СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЦИСТНОГО ЭХИНОКОККОЗА В БИОЛОГИЧЕСКОМ ОБРАЗЦЕ Российский патент 2008 года по МПК C12Q1/68 C12N15/11 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к эпидемиологии, и может быть использовано при идентификации генотипа возбудителя цистного эхинококкоза у населения.

Эхинококкоз - тяжелое паразитарное заболевание человека, характеризующееся развитием в печени, реже в легких, головном мозге и других органах кистозных образований. Возбудителем цистного эхинококкоза является личиночная стадия (ларвоциста) ленточного червя Echinococcus granulosus. В настоящее время известно, что внутри вида Е. granulosus существует внутривидовая вариабельность. Отдельные биологические варианты (биовары): «овечий», «лошадиный» и другие, связаны с преимущественным паразитированием в определенном виде промежуточного хозяина. (Черникова Е.А. Современное систематическое положение, распространение и изменчивость Echinococcus spp. // Мед. паразитол. - 2005. - №3. - С.49-53). Биовары Е. granulosus отличаются морфологическими, иммунологическими, биологическими и инвазионными свойствами (Перчун Н.И. Экспериментальные модели эхинококкозов: характеристика изолятов возбудителей и химиотерапия имагинального альвеолярного эхинококкоза // Автореф. дисс.... канд. биол. наук. - М., 2002. - 24 с.; Одоевская И.М. Проблемы получения антигенов эхинококка и анализ иммуногенных свойств рекомбинантных белков EgF и EgB. // Мед. паразитол. - 2006. - №2. - С.3-8). Идентификация имеет большое практическое значение, создавая основу для изучения эпидемиологии и эпизоотологии эхинококкозов, совершенствования вакцин и диагностикумов, в установлении родственных и эволюционных связей между разными представителями рода Echinococcus spp.

Известен способ идентификации подвидов эхинококка по морфологическим, биологическим, биохимическим, иммунологическим и культуральным признакам. Однако он часто дает неодназначный результат и не всегда возможен. Поэтому для выявления биовара Echinococcus spp.в настоящее время используют методы молекулярной биологии. Такими методами являются сравнительный анализ структуры маркерных генов (секвенирование), метод оценки полиморфизма длин рестрикционных фрагментов продуктов полимеразной цепной реакции (PCR-RFLP), оценка полиморфизма длин амплифицированных фрагментов (RAPD). В качестве ДНК-маркеров используют полиморфизм двух митохондриальных генов, кодирующих первую субъединицу цитохром-С-оксидазы (CO1) и NADH-дегидрогеназы (ND1), а также фрагмент ядерного рибосомного гена - транскрибируемого спейсера ITS1 (Bowles J., Blair D., McManus D.R. Genetic variants within the genus Echinococcus identified by mitochondrial DNA sequencing // Mol. Biochem. Parasitol. - 1992. - Vol.54 (2). - P.165-173; Bowles J., Blair D., McManus D.R. Molecular genetic characterization ofcervid strain of Echinococcus granulosus // Parasitology. - 1994. - Vol.109. - P.215-221; Bowles J., Blair D., McManus D.R. A molecular phylogeny of the genus Echinococcus // Parasitology. - 1995. - Vol.110. - P.317-328; Okamoto M., Bessho Y., Kamiya M., Kurosawa Т. et al. Phylogenetic relationships within Tenia taeniaeformis variants and other taeniid cestodes inferred from the nucleotide sequence of the cytochrome с oxidase subunit I gene // Parasitol. Res. - 1995. - Vol.81 (6). - P.451-458; Thompson R.C., McManus D.P. Towards a taxonomic revision of the genus Echinococcus // Trends Parasitol. 2002. - Vol.18. - P.452-457). Эти методы позволяют получать наиболее точные и надежные результаты, так как обладают высокой специфичностью и воспроизводимостью.

Для осуществления молекулярно-генетических методов необходимо получение фрагментов ДНК маркерных генов в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Гены митохондриальной ДНК являются наиболее удобными маркерами для изучения популяционного генетического полиморфизма и широко используются для геномного типирования различных видов животных. Они исключительно редко подвергается рекомбинациям, а возникающие несложные мутации являются таксоноспецифичными.

