ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ОБРАЗОВАНИЯ МЕТАСТАЗОВ И ПОВЫШЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ (СЕНСИБИЛИЗАЦИИ) ОПУХОЛЕЙ К ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИМ ПРЕПАРАТАМ Российский патент 2008 года по МПК A61K31/353 A61K31/404 A61K33/34 A61K33/32 A61K33/30 A61K33/26 A61K33/18 A61K33/04 

Изобретение относится к области медицины и химико-фармацевтической промышленности и касается средств для профилактики образования метастазов и повышения чувствительности злокачественных опухолей гормонзависимых тканей к химиотерапевтическим препаратам.

Несмотря на усилия фундаментальной и практической медицины заболеваемость злокачественными опухолями продолжает неуклонно расти. Число новых случаев рака, ежегодно регистрируемых в мире, составляет около 7 млн, из них более 200 тыс. регистрируется в нашей стране. Летальность от различных видов онкологических заболеваний составляет 24% и занимает второе место в общей структуре причин смертности после смертности от сердечно-сосудистых патологий (данные ВОЗ 1999 г.).

Приходится с сожалением констатировать, что эффективность традиционных методов борьбы с этим грозным недугом (хирургическое вмешательство, лучевая терапия, химиотерапия), позволивших продлить жизнь миллионам людей и остающихся основными в арсенале врачей-онкологов, приближается к предельной. Хотя радикальные методы лечения рака продолжают непрерывно совершенствоваться, даже в случае достижения положительного результата от их применения (успешное удаление первичного опухолевого очага или подавление его роста), не удается избежать осложнений и отрицательных побочных эффектов (порой более тяжелых, чем само лечение), связанных с высокой травматичностью и сильной интоксикацией организма. По-прежнему серьезной проблемой для врачей-онкологов остается возникающая в ходе лечения резистентность к применяемым химиотерапевтическим и гормональным препаратам - частая причина послеоперационных рецидивов. Практически не существует на сегодняшний день эффективных способов борьбы с метастатическими формами рака.

Таким образом, в огромном числе случаев выбор оптимального варианта лечения с минимальными для онкологического больного негативными последствиями по-прежнему остается для лечащего врача серьезной проблемой.

Особую озабоченность вызывает резко увеличившийся в последние годы рост неопластических образований, локализованных в органах репродуктивной системы: рак молочной железы (РМЖ), рак яичников, дисплазии шейки матки - у женщин, рак простаты - у мужчин. Эти предопухолевые и опухолевые заболевания называют также гормон-зависимыми, имея в виду определяющую роль в их патогенезе повышенного уровня половых гормонов. Известно, что многие из этих опухолевых заболеваний отличаются сложностью канцерогенеза, в частности, высокой агрессивностью (потенцией к метастазированию) и чрезвычайно трудны с точки зрения ранней (доклинической) диагностики. Так, почти половина женщин в нашей стране, страдающих раком молочной железы (первое место в структуре онкологической заболеваемости у женщин), обращается к врачу при распространенном (метастатическом) процессе, когда лечение часто оказывается неэффективным.

Качественно улучшить ситуацию в данной области могли бы малотоксичные и высокоселективные методы иммунотерапии, генной терапии и т.н. "целевой", или "таргетной" ("targeted" - англ.) терапии. Разработка противоопухолевых химиопрепаратов направленного действия чрезвычайно активно развивается в последние годы благодаря достижениям современной молекулярной биологии, биохимии и иммунологии. Многие из таких препаратов в настоящее время проходят II и III фазы клинических испытаний. Однако уже сейчас ясно, что процесс вывода подобных лекарственных средств на широкий фармацевтический рынок не будет быстрым. Помимо того, что большинство таргетных препаратов, являясь продуктами химического синтеза, обладают в разной степени выраженными побочными эффектами, все они малоэффективны или совсем не эффективны в качестве средств монотерапии. Становится все более очевидно, что таргетная терапия эффективна только тогда, когда "бьет" одновременно по нескольким мишеням (т.н. "мультифокальная таргетная терапия"). Однако следует иметь в виду, что цена подобной повышенной эффективности - всегда повышенная токсичность.

С целью предотвращения или устранения токсических эффектов химиотерапии постоянно проводится поиск новых сенсибилизаторов цитостатиков к опухолям.

В частности, известно применение дикарбоновых кислот в качестве ингибиторов метастазов и средств, повышающих химиотерапевтическую активность противоопухолевых препаратов (патент РФ 2295517).

Однако большинство таких веществ могут использоваться лишь в отдельных случаях при ограниченном ряде патологических состояний.

Между тем, уже сегодня существует реальная возможность помочь огромному числу онкологических больных и еще большему числу здоровых людей, не желающих получить этот угрожающий диагноз. Эта возможность основана на использовании фитонутриентов - соединений, содержащихся в природных пищевых продуктах и обладающих выраженными противоопухолевыми и другими полезными свойствами, но, в отличие от традиционных химиотерапевтических препаратов, абсолютно нетоксичных и безвредных для организма.

