СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 6α-МЕТИЛГИДРОКОРТИЗОНА ИЛИ ЕГО 11β-АЛКАНОИЛОКСИПРОИЗВОДНЫХ (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 6α-МЕТИЛПРЕДНИЗОЛОНА ИЛИ ЕГО 11β-АЛКАНОИЛОКСИПРОИЗВОДНЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛУЧЕННОГО 6α-МЕТИЛГИДРОКОРТИЗОНА ИЛИ ЕГО 11β-АЛКАНОИЛОКСИПРОИЗВОДНЫХ Российский патент 2008 года по МПК C07J5/00 C12P33/02 

Настоящее изобретение относится к области органического синтеза, конкретно касается получения стероидных соединений (кортикостероидов), таких как 6α-метилгидрокортизон и 6α-метилпреднизолон, и может быть использовано в химической, микробиологической и фармацевтической отраслях промышленности.

6α-Метилпреднизолон - кортикостероидный препарат, обладающий глюкокортикоидной активностью. По активности близок к преднизолону, но в отличие от преднизолона практически не обладает минералокортикоидной активностью [М.Д.Машковский. Лекарственные средства. 14-е издание. Том 2, с.30. Изд-во «Новая волна», Москва, 2002 г.]. Так, хорошо известный лекарственный препарат преднизолон (1,2-дегидропроизводное гидрокортизона) применяют при ревматизме, инфекционном неспецифическом полиартрите, бронхиальной астме, острой лимфатической и миелоидной лейкемии, инфекционном мононуклеозе, нейродермитах, экземе и других заболеваниях.

6α-Метилпреднизолон (1,2-дегидропроизводное 6α-метилгидрокортизона) по сравнению с преднизолоном обладает более высокой противовоспалительной и противоаллергической активностью и оказывает меньше побочных действий, в частности не раздражает слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта.

Известные медицинские препараты 6α-метилпреднизолона [Depo-Medrol (Pharmacia Upjohn, Belgium); Medrol (Pharmacia Italia, Italia), Methylprednisolone (Sopharma, Bulgaria); Urbason, Medeson, Metypred (Corporation Finland) и др.] также применяются при заболеваниях ревматического характера, бронхиальной астме, сенной лихорадке, при переливании крови и в трансплантологии.

6α-Метилпреднизолон используется и в качестве субстрата для получения его производных, которые применяются как лекарственные препараты для местной обработки при различных кожных заболеваниях и ожогах, и для получения ингаляционных средств для терапии различных аллергических заболеваний дыхательных путей.

Известны способы получения 6α-метилпреднизолона из 6α-метилгидрокортизона с использованием методов микробиологической трансформации.

В частности, известен способ получения 6α-метилпреднизолона, включающий выращивание клеток бактерий Arthrobacter globiformis 193 и трансформацию 6α-метилгидрокортизона при аэрации с последующим выделением целевого продукта, в котором после выращивания клеток проводят их иммобилизацию в полиакриламидном геле, затем трансформацию ведут в неростовой среде в две стадии, причем на первой стадии процесс осуществляют, используя гидрокортизон в качестве субстрата и индуктора, по окончании первой стадии процесса из среды выделяют преднизолон, а на второй стадии в качестве субстрата используют 6α-метилгидрокортизон, при этом аэрацию осуществляют, подавая воздух импульсно с вытеснением всего объема отработанного газа [SU 1616147, 30.11.1994].

Известен способ получения 1,2-дегидропроизводных 4-дельта-3-кетостероидов путем трансформации 4-дельта-3-кетостероидов с помощью микроорганизма Arthrobacter globiformis 193 в присутствии циклодекстрина, отличающийся тем, что в качестве циклодекстрина используют водорастворимые химически модифицированные производные β-циклодекстрина [RU 2156302, 20.09.2000]. Однако известным способом получают преднизолон и в нем не описано получение 6α-метилпреднизолона из 6α-метилгидрокортизона.

