СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ И РЕЗИСТЕНТНОСТИ К ЗАБОЛЕВАНИЮ ЦИСТНЫМ ЭХИНОКОККОЗОМ У ДЕТЕЙ Российский патент 2010 года по МПК A61B10/00 C12Q1/68 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к эпидемиологии, и может быть использовано для прогнозирования повышенного риска заболевания цистным эхинококкозом детей, инвазированных ленточным червем Echinococcus granulosus.

При цистном эхинококкозе, одном из самых тяжелых и широко распространенных гельминтозов, до сих пор остаются не до конца изученными вопросы клинической реализации инвазии. Имеется немало доказательств того, что люди значительно чаще инвазируются Е. granulosus, чем заболевают клинической формой (абортивная форма заболевания развивается в 99% случаев). Известны случаи бессимптомного течения эхинококковой болезни или со слабо выраженными симптомами невыявленного эхинококкоза, которые заканчивались полным выздоровлением (Тумольская Н.И. Клинические аспекты проблемы эхиноккозов и пути ее решения // Мед. паразитол. 1992. № 5-6. С.5-9.). Биологическая сущность этих явлений пока только начинает изучаться.

К числу наиболее актуальных аспектов проблемы профилактики эхинококкозов относятся вопросы своевременного выявления предрасполагающих к заболеванию факторов. В последнее время накапливается все больше данных, свидетельствующих о том, что возникновение паразитарных заболеваний или характер их протекания ассоциирован с определенными полиморфизмами генов-кандидатов (Озерецковская Н.Н. Цестодозы-зоонозы - неотложная глобальная проблема // Мед. паразитол. и пар. болезни. 2001. С.52-59; Тканевые гельминтозы у взрослых и детей: метод, рекомендации / М.М.Антонов, Л.П.Антыкова, И.В.Бабаченко [и др.]. - СПб., 2004. - 38 с). Выявление генетических маркеров предрасположенности дает возможность прогнозировать риск развития патологии или тяжесть ее протекания, подобрать специфическую терапию для конкретного пациента (Баранов B.C., Баранова Е.В., Иващенко Т.Э., Асеев М.В. Геном человека и гены «предрасположенности». // СПб. - 2000. - 272 с). При некоторых паразитарных болезнях наблюдается очевидная корреляция частоты определенных специфичностей главного комплекса гистосовместимости (HLA) с уровнем иммунного ответа больного на инвазию. Исследование в Европе показало ассоциацию HLA-B8, DR3, DQ2 гаплотипов, а в Китае -HLA DR4 с тяжелым течением альвеококкоза (Godot V, Harraga S, Beurton I., et al. Resistance/susceptibility to Echinococcus multilocularis infection and cytokine profile in humans. II. Influence of the HLA B8, DR3, DQ2 haplotype. Clin Exp Immunol. - 2000. - V.121. - P.491-98). Определение частоты распространения антигенов HLA в России показало на большую встречаемость В5 и В18 при цистном эхинококкозе (Щербаков A.M., Монхе-Барредо П.А. Распределение антигенов системы HLA среди больных эхинококкозами. // Мед. паразитол. - 1989. - № 6. - С.75).

Известен способ выявления эхинококкоза по серологическим реакциям (РЛА, РНГА, ELISA и др.), дополненный инструментальными методами (УЗИ, КТ, МРТ). Чувствительность, специфичность, разрешающая способность этих исследований недостаточна для выявления ранних стадий развития ларвоцист (Ахмедов И.Г., Османов А.О. Классификация эхинококковых кист, выявленных после хирургического лечения // Хирургия, 2002. № 9. с.28; Одоевская И.М. Диагностическая эффективность иммуноферментной тест-системы на основе рекомбинантного антигена EgF при ларвальном гидатидозе (эхинококкозе) овец // Мед. паразитол. - 2007. - № 1. - С.20-24).

Разработанные в настоящее время методы не позволяют достоверно прогнозировать развитие эхинококкоза, поскольку имеют следующие недостатки:

- клиническая диагностика болезни на ранних этапах развития патологии представляет значительные трудности, поскольку картина заболевания чаще всего отличается полиморфизмом и не имеет четких дифференциально-диагностических признаков;

- диагноз эхинококкоза устанавливается инструментальными методами исследования (УЗИ, КТ, рентген) часто в запущенных случаях;

- общепринятые лабораторные анализы в большинстве случаев малоспецифичны, а также недостаточно чувствительные серологические реакции;

Прототипом изобретения является способ прогнозирования развития клинической формы цистного эхинококкоза, заключающийся в том, что из лимфоцитов периферической венозной крови выделяют ДНК, проводят генотипирование полиморфизма Ile462Val 7 экзона гена CYP1A1, кодирующего фермент цитохром Р450. При обнаружении в генотипе аллеля Val прогнозируют риск развития цистного эхинококкоза у обследуемого (патент RU 2324940, 2008 г.).