Внимание к подобным веществам особенно возросло после того, как в масштабных эпидемиологических исследованиях была научно обоснована давно подмеченная взаимосвязь между рациональным питанием и здоровьем человека. Было установлено, что традиционные привычки в питании вносят значительный вклад в показатели смертности от злокачественных новообразований в различных регионах мира. Статистические данные, полученные на основании многолетних наблюдений, достоверно свидетельствуют о том, что в странах, где традиционным является употребление рыбы, сырых овощей, фруктов и различных сортов чая, особенно зеленого (Юго-Восточная Азия, страны Средиземноморья), уровни онкологической заболеваемости существенно ниже по сравнению с таковыми в Европе и Америке. Современные технологии приготовления пищи, стремление к увеличению ее сроков годности, добавление консервантов и искусственных красителей, различных стабилизаторов и усилителей вкуса оказывают отрицательное влияние на здоровье человека. Изучение заболеваемости эмигрантов также подтверждает эти выводы: смена традиционной диеты влечет за собой появление тех же заболеваний, которыми страдает местное население. Перечисленные факты отодвигают на второй план значение генетической предрасположенности к развитию опухолей и ставят диету в один ряд с другими экзогенными канцерогенными факторами, такими как экологически неблагополучная окружающая среда, вредные профессиональные условия и особенности образа жизни (курение, употребление алкоголя, гиподинамия, частые стрессы).

Многолетние поиски фитонутриентов, блокирующих развитие гиперпластических процессов в гормонзависимых и других эпителиальных тканях, наконец, увенчались успехом. К настоящему моменту известна довольно обширная группа природных соединений с подобными свойствами, высокая эффективность которых доказана в многочисленных экспериментальных и клинических исследованиях. Особенно успешным оказывается сочетанное использование некоторых из них, т.к. в этом случае отдельные составляющие их противоопухолевой активности дополняют и усиливают действие друг друга.

Известен способ корригирующей терапии при комплексном лечении рака молочной железы, включающий назначение биологически активной добавки "БИОСКАН С", которая представляет собой природный продукт, извлекаемый из древесины лиственницы сибирской (патент РФ 2223779, опубл. 2004.02.20). Основным компонентом БАД является биофлавоноид - дигидрокверцетин. Все больные, принимавшие биологически активную добавку "БИОСКАН С", отмечали улучшение качества жизни, а именно повышалась работоспособность и двигательная активность, сокращалась длительность токсикоза до 1-2 дней после введения химиопрепаратов, улучшалось настроение, появлялось чувство внутреннего покоя, нормализовался сон.

В соответствии с еще одним источником одновременно с основным фитопрепаратом вводят дозу дезоксирибонуклеиновой кислоты и противоопухолевые фитопрепараты, а также дополнительно или антитоксические, и/или антианемические, и/или тонизирующие, и/или антигистаминные, и/или иммуномодулирующие, и/или мочегонные лекарственные фитопрепараты (патент РФ 2286679, опубл. 2006.11.10).

Известно применение при хронической интоксикации после проведенной химиотерапии с применением цитостатиков, препарата, включающего апирогенную ионообменную воду, микроэлементы Mn, Cu, Zn, Co, Cr, Al, Se, Ni, I, макроэлементы К, Са, Mg, Fe, флавоноидные фракции прополиса, экстракт череды трехраздельной. Данное средство восстанавливает основные иммунологические показатели (патент РФ 2236247, опубл. 2004.09.20).

Однако средства, описанные в данных источниках, не влияют на процесс метастазирования опухолей.

Известна композиция, содержащая катехин, антиоксидант, пролин и лизин, а также при необходимости селен, эффективная при ингибировании матричной металлопротеиназы и проявляющая антиметастатические свойства. В качестве катехина она может содержать катехин из группы, состоящей из эпикатехинов, эпигаллокатехина, эпикатехингаллата и эпигаллокатехингаллата (патент РФ 2284185, опубл. 2006.09.27). Однако для данной композиции не обнаружено сенсибилизирующих свойств.

В настоящее время в онкологической практике широко применяются такие природные соединения как индол-3-карбинол (I3С) и выделенный из чая флавоноид эпигаллокатехин-3-галлат (EGCG).

I3С и EGCG являются поистине уникальными биологически активными веществами, уже завоевавшими заслуженную популярность у практикующих врачей и их пациентов в Европе и США. Экспериментально и клинически обоснованная уникальность данных соединений обусловлена их способностью блокировать молекулярные механизмы, приводящие к патологической клеточной пролиферации, опухолевому неоангиогенезу и повышению инвазивной активности трансформированных клеток. К настоящему моменту идентифицировано большое число биологически активных молекулярных мишеней, ингибируемых I3С и EGCG и опосредующих все патогенетические звенья злокачественного роста. Многие из этих мишеней блокируются одновременно обоими данными соединениями.