Известен способ получения дегидроаналогов стероидов, включающий микробиологическую трансформацию соответствующих Δ⁴-3-кетостероидов в присутствии полимерного материала с последующим выделением из реакционной среды целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве полимерного материала используют гомо- или сополимер N-винилкапролактама с мол.м. 10⁴-10⁶ или сополимеры N-винилкапролактама с виниловым спиртом, винилацетатом или винилметилацетамидом с содержанием оных до 46%, 45% и 15% соответственно [RU 2042687, 27.08.1995]. Однако известный способ заявлен в общем виде и изобретение не проиллюстрировано примерами, в нем не описано получение 6α-метилпреднизолона из 6α-метилгидрокортизона.

Промежуточным соединением в синтезе 6α-метилпреднизолона из гидрокортизона является 6α-метилгидрокортизон.

Известные способы введения С₆-метильного заместителя в стероидную молекулу можно разделить на 2 группы.

В первую группу входят синтезы, включающие промежуточную эпоксидацию Δ⁵-двойной связи действием надкислоты. Для образования Δ⁵ - двойной связи исходные Δ⁴-3-кетосоединения подвергают кетализации, при этом одновременно проводя защиту 3 и 20-кетогрупп. Последующее раскрытие 5,6-эпоксида с одновременным введением метильной группы осуществляют метилирующим реагентом, например метиллитием или метилмагнийбромидом (схема 1). Так, например, известен способ введения метильной группы в положение С₆, заключающийся в обработке 11β,17α,21-тригидрокси-5-прегн-4-ен-3,20-дион 3,20-бис(алкиленкеталя) (I) пербензойной кислотой в хлороформе, взаимодействием полученного 5α,6α-оксидо-11β,17α,21-тригидроксиаллопрегнан-3,20-дион 3,20-бис-(алкиленкеталя) (II) с метилмагнийбромидом в среде тетрагидрофурана, приводящим к 5α,11β,17α,21-тетрагидрокси-6α-метилаллопрегнан-3,20-дион 3,20-бис-(алкиленкеталю) (III). Последующее снятие защитной кетальной группы 2 н. серной кислотой в метаноле приводит к 5α,11β,17α,21-тетрагидрокси-6α-метилаллопрегнан-3,20-диону (IV), обработка которого водным 0,1 н. раствором гидроксида натрия в абсолютном этаноле приводит к целевому соединению - 6α-метилгидрокортизону (V) [US 2928851, 15.03.1960; G.B.Spero et al., J. Am. Chem. Soc., 1956, 78(23), 6213-6214].

Недостатками данного способа являются многостадийность, образование большого количества побочных продуктов, с чем связана необходимость дорогостоящей очистки конечных продуктов и, как следствие, невысокие выходы промежуточных и целевого соединений.

В другую группу входят способы синтеза 6α-метил-соединений, в частности 6α-метилгидрокортизона, ключевой стадией в которых является введение метиленовой группы в положение С₆. Восстановление метиленовой группы в метильную группу приводит к целевому 6α-метил-соединению.

Введение С₆-метиленовой группы осуществляют с использованием в качестве метиленирующего агента формальдегида или его производных. Эти способы предусматривают обязательную предварительную енолизацию α,β-ненасыщенного кетона кольца А, необходимую для поляризации системы двойных связей с образованием нуклеофильного атома углерода С₆, с последующим замещением атома водорода при С₆ на формильную или метиленовую группу и различаются тем, что в одних случаях образованный промежуточный диенол выделяют в виде эфира [D.Burn et al., Tetrahedron, 1965,21(6), 1619-1624] или диенамина [F.Schneider et al., Helv. Chim. Acta, 1973, 56(7), 2396-2404], в других же енолизация проводится in situ без выделения промежуточного продукта.

Известно несколько вариантов С₆-метиленирования енолизованных Δ⁴-3-кето-стероидов. К первой группе методов С₆-метиленирования можно отнести способ с применением формилирования по Вильсмейеру, ко второй группе - методы так называемой прямой конденсации с формальдегидом или его производными:

- метод прямого метиленирования, описанный Анненом и соавторами [US 4322349, 30.03.1982; Synthesis, 1982, №1, p.34-40; Liebigs Ann. Chem. 1983, (4), p.712; EP 0100874, 22.02.1984; EP 0149222, 24.07.1985]

- и метод конденсации с реагентом Манниха [R.Bohlmann et al., DE 4121484, 07/01.1993].

