СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ИНСУЛИНА ДЛЯ ПЕРОРАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2008 года по МПК A61K38/28 A61K47/48 A61K41/00 

Изобретение относится к фармакологии и медицине, в частности к эндокринологии, и может быть использовано для получения препарата инсулина для перорального применения.

Инсулин является полипептидным гормоном с молекулярной массой около 6000. Он оказывает влияние на все виды обмена веществ в организме: повышает проникновение глюкозы в ткани организма и ее использование ими, снижает содержание гликогена в печени и повышает его количество в мышцах, повышает интенсивность синтеза белка и т.д.

Основным способом введения инсулина в организм человека являются подкожные или внутримышечные инъекции препарата. Попытки введения инсулина наиболее физиологическим и удобным для больных пероральным путем (через рот) оказались безуспешными, поскольку инсулин легко гидролизуется пищеварительными ферментами с потерей активности.

Преимущества перорального инсулина по сравнению с инъекционными коммерческими формами очевидны, поскольку длительные ежедневные инъекции могут вызывать различные серьезные осложнения: сопровождаются болевыми синдромами; приводят к развитию липодистрофии, представляющей не только косметический дефект, но и вызывающей потребность в увеличении доз гормона; травмируют психику, особенно у детей; вызывают стрессовые состояния, приводящие к еще более выраженной гипергликемии, что, в свою очередь, увеличивает потребность в гормоне и т.д.

Известен препарат инсулина перорального назначения, представляющий собой водно-масляную микроэмульсию, состоящую из инсулина, липидов и протеазного ингибитора. Микроэмульсия покрывается затем карбоксиметилцеллюлозой (Y.W.Cho, M.Flynm, Lancet, 1989, 30, p.1518).

Существенным недостатком этого препарата, наряду с трудоемкой и дорогостоящей технологией изготовления, является использование в качестве носителя карбоксиметилцеллюлозы, которая подвержена воздействию микробов, особенно в условиях промышленного производства. Кроме того, целлюлоза способна сорбировать значительные количества белка, который необходимо отмывать буфером с высокой ионной силой. Проведение такой процедуры в больших масштабах является дорогостоящей и может приводить к значительной инактивации инсулина.

Известен способ получения препарата инсулина для перорального применения, путем инкубации инсулина с эритроцитами, взятых в соотношении 1-4:100 в присутствии многофункционального связующего агента, в конечной концентрации 0,15-0,25%. При этом обычно в качестве носителя используют эритроциты, выделенные из крови крупного рогатого скота, свиней или крови человека, а в качестве связующего агента используют преимущественно бромистый циан, хлористый цианур или глутаровый диальдегид (Патент РФ №2058788, кл. А61К 38/28, on. 27.04.96). Перед использованием препарат эмульгируют в воде.

Недостатком известного способа являются высокая токсичность связующих агентов и связанная с этим необходимость в дорогостоящей очистке конечного продукта.

Известен способ получения препарата инсулина в виде геля для перорального применения путем иммобилизации инсулина в объеме сшитого полимера, модифицированного ингибитором протеолитических ферментов (R.Z.Creenley, et. all Polymer Matrices for orol delivery, Polymer Preprits 1990, V.31, N2, p.182-183). В качестве сшитого полимера используют акриловую или метакриловую кислоты, сшитые триэтиленгликольди(мет)акрилатом, а в качестве ингибитора протеолитических ферментов используют апротенин - панкреатический ингибитор трипсина.

Недостатком этого способа является невысокая устойчивость полученного препарата к действию пищеварительных ферментов, следствием чего является низкая активность проникающего в кровь инсулина.

Наиболее близким к заявляемому способу (прототипом), является способ получения препарата инсулина в виде геля путем иммобилизации инсулина в объеме сшитого полимера, модифицированного ингибитором протеолитических ферментов, в качестве которого используют овомукоид из яичного белка в концентрации 0,2-25 мг/г (набухшего в воде гидрогеля). Иммобилизацию проводят путем погружения сшитого модифицированного полимера в водный раствор инсулина с концентрацией 0,01-5 мг/мл на 1-2 часа до полного набухания полимера. Модифицированный полимер используют в количестве 0,01-1,0 г на 1 мл раствора инсулина (Патент РФ №2066551, кл. А61К 38/28, оп. 20.09.96).

Недостатками известного способа являются технологическая сложность выделения овомукоида и получения сшитого полимера, им модифицированного, дороговизна и низкая терапевтическая эффективность получаемого препарата.

Технической задачей предлагаемого изобретения является упрощение и удешевление способа получения препарата инсулина для перорального применения, а также повышение его терапевтической эффективности.

Техническая задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Готовят 1-50% водный раствор полиэтиленоксида с молекулярной массой от 0,4 до 40 кДа. Затем раствор облучают высокоэнергетическим ионизирующим излучением, преимущественно гамма-излучением или потоком ускоренных электронов в дозах, обеспечивающих протекание свободно-радикальных реакций, преимущественно 1,0-5,0 Мрад. Далее в раствор радиационно-активированного полиэтиленоксида вводят инсулин до конечной концентрации (по белку) от 1-10 мг/мл (или по активности инсулина 10-100 МЕ/мл соответственно), в соотношении полиэтиленоксид:инсулин, равном (1-500):1, смесь перемешивают в течение 10-30 минут до получения однородного прозрачного или слегка опалесцирующего раствора.