В экспериментальных, клинических и широкомасштабных эпидемиологических исследованиях противоопухолевая активность I3С и EGCG показана в отношении огромного числа предопухолевых и опухолевых заболеваний молочной железы, яичников, шейки матки, эндометрия, простаты, кожи, желудочно-кишечного тракта (ротовой полости, пищевода, желудка, тонкого и толстого кишечника, печени, поджелудочной железы), легких [Bradlow HL, Sepkovic DW, Telang NT, Osborne MP. Multifunctional aspects of the action of indole-3-carbinol as an antitumor agent. Ann. NY Acad. Sci., 1999, 889, 204-213;

Telang NT, Katdare M, Bradlow HL et al. Inhibition of proliferation and modulation of estradiol metabolism: novel mechanisms for breast cancer prevention by the phytochemical indole-3-carbinol. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1997, 216, 246-252;

Chinni SR, Li Y, Upadhyay S et al. Indole-3-carbinol (I3C) induced cell growth inhibition, G1 cell cycle arrest and apoptosis in prostate cancer cells. Oncogene, 2001, 20, 2927-2936;

Jin L, Qi M, Chen DZ et al. Indole-3-carbinol prevents cervical cancer in human papilloma virus type 16 (HPV16) transgenic mice. Cancer Res., 1999, 59, 3991-3997;

Huh SW, Bae SM, Kim YW, Lee JM et al. Anticancer effects of (-)-epigallocatechin-3-gallate on ovarian carcinoma cell line. Gynecol. Oncol., 2004, 94(3), 760-768;

Fujimoto N, Sueoka N, Sueoka E, et al. Lung cancer prevention with (-)-epigallocatechin gallate using monitoring by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein B1. Int. J. Oncol., 2002, 20, 1233-1239;

Hibasami H, Komiya Т, Achiwa Y, Ohnishi К et al. Induction of apoptosis in human stomach cancer cells by green tea catechins. Oncol. Rep., 1998, 5(2), 527-529].

Известна также антиметастатическая активность I3C. На животных моделях рака молочной железы и рака простаты было установлено, что независимо от дизайна эксперимента (предварительная инкубация вводимых животным опухолевых клеток с I3C или i.v./i.p.введение I3C экспериментальным животным с уже образовавшимися опухолями) I3C проявлял выраженную антиметастатическую активность. В первом случае (модель рака молочной железы, предварительная инкубация вводимых животным опухолевых клеток с I3C) частота образования метастазов в легкие уменьшалась, соответственно, в 8 раз (для опухолей, индуцированных гормон-зависимыми клетками MCF-7) и в 4 раза (для опухолей, индуцированных гормон-резистентными клетками MDA-MB-468) [Meng Q, Qi M, Chen DZ, Yuan R, Goldberg ID, Rosen EM, Auborn K, Fan S. Supression of breast cancer invasion and migration by indole-3-carbinol: associated with upregulation of BRCA1 and E-cadherin/catenin complexes. J. Mol. Med., 2000, 78(3), 155-165]. Во втором случае (модель рака простаты, i.v./i.p. введение животным I3С) на фоне значительного повышения выживаемости экспериментальных животных (75% по сравнению с 15% в контроле) число метастазов в легкие уменьшалось ˜ в 13 раз, или на ˜90% [Garikapaty VPS, Ashok ВТ, Chen YG et al. Anti-carcinogenic and anti-metastatic properties of indole-3-carbinol in prostate cancer. Oncol. Reports, 2005, 13, 89-93].

Относительно EGCG также было высказано предположение о его антиметастатических свойствах (LE Magazine June 1999, GREEN TEA, Part I: Anti-carcinogenic properties of green tea), которое было подтверждено на различных моделях.

Установлено, что EGCG ингибирует две ключевые матриксные металлопротеиназы - ММР-2 и ММР-9, именуемые также желатиназами А и В (или коллагеназами), по названию гидролизуемых ими субстратов. По сравнению с другими металлопротеиназами ММР-2 и ММР-9 чаще других гиперэкспрессируются при распространенном (сопровождающемся ангиогенезом) опухолевом процессе и играют важную роль в преодолении инвазивными опухолевыми клетками барьера базальной мембраны.

Относительно точного молекулярного механизма данного процесса единого мнения пока нет. Некоторые авторы полагают, что EGCG, легко образующий комплексы с ионами металлов, вызывает хелатирование катиона цинка (Zn²⁺) - кофактора металлопротеиназных реакций [Maeda-Yamamoto M, Kawahara H, Tahara N, Tsuji К, Hara Y, Isemura M. Effects of tea polyphenols on the invasion and matrix metalloproteinases activities of human fibrosarcoma HT1080 cells. J. Agric. Food Chem., 1999, 47, 2350-2354; Morgunova E, Tuuttila A, Bergmann U, Isupov M, Lindqvist Y, Schneider G et al. Structure of human pro-matrix metalloproteinase-2: activation mechanism revealed. Science, 1999, 284, 1667-1670]. Другие - считают, что падение активности желатиназ вызвано прямым взаимодействием ферментов с EGCG [Garbisa S, Sartor L, Biggin S, Salvato B, Benelli R, Albini A. Timor gelatinases and invasion inhibited by the green tea flavonol epigallocatechin-3-gallate. Cancer, 2001, 91(4), 822-832].