Задачей изобретения является расширение арсенала средств для прогнозирования заболевания цистным эхинококкозом у детей.

Изучение нами характера распределения специфичностей HLA у больных эхинококкозом по сравнению с группой контроля выявило статистически значимые ассоциации (р<0,05). На основании полученных результатов были определены генетические маркеры повышенного риска и устойчивости к заболеванию. Тестирование полиморфизма HLA позволило с большой вероятностью (OR>1) прогнозировать возможность клинической манифестации эхинококкоза до появления первых выраженных клинических симптомов болезни.

Технический результат изобретения - получение прогностических критериев риска цистного эхинококкоза у инвазированных Е. granulosus детей на основе выявления молекулярно-генетических маркеров.

Способ доступен по реактивам и оборудованию и осуществляется следующим образом.

Материалом для исследования служат образцы ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической венозной крови у больных эхинококкозом детей методом фенольно-хлороформной экстракции, описанный Mathew С.С. (The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology / Ed. J.M. Walker. - New York, London. - 1984. - Vol.2. - P. 31-34).

1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивают и переливают в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляют 50 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трисНСl (рН 7,6).

2. Смесь центрифугируют 20 мин при 4 000 об/мин.

3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 8 мл 25 мМ ЭДТА (рН 8,0) и суспензируют.

4. К суспензии добавляют 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К (в концентрации - 10 мг/ мл). Смесь для лизиса оставляют на ночь в термостате при температуре 38°C.

Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке.

1. Для депротеинизации к лизату добавляют 0,5 мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1 М трисНCl до рН 7,8.

2. Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин.

3. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК, РНК и неденатурированные белки.

4. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем - хлороформом.

5. Препараты осаждают двумя объемами 96% этанола.

6. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной Н₂O; раствор хранят при t-20°C.

В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации нужного фрагмента.

Применяют стандартный набор реагентов для типирования генов HLA DRB1 * и DQB1 * (фирмы «PROTRANS», Германия). Амплификацию специфичностей проводят в реакционной смеси, содержащей 35 мкл геномной ДНК (концентрация 50-300 нг/мкл); 1,1 мкл Taq-полимеразы (5 Ед/мкл); 46 мкл буфера R; 93 мкл буфера Y. Реакционную смесь распределяют по 10 мкл в 16 эпендорфов, на дно которых наносят соответствующие олигонуклеотидные праймеры. Режим амплификации следующий: начальная денатурация при 94°C в течение 2 мин; 10 циклов, включая денатурацию при 94°C - 10 сек, отжиг праймеров и синтез ДНК при 65°C - 1 мин; 20 циклов, включая денатурацию при 94°С - 10 сек, отжиг праймеров при 61°C - 50 сек; синтез ДНК при 72°C - 30 сек. После амплификации фрагменты ДНК разделяют электрофоретически в 1% агарозном геле, окрашивают раствором бромида этидия и анализируют в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. В качестве электролита для электрофореза применяют 0,5х боратный буфер (0,089 М трисНСl, рН 7,9; 0,089 М борная кислота; 0,002 ЭДТА с рН 8,0). Продукт амплификации виден в виде светящейся полосы красно-оранжевого цвета. Идентифицированные аллели генов HLA классифицируют согласно общепринятой в мире номенклатуре (Bodmer J.G., Marsh S.G.E., Albert T.D. et al. / Nomenclature for factors of the HLA system // Hum. Immunol. - 1995. - V.43. - P.149-164).

Для количественной оценки предрасположенности к развитию эхинококкоза для вышеуказанного генетического маркера вычисляют показатель соотношения шансов (odds ratio - OR). Для этого используют формулу, предложенную Бландом (Bland J.M., Altaian D.G. / The odds ratio // Br. Med. J. - 2000. - Vol.320. - P. 1468):

OR=(a×d)/(b×c)

где а - число лиц с наличием, b - с отсутствием маркера (аллеля HLA) среди больных эхинококкозом; c и d - число лиц соответственно с наличием и отсутствием маркера среди здоровых индивидов. Повышенный риск развития констатировали при OR>1.

