют центрифугированием или фильтрованием, сушат до влажности 5%. Полученную после сушки массу (500 г) экстрагируют этилацетатом (1,5-1,7 литра). Результаты приведены в таблице.

Пример 7.

Выделение тритерпеновых кислот проводили по известному способу [RU 2151139] из древесной зелени пихты той же партии, что использовалась в п.1, в качестве экстрагента использовали этилацетат. Выход 2,3%.

Пример 8.

Выделение тритерпеновых кислот проводили по известному способу [RU 2061487] из коры пихты той же партии, что использовалась в п.4, в качестве экстрагента использовали этилацетат. Выход 1,0%.

Указанные соотношения концентраций компонентов механически обрабатываемой смеси определяются следующими эффектами. Введение кварцевого песка в концентрации менее 10% приводит к резкому увеличению размера частиц и времени механической обработки до технологически неприемлемых величин. Мелкие частицы растительного сырья, содержащего в большом количестве смолистые компоненты, в процессе механической обработки и экстракции легко агрегируют, образующие агрегаты набухают при экстракции, в результате чего возрастают диффузионные затруднения. Введение кварцевого песка позволяет избежать слипания частиц измельчаемого материала. Использование кварцевого песка в концентрации более 50% нецелесообразно вследствие того, что большие концентрации песка на эффективность измельчения не влияют, а непроизводственные затраты на измельчение смесей растут. Условия механической обработки определяются кинетикой измельчения. При ускорении воздействующих тел (шаров) менее 60 м/с² не обеспечивается внедрение частиц песка в частицы растительного сырья, это приводит к тому, что измельченное сырье сильно набухает в растворителе. После такой обработки смесь ведет себя аналогично механически необработанной смеси. При ускорении воздействующих тел (шаров) более 400 м/с² происходит разогрев обрабатываемой смеси, что может привести к разрушению биологически активных веществ. Применение обработки менее 1,5 минут не обеспечивает необходимого измельчения, увеличение времени обработки сверх 10 минут не приводит к увеличению выхода целевых продуктов.

Целевой продукт - биологически активная сумма тритерпеновых кислот, полученный во всех примерах, проанализирован методом ВЭЖХ и соответствует стандартной смеси «тритерпеновых кислот» (ТУ-9291-001-03533895-94 на препарат «СИЛК»). Продукт характеризуется максимумом поглощения в УФ-спектре 237-238 нм (lgε 3,8-3,9).

Полученный продукт может использоваться для стимулирования корнеобразования при проращивании рапса, пшеницы и др.

Проверяли эффективность препарата, полученного по предлагаемому способу (п.1), в сравнении с препаратом, получаемым по известному способу (прототипу). Сумма тритерпеновых кислот, выделенных по заявленному решению, оказалась более активной по сравнению с тритерпеновыми кислотами, выделенными по прототипу. Использовали метод проращивания семян в бумажных рулонах, погруженных в растворы исследуемых препаратов. Обнаружено стимулирующее действие препарата, полученного по заявленному решению. Обработка семян препаратом увеличивает всхожесть и приводит к формированию крепких, хорошо облиствеленных и хорошо укорененных проростков. Результаты испытаний представлены в таблицах 1 и 2.

Преимуществами заявленного способа по сравнению с известными аналогами являются:

- сокращение времени получения целевого продукта;

- получение продукта более высокого качества благодаря тому, что на стадии экстракции горячей водой водорастворимых компонентов происходит удаление из растительного сырья полифенольных соединений и низкомолекулярных соединений, входящих в состав кислой части;

- предварительная механическая обработка с абразивным материалом позволяет существенно ускорить процесс экстракции, поскольку на стадии механической обработки происходит разрушение клеточных стенок;

- в результате предварительной механической обработки получается промежуточный продукт - тонко измельченный порошок - частицы, которого не набухают в растворителе, что позволяет легко отделять твердый остаток после экстракции;

- применение заявленного решения позволяет получить более активный продукт;

- возможность применения в качестве сырьевой базы отходов лесоперерабатывающего комплекса - лежалой коры и зелени;

- выделение целевого продукта происходит на конечной стадии процесса путем непосредственной экстракции из растительного сырья, из которого предварительно удалили балластные вещества, благодаря этому удается избежать потерь целевых компонентов на промежуточных стадиях очистки и снизить потребление органических растворителей.

Таблица 1Выходы суммы тритерпеновых кислот для различных экстрагентов и сырья.ПримерВид сырьяЭкстрагентВыход, %1Древесная зеленьЭтилацетат4,82Древесная зеленьТрет-бутилметиловый эфир5,53 (без МО)Древесная зеленьЭтилацетат2,84Свежая кораЭтилацетат3,05 (без МО)Свежая кораЭтилацетат1,56Лежалая зеленьЭтилацетат2,56Лежалая кораЭтилацетат3,27Древесная зеленьЭтилацетат2,38Свежая кораЭтилацетат1,0Таблица 2Влияние препаратов, полученных по заявленному решению и прототипу, на развитие проростков пшеницы Новосибирская 89.Препарат, концентрация тритерпеновых кислот, мг/лВысота побегаДлина корнямм%мм%Вода(контроль), 032,710060,3100По прототипу п.7, 1,040,112363,5105По п.1, 1,047,913172,6120

Изобретение относится к улучшенному способу получения из коры или древесной зелени пихты сибирской биологически активной суммы тритерпеновых кислот. Изобретение направлено на увеличение выхода суммы тритерпеновых кислот, повышение биологической активности целевого продукта и упрощение процесса. Указанный технический результат получают благодаря тому, что после механической активации растительного сырья с абразивным материалом проводится извлечение водорастворимых веществ водой, из полученного после сушки порошка путем экстракции органическим растворителем выделяют целевой компонент. При этом при механохимической обработке предпочтительно используют смесь сухого растительного сырья и кварцевого песка при соотношении 1:10 соответственно. Механохимическую обработку проводят предпочтительно в шаровых мельницах планетарного, вибрационного, виброцентробежного типов, обеспечивающих ускорение воздействующих тел, например шаров, от 60 до 400 м/с² и время пребывания в зоне обработки от 1 до 10 минут соответственно. В качестве исходного сырья используют зелень пихты или кору пихты. 2 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ получения биологически активной суммы тритерпеновых кислот из коры или зелени пихты, включающий выделение целевого продукта экстракцией органическим растворителем, отличающийся тем, что растительное сырье предварительно механически обрабатывают в присутствии кварцевого песка в качестве абразивного материала, экстрагируют горячей водой балластные вещества, отделяют твердый остаток, сумму тритерпеновых кислот выделяют из полученного твердого остатка прямой экстракцией органическим растворителем.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при механической обработке используют смесь коры или древесной зелени пихты с кварцевым песком при соотношении 1:10 соответственно.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что механическую обработку проводят в шаровых мельницах планетарного, вибрационного, виброцентробежного типов, обеспечивающих ускорение воздействующих тел, от 60 до 400 м/с² и время пребывания в зоне обработки от 1 до 10 мин соответственно.