В присутствии EGCG отмечалось также понижение активности мембраносвязанной матриксной металлопротеиназы 1 типа (МТ1-ММР) [Garbisa S, Sartor L, Biggin S, Salvato B, Benelli R, Albini A. Timor gelatinases and invasion inhibited by the green tea flavonol epigallocatechin-3-gallate. Cancer, 2001, 91(4), 822-832; Dell'Aica I, Dona M, Sartor L, Pezzato E, Garbisa S. (-)Epigallocatechin-3-Gallate Directly Inhibits МТ1-ММР Activity, Leading to Accumulation of Nonactivated ММР-2 at the Cell Surface. Lab. Invest., 2002, 82, 1685-1693] (данный рецепторный активаторный белок образует тримерный комплекс с TIMP-2 (TIMP-3) и неактивными проэнзимными формами металлопротеиназ и является ключевым регулятором металлопротеиназного каскада с участием ММР-2, 9 и 13); металлопротеиназы 7 (ММР-7) [Kim M, Murakami A, Kawabata К, Ohigashi Н. (-)Epigallocatechin-3-gallate promotes pro-matrix metalloproteinase-7 production via activation of the JNK1/2 pathway in HT-29 human colorectal cancer cells. Carcinogenesis, 2005, 26(9), 1553-1562], а также других ферментов, участвующих в процессах инвазии и метастазирования, в частности, секретируемой макрофагами металлоэластазы ММР-12, тромбина и сериновой эластазы нейтрофилов [Demeule M, Brossard M, Page M, Gingras D, Beliveau R. Et al. Matrix metalloproinase inhibition by green tea catechins. Biochim. Biophys. Acta, 2000, 1478, 51-60; Sartor L, Pezzato E, Garbisa S et al. (-)Epigallocatechin-3-gallate inhibits leukocyte elastase: Phytofactor for hindering inflammation, emphysema and invasion. J. Leuk. Biol., 2002, 71, 73-79].

Другой важной внутриклеточной мишенью EGCG является активатор плазминогена урокиназного типа (uPA), или просто урокиназа. Как мы отмечали выше, это гидролаза, так же, как и металлопротеиназы, вовлечена в деградацию внеклеточного матрикса. Повышенная экспрессия урокиназы регистрировалась в опухолевых клетках молочной железы, яичников, простаты, где отмечена ее ключевая роль в развитии метастазирующего рака. Ингибирование активности uPA значительно редуцировало объем опухолевой массы, а в некоторых случаях наступала полная ремиссия опухолей in vivo [Jankun J, Keck RW, Skrzypczak-Jankun E, Swiercz R. Inhibitors of urokinase reduce size of prostate cancer xenografts in severe combined immunodeficient mice. Cancer Res., 1997, 57, 559-563].

Антиметастатическая активность EGCG была продемонстрирована не только в условиях in vitro, но и в экспериментах in vivo. Первая группа экспериментов проводилась на ксено- и аллотрансплантационных животных моделях. В этих случаях рост опухолей у бестимусных мышей (мышей с искусственно подавленной иммунной системой) был обусловлен введением им, соответственно, ксеногенных (полученных от другого биологического вида, например, человека) или аллогенных (того же вида, но другой линии) раковых клеток [Liao S, Umekita Y, Guo J et al. Growth inhibition and regression of human prostate and breast tumors in athymic mice by tea epigallocatechin gallate. Cancer Lett., 1995, 96, 239-245; Sartippour MR, Heber D, Ma J et al. Green tea and its catechins inhibit breast cancer xenografts. Nutr. Cancer, 2001, 40, 149-156]. Несколько позже другими авторами противоопухолевый и антиметастатический эффект катехинов зеленого чая был также установлен и на животных с нормально функционирующей иммунной системой. [Baliga MS, Meleth S, Katiyar SK. Growth Inhibitory and Antimetastatic Effect of Green Tea Polyphenols on Metastasis-Specific Mouse Mammary Carcinoma 4T1 Cells In vitro and In vivo Systems. Clin. Cancer Res., 2005, 11, 1918-1927].

Исследователями была предложена также комбинация данных веществ. Например, в патенте РФ 1116993, опубл. 2006.05.27, описана фармацевтическая композиция для лечения и профилактики пролиферативных заболеваний, таких как опухоли простаты или молочной железы, включающая эпигаллокатехин-3-галлат и индол-3-карбинол. Однако данная комбинация не исследовалась относительно возможности повышения чувствительности (сенсибилизации) опухолей к химиотерапевтическим препаратам.

