СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЛИГОМЕРОВ ХИТОЗАНА Российский патент 2008 года по МПК C12P19/04 C08B37/08 A61K31/722 

Изобретение относится к области пищевой промышленности и медицины, а именно к технологии получения олигомеров хитозана, которые могут быть использованы для производства продуктов питания и биологически активных добавок к пище.

Именно хитозан и олигомеры (олигосахариды) хитозана, обладающие мощным транспортным эффектом, способностью доставлять в организм человека самые различные полезные и жизненно необходимые вещества - витамины, аминокислоты, макро- и микроэлементы, представляют наибольший интерес для исследований их биологической активности и в настоящее время используются как основа для получения новых продуктов питания, биологически активных добавок и эффективных медицинских препаратов.

Уникальные свойства продуктов питания, БАДов и медицинских препаратов, содержащих олигомеры хитозана, ставят проблему разработки высокотехнологического способа их промышленного получения.

Известен способ получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана путем ферментативного расщепления хитозана с использованием иммобилизованного на инертном носителе хитиназного комплекса (патент РФ № 2073016). Этот способ дает возможность получить низкомолекулярный водорастворимый хитозан с достаточно высоким выходом. Процесс проводят в две стадии - первую при рН 4,5-5,0 в течение 16 часов, а вторую при рН 6,0-6,5 в течение 12 часов.

Недостатками способа являются длительность процесса и его низкая производительность.

Наиболее близким по своей технической сущности является способ получения олигосахаридов хитозана (n от 2 до 25) ферментативным гидролизом хитозана в водном растворе, содержащем органические кислоты, с последующей фильтрацией и распылительной сушкой (патент РФ № 2250106). В первом варианте способа проводят ферментативный гидролиз 5%-ного раствора хитозана в присутствии хитозаназы и органических кислот при 45°С в течение 30 минут в атмосфере азота. Затем доводят концентрацию хитозана до 10%, добавляют фермент и продолжают гидролиз в течение 24 часов. Полученный гидролизат фильтруют через полипропиленовый фильтр с диаметром отверстий 5 мкм, а затем сушат в распылительной сушилке PC-1,8 со скоростью подачи раствора 50 л/час при температуре воздуха на входе 160-170°С и на выходе 60-70°С. Согласно второму варианту способа проводят ферментативный гидролиз 5% раствора хитозана в течение 30-50 минут, доводят раствор до концентрации хитозана 10%, гидролизуют 30-50 минут, после чего добавляют хитозан до концентрации 15% и проводят ферментацию до общего времени 20-24 часа. По третьему варианту способа проводится ферментативный гидролиз 10-15%-ного раствора хитозана в течение 24 часов. Указанный способ по прототипу обладает рядом существенных недостатков:

- не обеспечивает получение чистых олигосахаридов хитозана (n=2-20), не содержащих комплексных солей олигохитозония, так как получаемый продукт по прототипу представляет собой смесь олигомеров хитозана и низкомолекулярного хитозана (n более 20) в форме их комплексных солей с органическими кислотами;

- олигосахариды хитозана, полученные указанным способом, представляют собой фракцию с числом "n" повторяющихся звеньев-остатков D-глюкозамина, равным от 2 до 25, что свидетельствует о невысокой биологической активности продукта. Известно, что наибольшей биологической активностью обладают олигомеры хитозана с n от 2 до 12;

- низкая производительность процесса, связанная с тем, что при распылительной сушке растворов, содержащих 10-15% олигосахаридов хитозана, образуются порошки со значительной долей (величина которой обратно пропорциональна вязкости и концентрации раствора) мелких частиц размером до 5 мкм, что приводит к потерям сухого конечного продукта от 25% (при работе с 15%-ным раствором хитозана) до 35% (с 10%-ным раствором хитозана);

- высокие энергозатраты, обусловленные сушкой растворов олигосахаридов хитозана, содержащих 85-90% влаги, повышают себестоимость целевого продукта и стоимость процесса его получения;

- высокое содержание мелких частиц в конечном продукте снижает его качество, так как значительно затрудняет его дальнейшую переработку, в частности прессование, капсулирование, таблетирование, приготовление смесей с другими порошкообразными компонентами; при растворении в воде таких пылевидных порошков наблюдается комкование, связанное с агрегацией частиц с высокоразвитой поверхностью. Получаемый данным способом конечный продукт (торговое наименование «Олигохит», свидетельство №235247) термически нестабилен и обладает недостаточными органолептическими показателями из-за наличия в нем ацетата олигохитозония (получаемый по прототипу продукт представляет собой фактически не олигомеры хитозана, а комплексную соль олигомеров хитозана и органической кислоты, используемой для растворения исходного хитозана).