Метод с применением реактива Вильсмейера включает следующую последовательность реакций: присоединение реактива Вильсмейера к 3 - алкиловому эфиру Δ^3,5-прегнадиена с образованием 6-формильного замещённого; дальнейшее превращение формильного производного реакцией восстановления до оксиметильного производного и последующими гидролизом и дегидратацией - в метиленовое [US 3074935, 22.01.1963; US 3112305, 26.11.1963; Burn D. et al., Tetrahedron, 1964, 20(3), 597-609]. Последующее каталитическое гидрирование двойной связи 6-метиленовой группы завершается образованием 6α-метильного заместителя [Burn D. et al., Tetrahedron, 1965, 21(6), 1619-1624; Burn D. et al., Tetrahedron, 1969, 25(5), 1155-1158; US 3117966, 14.01.1964 (схема 2)].

Метод прямого метиленирования, предложенный Анненом и соавторами, заключается во взаимодействии стероида с производными формальдегида (такими как диметилацеталь, диэтилацеталь формальдегида или метоксиметилацетат) в хлорированных растворителях при температуре кипения в присутствии избытка хлорокиси фосфора и ацетата натрия [Annen K. et al., Synthesis, 1982, №1, р.34-40; EP 0034115, 19.08.1981; DE 3004508, 06.08.1981; EP 0100874, 22.02.1984; EP 0149222, 24.07.1985; DE 3204281, 21.07.1983 (схема 3)].

Однако, несмотря на значительно более короткий путь к целевому продукту, этот способ не позволяет получать выход 6-метиленового производного из 21-ацетата гидрокортизона выше чем 50% [US 4322349; 30.03.1982, Annen, K.; Hofmeister, H.; Laurent, H. and Wiechert, R.Synthesys, 1982, №1, p.34-40].

Известен способ получения 6-метиленстероида из Δ⁴-3-кетостероида, в частности из 21-ацетата гидрокортизона, или его 3-енолэфира и формальдегида, отличающийся тем, что взаимодействие протекает в присутствии первичного или вторичного амина [DE 4121484, 07.01.1993], и заключающийся в том, что Δ⁴-3-кетостероид путем нагревания в среде тетрагидрофурана с этилортоформиатом в присутствии каталитического количества сульфокислоты превращают в соответствующий 3-енолэфир, который затем взаимодействует с реактивом Манниха, образующимся in situ из водного раствора формальдегида и N-метиланилина в присутствии того же катализатора. Последующая обработка соляной кислотой приводит к целевому продукту. Однако выход 6-метилен-производного 21-ацетата гидрокортизона также не превышает 50%.

Низкий выход можно объяснить наличием побочных реакций с участием незащищенных гидроксигрупп при С₁₁ и С₁₇. В жёстких условиях реакции прямого метиленирования (кипячение в хлорированных углеводородах с хлорокисью фосфора в течение 5-6 часов) или в условиях реакции Манниха в присутствии свободного гидроксила при С₁₇ можно ожидать появление нежелательных продуктов дегидратации и D-гомоаннелирования. Поэтому даже применение защиты 11β-гидроксильной группы в виде трифторацетата или триметилсилильного эфира не позволяет достичь высоких выходов на стадии метиленирования при наличии свободной 17α-гидроксигруппы [US 4322349, 30.03.1982].

Для защиты диоксиацетоновой боковой цепи часто используют бисметилендиокси-защиту (БМДО-защита), позволяющую в одну стадию защитить имеющиеся в боковой цепи функциональные группы, включая гидроксильные. Однако формилирование 17,20;20,21-бисметилендиоксипроизводного гидрокортизона с незащищенной 11β-гидроксигруппой в условиях реакции Вильсмейера (ДМФ, POCl₃ или фосген) также, по-видимому, не дает хорошего результата (авторы [GB 1070414; 01.06.1967] не приводят выход 6-формильного продукта), так как реакция формилирования при С₆ в данном случае может осложняться побочными реакциями с участием 11β-гидроксигруппы. При этом достигаемый выход при С₆-формилировании 21-пропионата 3-этокси-Δ^3,5-производного также не превышает 53% [GB 1070414; 01.06.1967; D. Burn et al., Tetrahedron, 1969, 25(5), p.1155-1158].