В качестве ближайшего аналога настоящего изобретения может быть указан источник, описывающий применение индол-3-карбинола в качестве антиметастатического агента и для усиления цитостатического действия, в частности цисплатина (The American Society for Nutritional Sciences J. Nutr. 134:3493S-3498S, December 2004, Fazlul H. Sarkar and Yiwei Li, Indole-3-Carbinol and Prostate Cancer).

Задача настоящего изобретения состояла в разработке стабильной при хранении комбинированной композиции для приготовления пероральных препаратов, предназначенных для профилактики образования метастазов и повышения чувствительности злокачественных опухолей гормонзависимых тканей (в частности, рака молочной железы) к химиотерапевтическим препаратам.

Для решения поставленной задачи нами была разработана фармацевтическая композиция в виде формы для перорального введения, позволяющая одновременно реализовать и взаимоусилить противоопухолевые активности входящих в ее состав действующих веществ.

Согласно изобретению предлагается композиция, состоящая из действующих веществ - индол-3-карбинола и эпигаллокатехин-3-галлата, минерального премикса, а также при необходимости из фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ, при следующем содержании компонентов в мг:

индол-3-карбинол90-150 мгэпигаллокатехин-3-галлат45-100 мгсульфат или глюконат меди0,25-0,35 мгйодид калия или натрия32,0-37,0 мгжелезо лактат4,0-5,0 мгселенит натрия0,014-0,016 мгсульфат или оксид цинка2,0-3,0 мгсульфат или карбонат марганца0,2-0,3 мг

Ключевыми противоопухолевыми активностями такого комбинированного препарата, являются:

1) снижение метастатического потенциала опухолевых клеток (подавление их миграционной и инвазивной активности);

2) повышение чувствительности злокачественных опухолей гормонзависимых тканей к химиотерапевтическим препаратам, результатом чего является потенцирование действия последних.

Комбинированная фармацевтическая композиция, созданная на основе I3С и EGCG, которые представляют собой вещества природного происхождения, практически не имеет побочных эффектов и противопоказаний. Но, специфически блокируя определенные молекулярные мишени, обладает мощным потенциалом в качестве агента, многократно усиливающего действие общепринятых химиотерапевтических препаратов. С точки зрения практикующего врача-онколога, это означает возможность многократного снижения дозы химиотерапевтических лекарственных средств, назначаемых в комплексе с данным препаратом, а следовательно, существенное снижение их токсического воздействия на организм пациента.

В составе предлагаемой композиции имеется смесь микроэлементов (минеральный премикс). И это обусловлено тем обстоятельством, что ее состав ориентирован не на доброкачественные и предопухолевые заболевания, а главным образом на злокачественные опухоли, в частности на различные типы рака молочной железы.

Две ключевые проблемы, с которыми приходится сталкиваться врачам-онкологам, это:

1) высокий инвазивный потенциал таких опухолей (способность образовывать метастазы)

2) возникающая на определенном этапе лечения невосприимчивость опухолей (опухолевая резистентность) к действию противоопухолевых химиотерапевтических препаратов.

Именно на решение этих двух проблем и направлено изобретение. Микроэлементы, входящие в состав минерального премикса (помимо того, что выполняют незаменимую роль в осуществлении жизненно важных функций отдельной клетки и целого организма, что особенно важно для онкологических больных, нуждающихся в повышенном обеспечении ценными питательными веществами, витаминами, макро- и микроэлементами и имеющих резко сниженный уровень иммунитета), существенно повышают противоопухолевую активность основных действующих компонентов - индол-3-карбинола и эпигаллокатехин-3-галлата, а также значимо усиливают собственную противоопухолевую защиту клетки и целого организма.

Входящие в состав препарата селен и цинк положительно влияют на процесс т.н. эпигенетической регуляции, посредством которого осуществляется контроль транскрипции онкогенов и опухоль-супрессорных генов.

Входящее в состав ионизированное железо также положительно влияет на противоопухолевую активность данного препарата, повышая прооксидантную активность эпигаллокатехин-3-галлата и способствуя проявлению его избирательной проапоптотической активности в отношении опухолевых клеток.

Фармацевтическая композиция может быть выполнена в виде различных твердых форм: капсул, таблеток, гранул, пеллет, пастилок. Предпочтительно она выполнена в форме капсулы или таблетки.

При изготовлении капсул в качестве инертного наполнителя используются микрокристаллическая целлюлоза, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль, фармацевтический крахмал или любой другой разрешенный Фармакопеей носитель. Смесь активных веществ и вспомогательных веществ, составляющих носитель, тщательно перемешивается до однородного состояния и фасуется в, например, в желатиновые капсулы.

Наиболее предпочтительно средство, представленное в виде твердых желатиновых капсул, состоящее из действующих веществ - индол-3-карбинола и эпигаллокатехин-3-галлата, минерального премикса, а также вспомогательных веществ - лактозы, крахмала, целлюлозы микрокристаллической, стеарата магния.

