СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАЛИЧИЯ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА К АНТИГЕНАМ ВАКЦИНЫ "ПНЕВМО-23" Российский патент 2008 года по МПК G01N33/569 

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки поствакцинального иммунитета при вакцинации вакциной «Пневмо-23» (Авентис Пастер, Франция), зарегистрированной в Российской Федерации.

Streptococcus pneumoniae - широко распространенный возбудитель инфекционных заболеваний у человека. Самыми частыми клиническими формами пневмококковой инфекции у детей являются средний отит, пневмония и менингит. У взрослых - пневмония, сепсис, менингит. Пневмококк служит причиной 20% обострений хронического бронхита. Поскольку возбудитель распространяется преимущественно воздушно-капельным путем, основным способом борьбы с болезнями, вызываемыми пневмококком, является вакцинопрофилактика. Иммунитет у заболевших и привитых обеспечивается за счет образования антител к капсульным полисахаридам пневмококка. Отсюда - все вакцины для профилактики пневмококковых заболеваний основным компонентом имеют тот или иной полисахарид. «Пневмо-23» содержит полисахариды 23 серотипов пневмококка, которые составляют примерно 90% всех циркулирующих среди населения. Полисахаридные антигены капсулы вызывают иммунный ответ по Т-независимому механизму. Защитные типоспецифические антитела появляются при колонизации, инфекции и при вакцинации. Уровень антител, необходимый для защиты от пневмококковой инфекции, точно не установлен. Данные литературы свидетельствуют, что после вакцинации в течение 2-3 недель концентрация специфических антител возрастает в 2 и более раз (Musher D.M. et al., 1990).

Известен способ выявления антител к капсульным полисахаридам S.pneumoniae с помощью ИФА, рекомендованный Всемирной Организацией Здравоохранения и описанный Wernette C.M. et al. (Clin.Diagn. Lab. Immunol. 2003, July, 10(4), P.514-519) или на сайте www.vaccine.uab.edu.

Способ заключается в анализе каждого образца сывороток с каждым из выделенных капсульных полисахаридов для выявления серотиповых специфических IgG антител. Способ, вероятней всего, подходит для серодиагностики и, поскольку он количественный, подразумевает использование референс-сывороток. Для изучения поствакцинального иммунитета описанный способ трудоемок и требует большего времени, чем предложенный нами. Кроме того, в рекомендованном ВОЗ-тесте используют препараты, содержащие С-полисахарид, что требует дополнительной обработки анализируемых сывороток для нейтрализации антител к нему.

Из уровня техники не известен способ определения наличия поствакцинального иммунитета к антигенам вакцины «Пневмо-23». Техническим результатом, на решение которого направлено данное изобретение, является ускорение и упрощение способа оценки поствакцинального иммунитета к антигенам вакцины «Пневмо-23», а также он не требует дополнительной обработки анализируемых сывороток для нейтрализации антител к С-полисахаридам.

Для достижения указанного технического результата способ определения наличия поствакцинального иммунитета к антигенам вакцины «Пневмо-23» методом ИФА заключается в том, что твердый носитель сорбируют вакциной «Пневмо-23», содержащей 23 полисахарида пневмококка, разведенной в фосфатно-солевом буфере с рН 7,0-7,4 в течение 2-х часов при температуре 37°С и затем при температуре 8-10°С в течение 16-18 часов и наносят рабочие разведения исследуемых и контрольной сывороток, инкубируют при температуре 18-22°С в течение 30 мин, удаляют избыток антител, вносят конъгат, представляющий собой антитела кроличьи против IgG (H+L) человека, меченные пероксидазой, повторно инкубируют при тех же параметрах, отмывают от избытка конъюгата, вносят субстратную смесь, содержащую тетраметилбензидин и перекись водорода в заданных значениях, инкубируют при температуре 18-22°С в течение 15-20 мин. В защищенном от света месте останавливают реакцию введением реагента, измеряют оптическую плотность исследуемой и контрольной сывороток на содержание антител до вакцинации и после вакцинации и по увеличению оптической плотности в исследуемых сыворотках в 4 и более раза судят о наличии поствакцинального иммунитета.

Наличие гуморального иммунитета может быть оценено с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). В основе метода лежит иммуносорбент, представляющий собой стрипированный 96-луночный планшет, сорбированный вакциной «Pneumo-23» (Авентис Пастер, Франция) - 0,5 мл вакцины разводят в 50 мл фосфатно-солевого буферного раствора с рН 7,0-7,4 и этим раствором сорбируют полистирольные планшеты (100 мкл в лунку) в течение 2-х часов при 37°С, а затем 16-18 час при 8-10°С.

При выполнении анализа образцы сывороток вносят в лунки иммуносорбента в рабочем разведении 1:200. Для анализа используют парные сыворотки - до и минимум через 14 дней после вакцинации. В качестве контроля используют пул сывороток 100 клинически здоровых людей в том же разведении. После инкубации и отмывки во все лунки иммуносорбента вносят конъюгат в рабочем разведении. Проявка реакции осуществляется субстратной смесью, содержащей тетраметилбензидин (ТМБ) и перекись водорода.