Таким образом, мы пришли к выводу, что помимо обязательного выполнения условия енолизации существует другой общий для всех вариантов фактор, обеспечивающий успешность осуществления процесса С₆ функционализации без образования нежелательных продуктов сопутствующих реакций по гидроксильным группам. Это необходимость предварительной защиты всех гидроксильных групп, имеющихся в структуре молекулы исходного стероида: не только защиты диоксиацетоновой боковой цепи, но и 11-гидроксигруппы.

Известно, что для защиты 11β-гидроксигруппы ее обычно превращают в тригалоацетат (в частности, трифторацетат) или используют триметилсилильную защиту. Эти защиты наиболее приемлемы, так как не только легко образуются, но и легко удаляются. Применение для защиты ангидридов низших кислот возможно, однако было ограничено (в частности, ранее не применялось при С₆-метиленировании) из-за проблем, возникающих при их последующем удалении с помощью химических методов сольволиза.

Поэтому третьим существенным моментом в синтезе 6α-метилгидрокортизона является селективное удаление защитных групп без модификации структуры молекулы. Однако известно, что снятие защиты гидроксила при С₁₁ применением традиционных методов химического сольволиза (например, щелочного гидролиза) может привести к образованию нежелательных продуктов трансдиаксиального элиминирования сложноэфирной группы с образованием Δ⁹⁽¹¹⁾-двойной связи или продукта переэтерификации сложноэфирной группы с образованием трудноотделимого простого эфира.

Определенную трудность представляет удаление БМДО-защиты диоксиацетоновой боковой цепи, что является серьезным препятствием ее использования, особенно в коммерческих целях. Обычно используют для удаления БМДО-защиты смесь уксусной (или муравьиной) и концентрированной соляной кислот, а также концентрированной фтористоводородной кислоты [GB 1138173, 27.12.1968]. В этих условиях происходит образование побочных продуктов, например возможна этерификация свободных гидроксильных групп в стероидном ядре или в свободной боковой цепи (например, образование 11β-формиата, 21-формиата или продуктов D-гомо-перегруппировки). Попытка далее химически гидролизовать 11β-формиат, что требует значительно более жестких условий гидролиза, приводит к образованию существенного количества продуктов D-гомоаннелирования, а также к образованию продуктов деградации диоксиацетоновой боковой цепи. Все это приводит к снижению выхода конечного продукта и загрязнению его относительно большим количеством нежелательных побочных продуктов. Выход продукта гидролиза, как правило, не превышает 65-70%.

Общим недостатком использования известных способов является то, что при образовании значительных количеств примесей указанные выше методы неэффективны и при многократной кристаллизации происходят большие потери основного продукта. Для того чтобы избежать потерь основного продукта и повысить эффективность способа выделения, прибегают к различным приемам, например к хроматографированию на колонке с силикагелем.

Наиболее близким по сущности к предложенному способу получения 6α-метилгидрокортизона в части образования промежуточного С₆-метилен-производного является способ получения 6-метилен-Δ⁴-3-кетостероида [US 4322349, 30.03.1982], включающий реакцию соответствующего Δ⁴-3-кетостероида с производным формальдегида в инертном растворителе при температуре от 20 до 80°С в присутствии сильного кислого конденсирующего агента, причем в качестве производного формальдегида могут быть использованы Н₂С(ОХ)₂ (где Х метил, этил или изопропил) или триоксан, а в качестве конденсирующего агента - производные фосфорной кислоты (например, пентоксид фосфора на носителе или оксихлорид фосфора в присутствии ацетата натрия), или сильно кислая катионообменная смола, или сильная кислота с рКа <1, такая как концентрированная серная кислота, хлористоводородная кислота, п-толуолсульфокислота или хлорная кислота. Способ проиллюстрирован примером (пример 5), заключающимся в том, что в синтезе 6-метиленпроизводного прямой конденсацией с производным формальдегида в присутствии сильного кислого конденсирующего агента используют гидрокортизон, 21-гидроксигруппа которого защищена с помощью образования ацетоксипроизводного, 11β- и 17α-гидроксигруппы защищены образованием нитроэфиров.