Для изготовления таблеток, пеллет, гранул могут быть использованы в частности: коллидон, лактоза, МКЦ, бутилгидроксианизол, различные виды крахмалов, например, натрия гликолят крахмал, производные целлюлозы, скользящие вещества типа магния стеарата, талька, аэросила, и другие приемлемые целевые добавки.

Предлагаемые количественные характеристики позволяют оптимизировать эффект и снизить среди пациентов вариабельность концентраций активных веществ в плазме.

Изобретение поясняется следующими чертежами

Фиг.1 отражает результаты изучения противоопухолевой эффективности предложенной фармацевтической композиции в экспериментах in vivo, а именно количественную оценку динамики роста привитой опухоли MCF-7 у бестимусных (nu/nu) мышей линии C57Black/6 в контроле и после внутрижелудочного введения животным фармацевтической композиции.

Фиг.2 отражает результаты изучения антиметастатической активности фармацевтической композиции в экспериментах in vivo в отношении опухолей, индуцированных опухолевыми клетками молочной железы эстроген-чувствительной линии MCF-7 и эстроген-резистентной линии MDA-MB-468.

На Фиг.3 показаны результаты изучения сенсибилизирующей активности заявленной фармацевтической композиции в экспериментах in vitro, а именно влияние химиотерапевтического препарата цисплатина, фармацевтической композиции и их комбинации на выживаемость опухолевых клеток предстательной железы линии РС-3 (72 часа инкубации).

Изобретение может быть проиллюстрировано также следующими примерами.

Пример 1

Состав на 1 капсулу

индол-3-карбинол90 мгэпигаллокатехин-3-галлат45 мгмедь (в составе сульфата)0,3 мгйод (в составе калия йодида)35,0 мгжелезо (в составе лактата)4,5 мгселен (в составе селенита натрия)15,0 мкгцинк (в составе сульфата)2,5 мгмарганец (в составе сульфата)0,25 мглактоза50 мгкрахмал30 мгцеллюлоза микрокристаллическая20 мгстеарат магния2 мг

Пример 2

Состав на одну таблетку

индол-3-карбинол150 мгэпигаллокатехин-3-галлат100 мгмедь (в составе глюконата)0,2 мгйод (в составе натрия йодида)32,0 мгжелезо (в составе лактата)4,0 мгселен (в составе селенита натрия)14,0 мкгцинк (в составе оксида)2,0 мгмарганец (в составе карбоната)0,2 мглактоза50 мгколлидон 3010крахмал20,6 мгцеллюлоза микрокристаллическая150 мглимонная кислота3 мгстеариновая кислота1 мг

Пример 3

Исследование противоопухолевой эффективности фармацевтической композиции в экспериментах in vivo

Животные и их содержание. Эксперименты in vivo проводились на взрослых самках бестимусных (nu/nu) линейных мышей C57Black/6 (7 недель), полученных из Charls Rivers Со (США).

Длительность карантина (акклиматизационного периода) для всех животных составляла 14 дней. Клетки с животными были помещены в отдельные комнаты. Животные содержались при 12-часовом режиме освещения, температуре 20-25°С, относительной влажности 50-70% и свободном доступе к корму и воде.

Определение противоопухолевой эффективности фармацевтической композиции в экспериментах in vivo.

За 1 неделю до прививки опухолевых клеток самкам бестимусных (nu/nu) линейных мышей C57Black/6 имплантировали в подлопаточную область пилюлю, содержащую 0,72 мг эстрадиола, из которой гормон высвобождается в течение 60 дней.

Для индукции солидных опухолей опухолевые клетки аденокарциномы молочной железы человека линии MCF-7 собирали с помощью 0,05% раствора Трипсин-ЭДТА ("Sigma", США), трижды промывали стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS) и затем в количестве 3 млн клеток в 0,1 мл физиологического раствора вводили подкожно каждому экспериментальному животному в боковую область (число живых клеток подсчитывали с помощью красителя трипанового синего (0,1%) и светового микроскопа).

Через 24 час после инокуляции ксеногенных опухолевых клеток молочной железы животным из опытной группы (10 животных в группе) начинали вводить внутрижелудочно (с помощью зонда) заявленную фармацевтическую композицию в количестве, эквивалентном 10 мг I3С/кг и 5 мг EGCG/кг (терапевтическая доза) с периодичностью 5 раз в неделю. Контрольным животным вводили физиологический раствор.

Размер солидных опухолей измеряли 1 раз в 2-3 дня после ее появления. Объем опухоли рассчитывали по формуле: V=π/6×L (мм) × W² (мм²),

где L - длинный, a W - короткий диаметр опухоли [Swaneck GE, Fishman J. Covalent binding of the endogenous estrogen 16 alphahydroxyestrone to estradiol receptor in human breast cancer cells: characterization and intranuclear localization. Proc Natl Acad Sci USA, 1988, 85: 7831-7835].