Прототипом изобретения является способ получения фрагментов митохондриального гена СO1 Echinococcus granulosus в полимеразной цепной реакции синтеза ДНК при помощи праймеров:

5'TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT 3' и 5'TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG 3' (Bowles J., Blair D., McManus D.R. Genetic variants within the genus Echinococcus identified by mitochondrial DNA sequencing // Mol. Biochem. Parasitol. - 1992. - Vol.54 (2). - P.165-173).

Данный метод находит широкое применение при получении фрагментов ДНК, необходимых для выявления генотипа Echinococcus spp., методами секвенирования, PCR-RFLP, RAPD. Однако при проведении исследований по идентификации изолятов Е. granulosus из Южного Урала способом Bowles J. et al. (1992) часть образцов ДНК не амплифицировались.

Нами были изучены 12 фертильных ларвоцист, полученных у пациентов во время оперативного вмешательства по поводу цистного эхинококкоза. Для выделения ДНК брали клетки герминативной оболочки эхинококковой кисты. Выделяли ДНК (с протеиназой К). Депротеинизацию и осаждение ДНК осуществляли стандартным фенол-хлороформным методом Sambrook J. et al. (1987). Для геномного типирования Е. granulosus применили метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК по Bowles et al. (1992). В качестве ДНК-маркера использовали фрагмент митохондриального гена, кодирующего первую субъединицу цитохром-С-оксидазы. В результате проведенной ПЦР от 9 использованных в работе образцов получили амплификаты фрагмента гена СО1. Для получения продуктов ПЦР от остальных изолятов были подобраны новые праймеры и условия амплификации. Полученные ПЦР-продукты ДНК от этих изолятов подвергли прямому секвенированию ферментативным дидезокси-методом Сэнгера (Senger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain terminating inhibitors // Proc. Nalt. Acad. Sci. U.S.A. - 1977. - V.88. - P.2815-2819) с помощью наборов для секвенирования секвеназой и Т7 ДНК-полимеразой фирм United States Biochemicals и Pharmacia соответственно. Электрофоретическое разделение продуктов секвенирующих реакций проводили в 6%-ном полиакриламидном геле, содержащем 7 М мочевины, в приборе вертикального типа Макрофор (Pharmacia - LKB, Швеция). Анализ нуклеотидных последовательностей, проведенный с помощью пакета программ Lasergene фирмы "DNASTAR, Inc." (США), показал на значительное сходство (99%) изученных образцов ДНК с нуклеотидной последовательностью фрагмента гена CO1 (локуса DQ109036) Е. granulosus, зарегистрированного в "GenBank" как генотип G1. Сравнительный анализ секвенсов выявил замену нуклеотида в положении 12 (С12Т). При наличии подобной изменчивости гена отжиг праймера с координатами 1-24, по методу Bowles J. et al. (1992), становится невозможным.

Техническим результатом изобретения является повышение точности и надежности получения фрагментов ДНК митохондриального гена CO1 Е. granulosus методом ПЦР за счет создания и использования более универсальных в отношении различных изолятов праймеров.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Материалом для исследования служат образцы ДНК, выделенные из клеток ларвоцисты Е. granulosus. Для этого берут фрагменты герминативной оболочки материнской кисты (2-3 грамма), промывают 3 раза в 3-х объемах стерильного физиологического раствора. Замораживают жидким азотом и растирают в фарфоровой ступке. Растертую ткань суспендируют в 1 мл буфера ТЕ (10 мМ трис-основание, рН 7,4 и 1 мМ ЭДТА, рН 8,0). Выделяют ДНК (с протеиназой К). Для этого к 200 мкл взвеси клеток герминативной оболочки добавляют 300 мкл лизирующего буфера (100 мМ Nad, 50 мМ трис-HCl, рН 8, 50 мМ ЭДТА, рН 8 и 1% SDS) и протеиназу К (500 мкг на пробу). Пробу инкубируют при 56°С в течение 6-12 часов. Депротеинизацию осуществляют известным методом (Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Commonly used techniques in molecular cloning. Extraction with phenol: chloroform // Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1987. P. E3-E4). Затем ДНК осаждают 96° этанолом, инкубируют при -20°С 15-20 минут и центрифугируют 10 минут при 10000 об/мин. Осадок ДНК промывают 70° этанолом, затем просушивают его на воздухе и растворяют в воде. Реакцию амплификации проводят в буфере, содержащем 10 мМ трис-HCl, рН 8,8, 50 мМ KCl, 4 мМ MgCl₂, 0,001% желатина, по 3 мкл 2,5 мМ каждого из dNTP, 2 ед Tag-полимеразы, 0,25 пкМ каждого праймера и 25 нг геномной ДНК. Сверху наслаивают 20 мкл легкого минерального масла. В работе используют подобранные нами праймеры для СО1 следующей структуры: "форвард" 5' TGTGTTGATTTTGCCTGG 3'; "реверс" 5' GCCACCACAAACCAAGTATC 3'. Отжиг осуществляют при температуре 52°С, амплификацию проводят при следующем режиме термоциклера:

94°С - 3 мин 1 цикл

72°C - 1 мин 1 цикл

16°С - хранение.

Получают фрагменты ДНК, необходимые для проведения идентификации генотипа Echinococcus granulosus методами секвенирования, PCR-RFLP, RAPD.

Метод доступен по реактивам и оборудованию.

Пример 1. Больной К., 14 лет, из Давлекановского района Республики Башкортостан, поступил в хирургическое отделение с диагнозом эхинококковая киста правого легкого. После госпитализации и обследования проведена эхинококкэктомия. Кусочек герминативной оболочки кисты взят на молекулярно-генетический анализ. Выделена ДНК. В полимеразной цепной реакции, проведенной методом Bowles J. et al. (1992), амплификаты не получены. Проведено исследование предлагаемым способом. Для этого получены образцы ДНК из клеток герминативной оболочки материнской кисты Е. granulosus фенол-хлороформным методом. Реакцию амплификации проводили в буфере, содержащем 10 мМ трис-HCl, рН 8,8, 50 мМ KCl, 4 мМ MgCl₂, 0,001% желатина, по 3 мкл 2,5 мМ каждого из dNTP, 2 ед Tag-полимеразы, 0,25 пкМ каждого праймера и 25 нг геномной ДНК. Сверху наслаивали 20 мкл легкого минерального масла. В работе использовали подобранные нами праймеры для СO1 следующей структуры: "форвард" 5' TGTGTTGATTTTGCCTGG 3'; "реверс" 5' GCCACCACAAACCAAGTATC 3'. Отжиг осуществляли при температуре 52°С, амплификацию проводили при следующем режиме термоциклера:

94°С - 3 мин 1 цикл

72°С - 1 мин 1 цикл

16°С - хранение,

что позволило получить фрагменты гена CO1 Е. granulosus. Проведение последующей идентификации генотипа стало возможным.

Пример 2. Больная Б., 5 лет, из Баймакского района Республики Башкортостан, поступила в хирургическое отделение с сочетанным эхинококкозом правого и левого легкого. После операции кусочек герминативной оболочки одной кисты взят на молекулярно-генетический анализ. Выделена ДНК. Проведена ПЦР методом Bowles J. et al. (1992) - амплификаты не получены. Использование предлагаемого способа позволило получить фрагменты ДНК гена CO1 Е. granulosus и провести идентификацию генотипа возбудителя эхинококкоза.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в эпидемиологии. Предложен способ идентификации возбудителя цистного эхинококкоза, который заключается в выделении ДНК из клеток ларвоцисты эхинококка и проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) с применением праймеров, специфичных в отношении митохондриального гена CO1 Echinococcus granulosus. Для использования в качестве прямого и обратного праймеров предложены соответственно олигонуклеотиды с последовательностями 5' TGTGTTGATTTTGCCTGG 3' и 5' GCCACCACAAACCAAGTATC 3', которые являются более универсальными в отношении различных изолятов возбудителя, что повышает надежность анализа при обследовании населения в различных регионах.

Способ идентификации возбудителя цистного эхинококкоза в биологическом образце, включающий выделение ДНК и ее анализ на наличие последовательности митохондриального гена С01 Echinococcus granulosus путем проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК, отличающийся тем, что используют праймеры следующей структуры: 5TGTGTTGATTTTGCCTGG 3' и 5'GCCACCACAAACCAAGTATC 3'.