Необходимо также отметить, что пылевидные частицы, содержащиеся в конечном продукте, при сушке не улавливаются рукавным фильтром и скруббером и попадают в атмосферу, создавая экологические проблемы.

Задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, заключается в создании нового, высокоэффективного и экологически чистого процесса получения олигомеров хитозана, не содержащих комплексных солей олигохитозония с высокой биологической активностью за счет исключения потерь конечного продукта и высоким его качеством при низкой себестоимости технологического процесса в целом за счет снижения производственных затрат.

Поставленная задача достигается способом получения олигомеров хитозана, включающим ферментативный гидролиз хитозана в водном растворе при рН 3,0-4,4 с последующей фильтрацией и сушкой, причем перед фильтрацией гидролизат обрабатывают анионообменной смолой и концентрируют до содержания влаги 62-80%.

В предпочтительном варианте ферментативный гидролиз проводят в присутствии смеси хитозаназы и папаина в соотношении 1:(1-1,2) по массе, что позволяет получать продукт с повышенной термостабильностью и с более узким молекулярно-массовым распределением олигомеров (n от 2 до 20; прототип n от 2 до 25).

Необходимо отметить, что при проведении гидролиза хитозана могут быть использованы хитиназные комплексы на основе таких культур, как Streptomyces Kurssanovii, Streptomyces griseus и др.

Введение стадии обработки раствора гидролизата анионообменной смолой для удаления органической кислоты, образующей комплексную соль с олигомерами хитозана, и концентрирования раствора олигомеров хитозана перед распылительной сушкой позволило:

- повысить производительность процесса за счет исключения потерь целевого продукта при снижении его себестоимости и энергозатрат (на 50-70%) на стадии распылительной сушки;

- повысить чистоту биологически активного целевого продукта и получить олигомеры хитозана в виде порошков светло-желтого цвета оптимального гранулометрического состава, достаточно крупных (диаметр 60-100 мкм) и однородных по размерам, что обеспечивает высокое качество продукта при его дальнейшем использовании в пищевой, косметической и фармацевтической промышленности.

В результате проведенных исследований было определено оптимальное содержание влаги в гидролизате после концентрирования, которое составляет 62-80%.

Отклонение от выбранного интервала в сторону увеличения содержания влаги в гидролизате приводит к существенным потерям целевого продукта и повышению энергозатрат при распылительной сушке. Отклонение в сторону уменьшения содержания влаги приводит к значительному повышению вязкости раствора и затрудняет проведение распылительной сушки.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Крабовый хитозан [поли-β-(1→4)-2-амино-2-деокси-D-глюкоза] со степенью деацетилирования 90-95% растворяют в водном растворе при рН 3,0-4,4, при этом кислая среда может быть создана с использованием органических кислот, например уксусной, аскорбиновой, молочной, янтарной и т.д. Ферментативный гидролиз предпочтительно проводят в присутствии смеси хитозаназы и папаина (ферменты производства компании Lyven, Франция) в соотношении 1:1-1,2 по массе, но могут быть использованы хитозаназа или хитиназные комплексы на основе таких культур, как Streptomyces Kurssanovii, Streptomyces griseus и др. в течение 20-22 часов при температуре 44-48°С. Затем гидролизат обрабатывают анионообменной смолой с целью удаления кислотных остатков, связанных с аминогруппами, фильтруют через полипропиленовый фильтр с диаметром отверстий 10 микрон, концентрируют до содержания влаги 62-80% и сушат.

Обработку раствора смолой более технологично проводить, пропуская раствор гидролизата через колонку с ионообменной смолой (скорость потока нужно выбирать такую, чтобы на выходе из колонки был раствор с рН около 7). Затем смолу регенерируют 4%-ным раствором NaOH.