Экспериментальная часть

Для исследования противоопухолевого действия предложенной фармацевтической композиции ее вводили внутрижелудочно самкам бестимусных мышей C57Black/6, которым предварительно были инокулированы ксеногенные опухолевые клетки аденокарциномы молочной железы человека линии MCF-7. Композицию вводили в количестве, эквивалентном 10 мг I3С/кг и 5 мг EGCG/кг с периодичностью 5 раз в неделю.

Противоопухолевую эффективность препарата оценивали, определяя объем солидной опухоли в опытной и контрольной группах животных (см. Фиг.1).

Как видно из Фиг.1, начиная приблизительно с 12 дня от начала эксперимента у животных контрольной группы, не получавших заявленную фармацевтическую композицию, отмечался интенсивный рост солидных опухолей. В течение последующих 20 дней (с 14 по 34 день эксперимента) средний размер опухоли, индуцированной клетками аденокарциномы человека линии MCF-7, увеличился ˜ в 10 раз. В то же время средний объем опухоли у животных, получавших заявленную фармацевтическую композицию, за тот же промежуток времени увеличился всего в 3 раза.

Отсюда можно заключить, что предложенная фармацевтическая композиция обладает выраженным противоопухолевым действием в отношении рака молочной железы в условиях in vivo на животной ксенотрансплантационной модели.

Гистологическое исследование тканей животных, получавших заявленную фармацевтическую композицию (умерщвленных под эфирным наркозом в конце эксперимента), показало, что данный препарат в применявшихся дозах не вызывает каких-либо изменений клеточной морфологии печени, почек и др. функционально важных органов, а также не влияет на вес экспериментальных животных.

Пример 4.

Исследование антиметастатической активности заявленной фармацевтической композиции в экспериментах in vivo

Материалы и методы

Для изучения влияния заявленной фармацевтической композиции на образование и рост метастазов в легких нами была использована хорошо известная, ранее описанная экспериментальная модель [Rockwell S. Effect of host age on the transplantation, growth, and radiation response of EMT6 tumors. Cancer Res., 1981, 41, 527-531].

Клетки аденокарциномы молочной железы человека эстроген-чувствительной линии MCF-7 и эстроген-резистентной линии MDA-MB-468 в экспоненциальной фазе роста инкубировали с фармацевтической композицией в течение 6 часов. Заявленную фармацевтическую композицию растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) в 1000-кратной концентрации и добавляли в клеточную суспензию так, чтобы конечные концентрации входящих в его состав I3C и EGCG составляли, соответственно 100 мкМ и 16 мкМ. В контрольные пробы добавляли ростовую среду, содержащую соответствующее количество DMSO. Затем клетки собирали с помощью 0,05% Трипсин-ЭДТА-буфера ("Sigma", США), трижды промывали стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS), ресуспендировали в PBS до конечной концентрации 7,5×10⁴ клеток в 1 мл и в количестве 3×10⁴ клеток в 0,4 мл вводили в боковую хвостовую вену 8-недельным самкам линейных мышей fvB/n (число живых клеток подсчитывали с помощью красителя трипанового синего (0,1%) и светового микроскопа). Контрольным животным вводили опухолевые клетки, не содержащие заявленной фармацевтической композиции.

Через 20 дней после инокуляции опухолевых клеток животных из опытной и контрольной групп (по 5 животных в каждой группе) умервщляли под эфирным наркозом, удаляли легкие, фиксировали их в растворе Боуина и с помощью микроскопа оценивали количество на легочной поверхности метастатических узелков.

Экспериментальная часть

На Фиг.2 представлены результаты, подтверждающие влияние заявленной фармацевтической композиции на метастатическую активность опухолевых клеток молочной железы эстроген-чувствительной линии MCF-7 и эстроген-резистентной линии MDA-MB-468.

Как видно из Фиг.2, в случае инокуляции экспериментальным животным опухолевых клеток, проинкубированных с заявленной фармацевтической композицией, их способность образовывать метастазы в легких драматическим образом падала.

Для опухолей, индуцированных гормонзависимыми клетками MCF-7, частота образования метастазов в легкие уменьшалась в 9 раз, а для опухолей, индуцированных гормон-резистентными клетками MDA-MB-468, в 5 раз. При этом так же, как и в случае с индивидуальным индол-3-карбинолом [Meng Q, Qi M, Chen DZ, Yuan R, Goldberg ID, Rosen EM, Auborn K, Fan S. Supression of breast cancer invasion and migration by indole-3-carbinol: associated with up-regulation of BRCA1 and E-cadherin/catenin complexes. J. Mol. Med., 2000, 78(3), 155-165], в контроле метастатическая активность гормон-резистентных опухолевых клеток существенно превышала метастатическую активность гормон-чувствительных опухолевых клеток.

Пример 5.