Нами были исследованы дети (N=78), больные цистным эхинококкозом, поступившие на хирургическое лечение в Республиканскую детскую клиническую больницу (г.Уфа). Возраст пациентов - от 3 до 16 лет. По половому составу распределение было следующим: 57% мальчики, 43% девочки. Поражение печени наблюдалось у 43% пациентов, легкого - 34%, сочетанное поражение легкого и печени - 23%. Диагноз был установлен на основании клинических, инструментальных (УЗИ, КТ, рентгенографии) методов и подтвержден после оперативного вмешательства гистологическим исследованием оболочки кисты. Контрольную группу составили 50 практически здоровых лиц, жителей районов Южного Урала. Возраст индивидов контрольной группы варьировал от 5 до 16 лет. Группы обследованных пациентов и контроля были сопоставимы по возрасту, полу и местожительству.

Проведен молекулярно-генетический анализ полиморфизма генов HLA локусов DRB1* и DQB1*. Установлено, что достоверно чаще встречаются среди больных эхинококкозом, чем среди здоровых в отношении этого заболевания детей в Башкортостане, специфичности DRB1*07 (24,7% против 14,4% в контроле, χ2=4,16; р=0,04; OR=l,94), DQB1*09 (6,7% против 0,5% в контроле, χ2=7,26; р=0,007; OR=13,2), DQB1*02 (29,8% против 18,5% в контроле, χ2=4,25; р=0,04; OR=l,87). Специфичность DQB1 *05 наоборот является значительно менее частотной в группе пациентов, чем в контроле (15,4% против в 27,7% контроле, χ2=4,99; р=0,02; OR=0,47).

Таким образом, наличие в генотипе специфичностей HLA DRB1 *07, DQB1*09 и DQB1*02 является фактором предрасположенности. Высокий показатель отношения шансов позволяет рассматривать эти специфичности в качестве генетических маркеров, ассоциированных с повышенным риском цистного эхинококкоза у детей. Специфичность DQB1 *05 обладает протективным эффектом, что позволяет рассматривать его в качестве генетического маркера устойчивости.

Пример 1. В Баймакском районе Республики Башкортостан (одном из наиболее неблагополучных по эхинококкозу) проведено профилактическое обследование 53 детей с использованием ультразвуковой диагностики и серологических методов (ИФА) для определения инвазированных Е. granulosus лиц. Выявлены 3 больных эхинококкозом, которые были направлены в хирургическое отделение больницы.

У 17 (из 53) обследуемых детей выявлена положительная реакция ИФА (эхинококковая киста не найдена). Им проведено молекулярно-генетическое исследование полиморфизма генов HLA локусов DRB1* и DQB1 * по предложенной методике. У 4 из них обнаружены специфичности DRB1*07, DQB1*02 в генотипе, что позволило прогнозировать им повышенный риск заболевания эхинококкозом.

Диспансерное наблюдение сероположительных лиц в течение года показало: эхинококковая киста малых размеров обнаружена у 3 (из 4) детей, являющихся носителями DRB1 *07, DQB1 *02.

Пример 2. Девочка Л., 16 лет, поступила в хирургическое отделение с жалобами на общую слабость, периодические боли в правом подреберье, усиливающиеся при физической нагрузке.

Объективно: состояние удовлетворительное; кожа и видимые слизистые бледные. В правом подреберье при глубокой пальпации определяется болезненность, живот не вздут, мягкий. Печень выступает из-под края реберной дуги на 2 см. УЗИ органов брюшной полости выявило жидкостное, объемное образование округлой формы, расположенное в III сегменте печени размером 39×34 мм с четкими ровными контурами.

Перед операцией проведено исследование по предложенной методике. Установлено: является носителем DQB1*05. В отношении эхинококкоза прогноз благоприятный. Послеоперационное исследование кисты печени показало на ее непаразитарный характер.

Изобретение относится к медицине, а именно к эпидемиологии. Выделяют ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, проводят HLA-типирование. При обнаружении в генотипе специфичностей DRB1*07, DQB1*09, DQB1*02 прогнозируют риск цистного эхинококкоза у обследуемого. При обнаружении специфичности DQB1*05 устойчивость к заболеванию. Использование изобретения выявляет предрасположенность и резистентность к цистному эхинококкозу у детей с высокой точностью.

Способ выявления предрасположенности к цистному эхинококкозу инвазированных Е. granulosus детей, включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, проведение генотипирования, отличающийся тем, что проводят HLA-генотипирование и при обнаружении специфичностей DRB1*07, DQB1*09, DQB1*02 прогнозируют повышенный риск цистного эхинококкоза, а при обнаружении специфичности DQB1*05 - устойчивость к заболеванию у обследуемого.