В качестве анионообменных смол могут быть использованы амберлиты (производства США, Япония), дуолиты (США, Франция), дауэксы (США), зеролиты (Великобритания), леватиты, вофатиты (Германия), смолы АВ-16, АВ-17, АН-1, АН-2Ф, АН-18, АН-31 (Россия).

Анионообменную смолу добавляют в таком количестве, чтобы рН среды после обработки составлял (7,0±0,05), продолжительность анионообменной обработки 30-35 мин. Регенерацию смолы проводят 4%-ным раствором щелочи в течение 20-40 минут при температуре (40±5)°С. Кратность использования смолы 2-5.

Для получения более узких по молекулярно-массовому распределению фракций олигомеров хитозана возможно проведение фракционирования раствора смеси олигомеров хитозана методом ультрафильтрации.

В процессе получения олигомеров хитозана степень гидролиза контролируется путем измерений динамической вязкости раствора олигомеров хитозана на вискозиметре Брукфильда. Расчет динамической вязкости проводят по формуле, указанной в инструкции к прибору.

В данном изобретении целесообразно гидролиз проводить при содержании в реакционной смеси хитозаназы в количестве 1,8 единиц на 1 грамм хитозана и папаина в количестве 0,5-0,6% от массы хитозана, что обеспечивает выход олигомеров хитозана с заданным молекулярно-массовым распределением:

n=2-6- 5-16%n=7-12- 69-76%n=13-20- 11-26%n более 20- 0%

Молекулярно-массовое распределение определяют методом гельпроникающей хроматографии (ГПХ) на жидкостном хроматографе Bio-Rad с рефрактометрическим детектором и системой компьютерной регистрации; колонка Tosohaas TSK 30 SW_XL, в качестве растворителя и элюэнта используют фосфатный буфер (0,05 М, рН 3,7) с добавлением 0,5 М NaNO₃.

Содержание основного вещества (олигомеров хитозана) в конечном продукте не менее 95%. Выход олигомеров хитозана в расчете на исходный хитозан 96%. Получаемые порошки олигомеров хитозана быстро растворимы в воде и физиологическом растворе, хорошо смешиваются с различными ингредиентами, более чистые и термостабильные, имеют улучшенные органолептические свойства (в частности, за счет отсутствия примеси ацетата олигохитозония), гранулометрические параметры, оптимальные для использования в пищевой и фармацевтической промышленности (размер частиц порошка 60-100 мкм) по сравнению с продуктом по прототипу.

На основе олигомеров хитозана с вышеуказанным молекулярно-массовым распределением компанией «Био Технологии» создана и промышленно производится серия инновационных продуктов питания Vegetabs™, обладающих высокой биологической активностью, что подтверждено результатами клинических испытаний.

Нижеследующие примеры ни в коей мере не ограничивают объем патентных притязаний и приведены лишь с целью иллюстрировать заявляемый способ получения олигомеров хитозана.

Пример 1. Растворяют 15 кг крабового хитозана со степенью деацетилирования 95% в 0,5%-ном водном растворе уксусной кислоты. Проводят ферментативный гидролиз в присутствии хитозаназы активностью 250 U/g, взятой в количестве 1,8 ед. (7,2 мг) на 1 г хитозана и папаина активностью 36000 NFPU/mg (7,2 мг на 1 г хитозана) при температуре 44°С в течение 20 часов в инертной атмосфере, затем проводят обработку раствора анионообменной смолой АВ-17 в течение 30 минут до рН 7,0.

Гидролизат фильтруют и концентрируют до содержания влаги 77% с использованием вакуумно-выпарной установки УВВ-50 (производительность по испаренной влаге 50 кг/час) при температуре 39°С и подвергают сушке на распылительной сушильной установке PC-20 (скорость подачи раствора 30 л/час, температура входящего теплоносителя 145°С, температура на выходе из сушильной камеры 60°С).

В процессе гидролиза контролируют динамическую вязкость реакционной смеси на вискозиметре Брукфильда.