Определяющим отличием заявляемого способа, по сравнению с прототипом, является то, что инсулин модифицируют полиэтиленоксидом, активированным ионизирующим излучением, что позволяет упростить способ и повысить терапевтическую эффективность препарата. При облучении в ходе радиационно-химического окисления в полимере образуются высокоактивные карбонильные группы. Активированный таким способом полимер образует с инсулином водорастворимый комплекс, который эффективно снижает уровень глюкозы при пероральном введении. Вследствие высокой растворимости в водных растворах, комплекс инсулина с полиэтиленоксидом полностью всасывается в кровь без диффузионных ограничений.

Использование овомукоида в качестве ингибитора протеаз в способе-прототипе позволяет защитить инсулин от протеолитических ферментов, а полиакриламидный гель выполняет функцию депонирования модифицированного инсулина. При частичном проникновении в кровь через стенку кишечника инсулин целенаправленно не депонируется в печени, так как не обладает сродством к органам ретикулоэндотелиальной системы и в связи с этим его действие будет аналогичным действию инсулина при парентеральном введении. Напротив, инсулин, модифицированный радиационно-активированым полиэтиленоксидом, проявляет свойства базального инсулина, то есть его фармакологический эффект максимально приближен к физиологическому механизму. Этому способствует полимер - полиэтиленоксид, обладающий способностью селективно захватываться клетками ретикулоэндотелиальной системы, прежде всего купферовскими клетками в печени.

Полученный технический результат не был очевиден из известных научно-технических данных о свойствах полиэтиленоксида и инсулина, так как в результате модификации инсулина радиационно-активированным полимером могла бы произойти полная потеря специфической гипогликемической активности инсулина за счет изменения его конформации и взаимодействия с инсулиновым рецептором клеток. Однако заявляемый способ позволяет не только сохранить специфическую гипогликемическую активность препарата инсулина, но и обеспечивает максимально физиологический механизм его действия за счет того, что активированный полимерный носитель образует с инсулином химически лабильные связи и используется только в качестве транспортирующего носителя инсулина в клетки печени, где и происходит высвобождение нативного инсулина.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного получения препарата инсулина.

Пример 1

10% водный раствор полиэтиленоксида с молекулярной массой 1,5 кДа облучают потоком ускоренных электронов в дозе 5,0 Мрад. В облученный раствор вносят инсулин до конечной концентрации 10 мг в 1 мл (соотношение полиэтиленоксид: инсулин равно 10:1). Смесь перемешивают 10 минут и получают препарат инсулина в виде слегка опалесцирующего раствора. Выход готового продукта составляет 98%.

Пример 2

50,0% водный раствор полиэтиленоксида с молекулярной массой 0,4 кДа облучают тормозным гамма-излучением в дозе 1,0 Мрад. В облученный раствор вносят инсулин до конечной концентрации 1 мг в 1 мл (соотношение полиэтиленоксид: инсулин равно 500:1). Смесь перемешивают 30 минут и получают препарат инсулина в виде прозрачного раствора. Выход готового продукта составляет 97%.

Пример 3

5% водный раствор полиэтиленоксида с молекулярной массой 15 кДа облучают потоком ускоренных электронов в дозе 2,5 Мрад. В облученный раствор вносят инсулин до конечной концентрации 10 мг в 1 мл (соотношение полиэтиленоксид:инсулин равно 5:1). Смесь перемешивают 15 минут и получают препарат инсулина в виде слегка опалесцирующего раствора. Выход готового продукта составляет 99%.

В таблице 1 представлены результаты исследования гипогликемического действия на интактных крысах линии Wistar комплекса инсулина с радиационно-активированным полиэтиленоксидом. В опытной группе экспериментальным животным в/ж однократно введено по 1 мл модифицированного полиэтиленоксидом инсулина (состав: 30 МЕ/мл свиного инсулина, 12,5 мас.% радиационно-активированного полиэтиленоксида 1500, соотношение полиэтиленоксид:инсулин равно 125:1). В контрольной группе животным однократно введено по 1 мл свиного инсулина с активностью 30 МЕ/мл.

Как видно из результатов, представленных в таблице 1, модифицированный полиэтиленоксидом инсулин начинает проявлять основную гипогликемическую активность через 3 часа после в/ж введения и сохраняет ее до 10 часов. Полученные данные свидетельствуют о приближении действия модифицированного инсулина к базальной секреции инсулина поджелудочной железой.

В таблице 2 представлены данные по исследованию гипогликемической активности модифицированного полиэтиленоксидом человеческого генно-инженерного инсулина на модели аллоксанового диабета у крыс. В опытной группе экспериментальным животным в/ж однократно введено по 1 мл модифицированного полиэтиленоксидом инсулина (состав: 50 МЕ/мл человеческого инсулина, 12,5 мас.% радиационно-активированного полиэтиленоксида 1500, соотношение полиэтиленоксид: инсулин равно 70:1). В контрольной группе животным введено по 1 мл человеческого инсулина с активностью 50 МЕ/мл.