Исследование сенсибилизирующей активности заявленной фармацевтической композиции в экспериментах in vitro

Материалы и методы

В экспериментах использовали клетки карциномы предстательной железы андроген-нечувствительной линии РС-3. Клеточную культуру, полученную из Американской Коллекции Типовых Клеточных Культур АТСС (Bethesda, MD, США), культивировали в пластиковых культуральных флаконах ("Costar", США) в ростовой среде F-12 с добавлением 10% бычьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина ("GibcoBRL") при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО₂.

Клетки PC-3 рассевали по 96-луночным планшетам для микротитрования ("Costar", США) в концентрации 6×10⁴ клеток линии на мл. После прикрепления клеток к поверхности и достижения монослоя (24 час для клеток РС3) культуральную ростовую среду заменяли на среду, содержащую одну из трех композиций: 1) 20 нМ цисплатин; 2) заявленную фармацевтическую композицию (так, чтобы конечная концентрация входящих в ее состав I3C и EGCG составляла, соответственно, 30 мкМ и 5 мкМ) или 3) комбинацию цисплатина (20 нМ) и заявленной фармацевтической композиции (30 мкМ I3C и 5 мкМ EGCG) (ее растворяли в водноспиртовом растворе, содержащем 20% этанола), после чего клетки инкубировали еще в течение 48 час.

Выживаемость опухолевых клеток после инкубации с указанными препаратами оценивали с помощью МТТ-теста, основанного на образовании живыми клетками формазана из соли тетразолия. Для этого за 2-4 часа до окончания инкубации в каждую лунку добавляли по 50 мкл (1 мг/мл) раствора МТТ (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]2,5-дифенилтетразолия бромид) в культуральной среде. После развития окраски среду удаляли, кристаллы формазана растворяли в 150 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) и измеряли интенсивность окраски по поглощению при 540 нм на многоканальном спектрофотометре ("Labsystem"). Выживаемость клеток оценивали в процентах от соответствующего контроля [Alley MC, Scudiero DA, Monks et al. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell liens using a microculture tetrasolium assay. Cancer Res., 1988, Vol.48, pp.589-601; Mosman T. Rapid Colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Meth., 1983, V.65, P.55-63].

Экспериментальная часть

На Фиг.3 представлены результаты, подтверждающие наличие у заявленной фармацевтической композиции выраженной сенсибилизирующей активности.

Как видно из Фиг.3, при совместной инкубации широко известного препарата цисплатина (20 нМ) и заявленной фармацевтической композиции (конечные концентрации входящих в его состав действующих компонентов индол-3-карбинола и эпигаллокатехин-3-галлата составляли, соответственно, 30 мкМ и 5 мкМ) выживаемость клеток карциномы предстательной железы андроген-нечувствительной линии РС-3 драматическим образом падала и составляла всего 8% от контроля (клетки PC-3 без добавок).

В то же время индивидуальный цисплатин (20 нМ) практически не влиял на выживаемость клеток PC-3 (90% от контроля). Индивидуальная заявленная фармацевтическая композиция (без цисплатина) значительно уменьшала выживаемость опухолевых клеток линии PC-3 (30% от контроля), но в меньшей степени, чем комбинация с цисплатином.

Таким образом, изобретение позволяет:

а) впервые использовать комбинацию индол-3-карбинола и эпигаллокатехин-3-галлата и комплекса микроэлементов при профилактике онкологических заболеваний, имеющих угрозу метастазирования;

б) повышать чувствительность злокачественных опухолей эпителиального происхождения (сенсибилизировать опухоли) к действию химиотерапевтических препаратов.

Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности и медицины и касается фармацевтической композиции для профилактики образования метастазов и повышения чувствительности злокачественных опухолей гормон-зависимых тканей к химиотерапевтическим препаратам. Предложена пероральная фармацевтическая композиция, содержащая в качестве действующих веществ - индол-3-карбинол, эпигаллокатехин-3-галлат и минеральный премикс, включающий сульфат или глюконат меди, йодид калия или натрия, лактат железа, селенит натрия, сульфат или оксид цинка, сульфат или карбонат марганца при определенном содержании компонентов. Предложенная композиция позволяет предупредить метастазирование при злокачественной опухоли, а также повысить чувствительность последней к химиотерапевтическим препаратам, что обеспечивает более эффективное лечение злокачественных новообразований. 2 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Пероральная фармацевтическая композиция для профилактики образования метастазов и повышения чувствительности злокачественных опухолей гормон-зависимых тканей к химиотерапевтическим препаратам, отличающаяся тем, что она содержит в качестве действующих веществ - индол-3-карбинол, эпигаллокатехин-3-галлат и минеральный премикс, включающий сульфат или глюконат меди, йодид калия или натрия, лактат железа, селенит натрия, сульфат или оксид цинка, сульфат или карбонат марганца при следующем содержании компонентов, мг:

индол-3-карбинол90-150эпигаллокатехин-3-галлат45-100сульфат или глюконат меди0,25-0,35йодид калия или натрия32,0-37,0железо лактат4,0-5,0селенит натрия0,014-0,016сульфат или оксид цинка2,0-3,0сульфат или карбонат марганца0,2-0,3