Получены олигомеры хитозана со средневязкостной молекулярной массой 1600 Да. По данным гельпроникающей хроматографии на колонке с акрилексом Р-2 (размер колонки 1100×35 мм) молекулярная масса продукта составляет 1800 Да. Выход олигомеров в расчете на исходный хитозан равен 96,0%. Молекулярно-массовое распределение методом гельпроникающей хроматографии (ГПХ) получено в виде:

n=2-6- 16%n=7-12- 73%n=13-20- 11%n более 20- 0%

Пример 2. Аналогично примеру 1, но гидролиз хитозана ведут с добавлением хитозаназы (1,8 единиц активности на 1 г хитозана) (7,2 мг на 1 г хитозана) при температуре 46°С в течение 22 часов, затем проводят обработку анионообменной смолой АМБЕРЛАЙТ IRA67. Гидролизат фильтруют, концентрируют до содержания влаги 80% и сушат.

Получены олигомеры хитозана со средневязкостной молекулярной массой 1900 Да.

По данным гельпроникающей хроматографии молекулярная масса продукта составляет 2100 Да. Молекулярно-массовое распределение методом гельпроникающей хроматографии (ГПХ) получено в виде:

n=2-6- 5%n=7-12- 69%n=13-20- 26%n более 20- 0%

Выход олигомеров хитозана в расчете на исходный хитозан равен 96,2%.

Пример 3. Растворяют 6 кг хитозана в 1,2 м³ 2%-ного водного раствора аскорбиновой кислоты. Проводят гидролиз в присутствии хитозаназы активностью 250 U/g (1,8 ед. или 7,2 мг на 1 г хитозана) и папаина активностью 36000 NFPU/mg (8,64 мг на 1 г хитозана) при температуре 48°С в течение 22 часов. Гидролизат обрабатывают анионообменной смолой АВ-17, фильтруют, концентрируют до содержания влаги 62% и подвергают распылительной сушке. Получены олигомеры хитозана со средневязкостной молекулярной массой 1800 Да. Данные гельпроникающей хроматографии дают значение молекулярной массы 1950 Да. Молекулярно-массовое распределение методом гельпроникающей хроматографии (ГПХ) получено в виде:

n=2-6- 9%n=7-12- 76%n=13-20- 15%n более 20- 0%

Выход олигомеров в расчете на исходный хитозан равен 95,8%.

Пример 4. Аналогично примеру 1, но гидролиз хитозана ведут в 1%-ном водном растворе молочной кислоты. После гидролиза, обработки анионообменной смолой АВ-17, фильтрации и выпаривания раствора до содержания влаги 70% гидролизат подвергают распылительной сушке. Получена фракция олигомеров хитозана со средневязкостной молекулярной массой 1900 Да. По данным гельпроникающей хроматографии молекулярная масса продукта составляет 2000 Да.

Молекулярно-массовое распределение методом гельпроникающей хроматографии (ГПХ) получено в виде:

n=2-6- 7%n=7-12- 76%n=13-20- 17%n более 20- 0%

Выход олигомеров в расчете на исходный хитозан равен 96,0%.

Таким образом, предлагаемый способ получения олигомеров хитозана по сравнению со способом-прототипом позволил повысить производительность процесса за счет исключения потерь целевого продукта (по прототипу они составляют 25-35%) при значительном снижении энергозатрат (на 50-70% по сравнению с прототипом) на стадии распылительной сушки, а также повысить чистоту и биологическую активность целевого продукта, получив его в виде порошков с оптимальным размером частиц (60-100 мкм), повышенной термостабильности, с улучшенными органолептическими свойствами.

Указанные преимущества предлагаемого способа позволяют снизить себестоимость целевого продукта и процесса его получения, а также реализовать в промышленных условиях экономически эффективную технологию.

Способ может быть использован в пищевой промышленности и медицине. Для получения олигомеров хитозана осуществляют ферментативный гидролиз хитозана в водном растворе при рН 3,0-4,4. Гидролиз проводят в присутствии смеси хитозаназы и папаина в соотношении 1:(1-1,2) по массе. Гидролизат обрабатывают анионообменной смолой, фильтруют, концентрируют до содержания воды 62-80% и сушат. Способ позволяет снизить на 50-70% потери и повысить качество целевого продукта. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ получения олигомеров хитозана, включающий ферментативный гидролиз хитозана в водном растворе при рН 3,0-4,4 с последующей фильтрацией и сушкой, отличающийся тем, что перед фильтрацией гидролизат обрабатывают анионообменной смолой, а перед сушкой фильтрат концентрируют до содержания влаги 62-80%.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что ферментативный гидролиз проводят в присутствии смеси хитозаназы и папаина в соотношении 1:(1-1,2) по массе.