Используемые реагенты:

(1) иммуносорбент - планшет полистирольный разборный, состоящий из 12 8-луночных стрипов, сорбированных вакциной «Pneumo-23»;

(2) отрицательный контроль (К-) - пул сывороток, полученный смешением равных объемов 100 сывороток здоровых доноров;

(3) конъюгат (КГ) - антитела кроличьи против IgG (H+L) человека, меченные пероксидазой, жидкий, концентрированный;

(4) субстратная смесь, содержащая тетраметилбензидин (ТМБ);

(5) промывающий и разводящий фосфатно-солевой буферный раствор, десятикратный концентрат с детергентом (ФСБ-Д)к;

(6) стоп-реагент - 0,9 М H₂SO₄.

Приготовление растворов для проведения анализа:

1) (ФСБ-Д)к перед применением разводят дистиллированной водой в 10 раз. Полученный раствор ФСБ-Д хранят не более 3-х недель при 4-8°С. Раствор предназначен для отмывки планшета от непрореагировавших компонентов, разведения сывороток и конъюгата.

2) Контроль (К-), а также анализируемые сыворотки перед проведением анализа разводят раствором ФСБ-Д до соотношения 1:200 (5 мкл на 1000 мкл ФСБ-Д). Рабочее разведение сывороток хранению не подлежит.

3) Рабочее разведение конъюгата готовят непосредственно перед использованием, разводя исходный раствор до соотношения 1:400 ФСБ-Д (25 мкл на 10 мл ФСБ-Д).

Последовательность операций

Отмывка иммуносорбента. Во все лунки планшета вносят ФСБ-Д в объеме не менее 0,2 мл. Выдерживают планшет при комнатной температуре в течение 2-3 мин. Содержимое лунок удаляют вытряхиванием. Отмывку повторяют еще 3 раза. Внесение образцов. Во все лунки планшета последовательно вносят рабочие растворы (1:200) контроля (К-) в дублях и анализируемые сыворотки. Объем вносимых проб - 100 мкл.

Инкубация. Выдерживают планшет с растворами сывороток в течение 30 мин при 18-22°С.

Отмывка от избытка антител. Жидкость из лунок планшета удаляют вытряхиванием и 3-кратно отмывают раствором ФСБ-Д, как указано в п.1.

Внесение рабочего раствора конъюгата. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл рабочего раствора КГ.

Инкубация. Как в п.3.

Отмывка от избытка КГ. Как в п.1.

Внесение субстратного раствора ТМБ. Во все лунки вносят по 100 мкл раствора ТМБ.

Инкубация. 15-20 мин в темноте при температуре 18-22°С.

В каждую лунку вносят по 50 мкл стоп-реагента.

Учет результатов:

Вывести спектрофотометр на нулевой уровень («blank») по воздуху.

Измерить оптическую плотность в лунках планшета при λ=450 нм в течение 10 минут после остановки реакции. Результаты могут быть представлены в ОП и у.е. (условные единицы), которые рассчитывают по формуле:

N для взрослых клинически здоровых людей - (ОП_к-+0,25) или до 100 у.е.

Пример исследования сывороток людей, вакцинированных «Пневмо-23» (до и после вакцинации)

№№ п/пшифрРезультат ИФАОПУ.е.17120,19380,9719427750,24481,2424832980,19381,1122247910,611221,0320654110,19380,7214462420,15301,0721471260,44881,0721487300,48961,326091110,32641,1222410310,64128 1,13226

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки поствакцинального иммунитета при вакцинации вакциной «Пневмо-23». Сущность изобретения заключается в том, что на твердый носитель с сорбированной вакциной «Пневмо-23», содержащей 23 полисахарида пневмококка, наносят рабочие разведения исследуемых и контрольной сывороток, инкубируют при температуре 18-22°С в течение 30 мин, удаляют избыток антител, вносят конъюгат в рабочем разведении, повторно инкубируют при тех же параметрах, отмывают от избытка конъюгата, вносят субстратную смесь, содержащую тетраметилбензидин и перекись водорода в заданных значениях, инкубируют при температуре 18-22°С в течение 15-20 мин в защищенном от света месте, останавливают реакцию введением реагента, измеряют оптическую плотность исследуемой и контрольной сывороток на содержание антител до вакцинации и после вакцинации и по увеличению оптической плотности в исследуемых сыворотках в 4 и более раза судят о наличии поствакцинального иммунитета. Преимущество изобретения заключается в повышении чувствительности способа. 1 табл.

Способ определения наличия поствакцинального иммунитета к антигенам вакцины "Пневмо-23" методом ИФА, заключающийся в том, что твердый носитель сорбируют вакциной "Пневмо-23", содержащей 23 полисахарида пневмококка, разведенной в фосфатно-солевом буфере с рН 7,0-7,4 в течение 2 ч при температуре 37°С и затем при температуре 8-10°С в течение 16-18 ч и наносят рабочие разведения исследуемых и контрольной сывороток, инкубируют при температуре 18-22°С в течение 30 мин, удаляют избыток антител, вносят конъюгат, представляющий собой антитела кроличьи против IgG (H+L) человека, меченные пероксидазой, повторно инкубируют при тех же параметрах, отмывают от избытка конъюгата, вносят субстратную смесь, содержащую тетраметилбензидин и перекись водорода в заданных значениях, инкубируют при температуре 18-22°С в течение 15-20 мин в защищенном от света месте, останавливают реакцию введением реагента, измеряют оптическую плотность исследуемой и контрольной сывороток на содержание антител до вакцинации и после вакцинации и по увеличению оптической плотности в исследуемых сыворотках в 4 и более раза судят о наличии поствакцинального иммунитета.