Как видно из представленных результатов, модифицированный инсулин обладает выраженной гипогликемической активностью при в/ж введении крысам с аллоксановой моделью диабета.

В таблице 3 представлены сравнительные данные по влиянию модифицированного полиэтиленоксидом инсулина (соотношение полиэтиленоксид:инсулин равно 70:1) на абсолютные значения уровня инсулина в плазме крови у крыс при однократном в/ж введении. В опытной группе интактным крысам линии Wistar, массой 200 - 240 г в/ж введен модифицированный полиэтиленоксидом человеческий инсулин из расчета 250 МЕ/кг. В контрольной группе животным было введено в/ж эквивалентное количество немодифицированного инсулина. Содержание инсулина в плазме крови у крыс (в μЕД/мл) определяли иммуноферментным методом.

Из данных, приведенных в таблице, видно, что инсулин, модифицированный полиэтиленоксидом при в/ж введении либо приводит к повышению уровня инсулина в плазме крови, либо препятствует его снижению, то есть модифицированный инсулин максимально приближается к базальному инсулину, секретируемому поджелудочной железой в рамках физиологической нормы.

Заявляемый способ получения препарата инсулина для перорального применения, в отличие от способа прототипа, отличается простотой и экономичностью, так как его получение состоит всего из двух стадий, в которых используется дешевый полимерный носитель - полиэтиленоксид, технологически простой способ его активации - воздействие ионизирующего излучения на раствор полимера, а также простой способ модификации инсулина активированным полимером посредством введения в раствор активированного полимера инсулина до требуемой концентрации (активности). Препарат инсулина, получаемый заявляемым способом, обладает высокой терапевтической активностью, определяемой как по снижению концентрации глюкозы в крови, так и по прямому определению уровня инсулина в крови.

Таблица 1№ животного (Опыт)Время измерения уровня глюкозы в крови, мин060120180240300360420480540600Концентрация глюкозы в крови, ммоль/л17,95,15,65,35,15,14,63,65,45,75,925,95,35,04,84,34,74,94,44,96,15,935,25,26,35,14,74,64,34,35,26,14,947,17,16,25,74,94,64,74,95,94,84,656,16,06,76,06,36,24,75,66,35,65,1 №Время измерения уровня глюкозы в крови, минЖивотного (Контроль)060120180240300360420480540600Концентрация глюкозы в крови, ммоль/л16,55,37,35,65,65,45,25,06,66,15,626,86,27,46,46,15,95,95,35,65,45,135,35,85,55,75,15,36,25,44,85,55,447,56,77,76,85,55,46,37,66,46,05,255,96,96,16,26,76,15,55,26,15,85,8Среднее значение (Опыт)6,445,745,965,385,065,044,644,565,545,665,28Среднее значение (Контроль)6,406,186,806,145,805,625,825,705,905,765,42

Таблица 2Серия опытовВремя измерения уровня глюкозы в крови, часИсходное значение24681024Изменение концентрации глюкозы в крови, ммоль/лКонтроль (n=5)23,4±2,8-1,1±2,1-1,2±1,7-5,1±2,3-0,4±4,8+1,3±3,8-0.8±1,8Опыт (n=5)26,2±3,5-5,8±1,0-9,1±1,0-8,9±1,5-4,9±3,2-0,5±2,3-4,1±2,2

Таблица 3Серия опытовИсходные значенияВремя измерения содержания инсулина в плазме крови у крыс, час456Содержание инсулина в плазме крови у крыс (в μЕД/мл)Интактные животные26±716±914±716±8Контроль27±1010±325±627±10Опыт23±623±635±1020±6

Изобретение относится к фармакологии и медицине, в частности к эндокринологии, и описывает способ получения препарата инсулина, который заключается в том, что в 1-50% водный раствор полиэтиленоксида с мол. массой 0,4-40 кДа, предварительно облученный ионизирующим излучением в дозе 1,0-5,0 Мрад, вводят инсулин до конечной концентрации 1-10 мг/мл в соотношении полиэтиленоксид/инсулин, равном (1-500)/1, и смесь перемешивают до получения однородного прозрачного или слегка опалесцирующего раствора, что позволяет упростить процесс получения препарата инсулина и повысить его терапевтическую активность. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ получения препарата инсулина для перорального применения, включающий смешивание последнего с водорастворимым полимером, отличающийся тем, что инсулин смешивают с предварительно активированным путем облучения ионизирующим излучением полиэтиленоксидом с мол. массой 0,4-40 кДа и концентрацией 1,0-50,0%, в соотношении инсулин-полиэтиленоксид, равном 1:(1-500) до конечной концентрации инсулина в смеси 1-10 мг/мл.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что полиэтиленоксид активируют путем облучения потоком ускоренных электронов или гамма-излучением в дозах 1,0-5,0 Мрад.