ПАРА СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ-ПРАЙМЕРОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ПРОВИРУСА ЛЕЙКОЗА КОШЕК ЭНДОГЕННОГО И ЭКЗОГЕННОГО ТИПА, И УСЛОВИЯ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ Российский патент 2008 года по МПК C12N15/33 

Изобретение относится к генной инженерии, касается синтетических олигонуклеотидов-праймеров и способов выявления вируса лейкоза кошек (FeL V). Более конкретно, отличительной особенностью настоящего изобретения являются композиции и способы детектирования вируса лейкоза кошек (FeL V).

Лейкоз кошек является передаваемым заболеванием, которое вызывается онкогенным онкорнавирусом, относящемуся к ретровирусам. Онкорнавирусы кошек можно разделить на эндогенные и экзогенные. Эндогенные вирусы (штаммы ССС и RD 114) выделяются из клеток либо спонтанно, либо под действием различных индукторов передаются вертикально, неонкогенны, сенотропны. В геноме нормальных клеток содержится более 100 копий генома этих вирусов. По данным молекулярной гибридизации, вирусы RD 114 и ССС очень сходны.

Экзогенные онкорнавирусы (вирус лейкоза кошек и вирус саркомы кошек) экотропны, передаются горизонтально, высокоонкогенны.

Вирус лейкоза кошек (FeL V) W. Sarrett (Шотландия) в 1964 г. в группе кошек с развивающейся лимфосаркомой /1/.

Весьма существенная необходимость в чувствительных специфических методах скрининга и идентификации носителей и зараженных вирусом лейкоза кошек (FeL V) животных для контроля распространения вируса в популяции кошек. Распространенность вируса в популяции: бродячие кошки - 1%, в домах, где имеется только одна кошка - 1%, где более одного животного - 27% /1/.

Информация, содержащаяся в рассматриваемой заявке, предполагает наличие нескольких генотипов вируса лейкоза. То есть генетическая информация относительно вирусов может быть полностью идентичной для всех типов вируса, но охватывает группы с отличающейся генетической информацией.

Геном вируса лейкоза кошек состоит из двуспиральной положительной РНК. Полипротеин содержит в направлении от аминоконца и карбоксиконцу нуклеокапсидный протеин (gp 80), протеины оболочки (gp 70 и р15) и неструктурные протеины (НП) (протеаза, ревертаза, эндонуклеаза).

Ряд штаммов вируса лейкоза кошек и изоляторов был идентифицирован. К ним были разработаны специфические праймеры для определения вируса. При сравнении с последовательностью праймеров, полученных для определения FeL V штамм Rickard (pFRA) /2/ и эндогенного провируса FeL V штамм CFE6 /3/, первые основываются на выделении env-участка, вторые - на выделении pol-участка.

Таким образом, ранее разработанные праймеры могут использоваться для определения только одного из типов вируса, либо эндогенного, либо экзогенного.

Технический результат - определение как эндогенного, так и экзогенного типа вируса лейкоза кошек, повышение эффективности диагностики заболевания.

Технический результат достигается следующим образом.

Были подобраны синтетические олигонуклеотиды (праймеры) следующего состава:

5'TGTCTGATGT CTGGAGCC-3'

3'TTTGGCCCAT GACGGCTT-5'

Рассчитанная длина продукта ПЦР для данных праймеров составяет 238 п.н. Последовательность, приведенная в данной заявке, соответствует gag-pol-участку вирусного генома (началу gp 80 и р15) экзогенного вируса и клона CFE6 эндогенного вируса.

Реакцию проводили в следующем режиме:

40 циклов: денатурация при 95°С в течение 0.5 мин, отжиг при 53°С в течение 0.5 мин, синтез при 72°С в течение 0.5 мин.

Инкубационная смесь конечным объемом 20 мкл содержала:

10 mM Трис-HCl, рН 9.0;

50 mM KCl;

2 mM MgCl₂;

0.1% тритон Х-100;

10 mM dNTP;

2 мкл праймеров;

10 мкл ДНК-матрицы. В качестве ДНК-матрицы использовали геномную ДНК, полученную из крови и органов кошек. ДНК выделяли с помощью набора ДНК-сорб Б для цельной крови и тканей (ЦНИИ Эпидемиологии, Москва).

0.5-1 ед. ДНК-полимеразы Taq.

Поверх смеси наслаивали 40 мкл минерального масла.

В настоящем изобретении предложены такие праймеры и способы их использования, которые соответствуют последовательностям вирусного генома и определяют описанные здесь генотипы. Праймеры настоящего изобретения образуют продукты гибридизации с нуклеиновыми кислотами, соответствующими различным генотипам вируса лейкоза кошек. Вирус лейкоза кошек имеет, по крайней мере, два генотипа, соотносящихся к экзогенному и эндогенному вирусу. Экзогенный вирус подразделяется на три типа (А, В, С), различающиеся по антигенным свойствам.

Отличительной чертой настоящего изобретения являются праймеры, содержащие нуклеиновые кислоты с последовательностями, соответствующими двум последовательностям, которые представляют генотип FeL V (экзогенному и эндогенному вирусу).

Праймеры изготавливаются по известной последовательности при помощи автоматического синтезатора олигонуклеотидов. Чистота праймеров контролируется методом ВГЖХ и составляет не менее 95%.

Праймеры хранятся при -20°С не более 6 месяцев. В течение срока хранения праймеры сохраняют высокую активность и могут применяться в указанных концентрациях.

Отличительной чертой настоящего изобретения является способ получения продукта полимеразной цепной реакции с нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, соответствующую вирусу лейкоза кошек нуклеиновой кислоте. Способ включает стадию помещения специфических праймеров, соответствующих вирусу лейкоза кошек нуклеиновой кислоте, в условия, в которых может происходить амплификация. Праймеры способны образовывать продукт амплификации с вирусом лейкоза кошек нуклеиновой кислотой в условиях полимеразной цепной реакции. Этот способ включает далее стадию создания условий амплификации для образования продукта в присутствии нуклеиновой кислоты, соответствующей участку генома вирусу лейкоза кошек.

Образование продукта амплификации можно использовать для детектирования наличия генома вирусу лейкоза кошек. Предпочтительно, праймеры образуют продукт гибридизации с нуклеиновой кислотой вируса лейкоза кошек в gag-pol-участке вирусного генома (началу gp 80 и р 15) экзогенного вируса и эндогенного вируса. В результате ПЦР-концентрация этого участка многократно увеличивается. Определение продукта реакции (амплификона) производится путем очистки продукта от не вступивших в реакцию праймеров и ферментов, присутствующих в реакционной смеси, в геле легкоплавкой агарозы и окраски специфическими красителями. Образовавшийся продукт реакции соответствует началу gag-pol-участка вирусного генома, длина участка составляет 238 п.н. Продукт амплификации нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность, соответствующую последовательности в геноме вируса лейкоза кошек, можно использовать в качестве олигонуклеотидных зондов для гибридизации при определении наличия генома вируса. Для этого в реакционную смесь добавляются меченные дНТФ либо меченные праймеры.

Опыты по проверке эффективности праймеров проходили на базе лаборатории молекулярно-генетической диагностики, ЗАО НПП "Агрофарм", Воронеж, Россия.

Исследования проводились на кошках, подозрительных по заболеванию вирусным лейкозом. Диагноз ставился комплексно и подтверждался результатами клинических, гематологических, биохимических и гистологических исследований, выполненных в профильных лабораториях ЗАО НПП "Агрофарм".

Заявляемое техническое решение характеризуется примерами.

Пример 1. Для установки диагноза были проведены исследования с использованием заявляемых праймеров и известными способами. У подозрительных по заболеванию животных осуществляли взятие крови, которую стабилизировали официнальным (5000 Е/мл) раствором гепарина и исследовали в ПЦР с применением указанных праймеров. Нами было обследовано 60 кошек с подозрением на вирусный лейкоз. При клиническом осмотре регистрировали признаки хронической почечной недостаточности (полидипсия, полиурия и др.) различной степени тяжести, анемию, хронические раневые абсцессы, асцит, увеличение печени и почек, кахексию. При исследовании крови биохимическими и морфологическими методами было обнаружено: снижение уровня гемоглобина до 24,0 г/л, повышение СОЭ до 92 мм/ч, лейкопения до 1,5·10⁹%, лимфоцитоз до 99%, в мазках периферической крови количество митотических клеток достигало 4% (при норме до 0,4%), выраженная азотемия (повышение концентрации мочевины до 54 мМ/л, креатинина до 690 мкМ/л), увеличение активности аминотрансфераз (АлАТ до 240 Е/л, АсАТ до 150 Е/л), щелочной фосфатазы до 708 Е/л, снижение концентрации альбумина до 7,5 г/л, увеличение концентрации холестерола до 12 мМ/л по отношению к стандартным физиологическим показателям. При исследовании мочи обнаружено снижение плотности до 1,005 г/л, увеличение концентрации белка до 3 г/л, в некоторых случаях отмечался сдвиг рН мочи в щелочную сторону, а также обнаруживалась глюкоза и желчные кислоты.

У одного из павших животных проводилось гистологическое исследование внутренних органов. Обнаружены неопластические изменения почек (недифференцированный рак) и некроз печени.

В результате исследования 60-ти кошек диагноз - вирусный лейкоз - был поставлен в 35 случаях, при 100% подтверждении гематологическими, биохимическими и гистологическими методами.

Пример 2. Для определения специфичности пары праймеров были проведены ПЦР-реакции, в которых в качестве ДНК-матрицы были использованы пробы крови коров, больных лейкозом (диагноз подтвержден с помощью ПЦР), и крови собак, больных лейкозом и раком молочной железы (диагноз подтвержден морфологически). В результате проведенного исследования выяснилось, что праймеры специфичны только для вируса лейкоза кошек и не вступают в реакцию с ДНК родственных видов вирусов.

Таким образом, разработанный молекулярно-генетический метод идентификации вируса лейкоза кошек с использованием патентуемых праймеров для проведения ПЦР обеспечивает раннюю диагностику заболевания и выявление носителей вируса. Выбранные уникальные олигонуклеотиды не дают перекрестных реакций с родственными видами, специфичны для кошачьих, позволяют, ограничиваясь одноступенчатой процедурой проведения реакции, быстро и надежно определять наличие или отсутствие ДНК провируса вируса лейкоза кошек эндогенного и экзогенного типа. Данная цель достигается путем ранней диагностики заболевания с использованием заявляемого изобретения, так как полимеразная цепная реакция позволяет обнаружить присутствие вируса уже через 5-10 дней после инфицирования. Применение праймеров для определения вируса лейкоза кошек позволяет обнаружить как экзогенный, так и эндогенный вирус (провирус), тогда как с помощью серологических методов антитела к вирусу определяются намного позже (через 2 месяца), при этом определяется только экзогенный вирус, возможны неточные результаты из-за антигенного различия типов экзогенного вируса.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. М., ВНИТИБП, 1998, С.372-376.

2. Roy-Burman P. et al. Pathogenicity Induced by Feline Leukemia Vims, Rickard Strain, Subgroup A Plasmid DNA (pFRA). J. Virol. 1998; V.72, N.9: 7048-7056.

3. Roy-Burman P. et al. Structure and function of endogenous feline leukemia virus long terminal repeats and adjoining regions. J. Virol. 1988; 62 (10), 3631-3641.

Изобретение относится к генной инженерии. Пара синтетических олигонуклеотидов-праймеров, используемых для выявления ДНК провируса лейкоза кошек эндогенного и экзогенного типа и имеющих следующие последовательности: 5'TGTCTGATGT CTGGAGCC-3', 3'TTTGGCCCAT GACGGCTT-5'. Также раскрыт способ осуществления полимеразной цепной реакции с использованием указанной пары синтетических олигонуклеотидов-праймеров. Изобретение позволяет усовершенствовать существующие способы диагностики лейкоза кошек и может быть использовано в ветеринарии. 2 н.п. ф-лы.

1. Пара синтетических олигонуклеотидов-праймеров, используемых для выявления ДНК провируса лейкоза кошек эндогенного и экзогенного типа и имеющих следующие последовательности:

5'TGTCTGATGTCTGGAGCC-3'

3' TTTGGCCCATGACGGCTT-5'

Трис-HCl, рН 9.010 mMKCl 50 mMMgCl₂ 2 mMтритон Х-1000.1%dNTP 10 mMолигонуклеотидов-праймеров по п.1 2 мклДНК-полимеразы Taq 0.5-1 ед

поверх смеси наслаивают 40 мкл минерального масла; затем под масло вносят ДНК-матрицу - 10 мкл; проводят 40 циклов реакции со следующими температурными режимами: денатурация при 95°С в течение 0.5 мин, отжиг при 53°С в течение 0.5 мин, синтез при 72°С в течение 0.5 мин.