Так, раствор 21-ацетокси-11β,17α-динитроокси-4-прегнен-3,20-диона и метилаля в дихлорметане обрабатывают смесью пентоксида фосфора и силикагеля. Смесь перемешивают 3 дня при комнатной температуре и затем добавляют новые порции метилаля, пентоксида фосфора и силикагеля. Через 2 дня реакционную смесь отфильтровывают, остаток промывают дихлорметаном и упаривают в вакууме досуха. Продукт хроматографируют на силикагеле, используя градиентное элюирование. Из 5 г исходного соединения получают 2,6 г 6-метилен-замещенного.

Недостатками описанного в US 4322349 процесса являются:

- низкий выход продукта метиленирования - 21 -ацетокси-11β, 17α-динитроокси-6-метиленпрегн-4-ен-3,20-диона;

- применение для очистки 21-ацетокси-11β,17α-динитроокси-6-метиленпрегн-4-ен-3,20-диона колончатой хроматографии с градиентным элюированием, существенно усложняющей технологический процесс;

- отсутствие информации о способах удаления защитных групп и выходе 11β,17α,21-тригидрокси-6-метиленпрегн-4-ен-3,20-диона.

Наиболее близким по сущности к предложенному способу получения 6α-метилпреднизолона является способ получения 1,2-дегидропроизводных кортикостероидов путем микробиологической трансформации кортикостероидов с помощью микроорганизма вида Arthrobacter globiformis в присутствии β-циклодекстрина и вещества, снижающего трансмембранный потенциал, с последующим выделением целевого продукта [RU 1830949, 09.07.1995], заключающийся в том, что с целью повышения эффективности процесса трансформации за счет снятия ингибирования субстратом при увеличении его исходной концентрации и увеличения степени превращения в качестве трансформирующего микроорганизма используют штамм Arthrobacter globiformis ИБФМ 193, а в качестве вещества, снижающего трансмембранный потенциал, используют аминокислоту (глицин, или оксипролин, или глутаминовую кислоту, или цистеиновую кислоту), или α-кетоглутаровую кислоту, или никотинамид, или ацетат ретинола, или их сочетания, а трансформацию проводят как свободными, так и иммобилизованными клетками микроорганизма.

Недостатками описанного в RU 1830949 процесса являются:

- применение дорогостоящих интенсификаторов процесса (аминокислот и других);

- использованные нагрузки исходного 6α-метилгидрокортизона не превышают 10 г/л.

Кроме того, использование иммобилизации клеток штамма-трансформатора (включение в полиакриламидный гель) значительно усложняет процесс и создает определенные трудности при его масштабировании: использование токсичных реагентов для иммобилизации (акриламид, метиленбисакриламид), невозможность использования стандартного ферментационного оборудования из-за механического разрушения биокатализатора в процессе трансформации.

Технической задачей одного из изобретений заявленной группы является, таким образом, повышение эффективности и технологичности проведения микробиологического 1,2-дегидрирования и получение 6α-метилпреднизолона (или его 11β-алканоилоксипроизводных) из 6α-метилгидрокортизона (или его 11β-алканоилоксипроизводных) способом, лишенным вышеуказанных недостатков.

Технической задачей в заявленной группе изобретений является увеличение выхода целевых продуктов путем снижения вероятности протекания побочных реакций на стадии функционализации положения С₆ стероидной молекулы, практически полное исключение образования побочных продуктов и осмоления реакционной массы на стадии удаления защитных группировок и получение 6α-метилгидрокортизона и 6α-метилпреднизолона способами, лишенными вышеуказанных недостатков.

Техническая задача решается способом получения 6α-метилгидрокортизона и его 11β-алканоилоксипроизводных общей формулы (I)

где R¹=H, или CF₃СО, или СН₃СО - группы,

из гидрокортизона или его 21-ацилоксипроизводного общей формулы (II)

где R=H или Acyl,

включающим предварительную последовательную защиту 11β,- 17α- и 21-гидроксильных групп гидрокортизона (или его 21-ацилоксипроизводного) сначала путем введения 17α,20;20,21-бисметилендиокси-защиты - защиты диоксиацетоновой боковой цепи (17α- и 21-гидроксильных групп) с образованием 17α,20;20,21-бисметилендиоксипроизводного - и последующей алканоилокси-защиты 11β-гидроксильной группы с образованием 11β-алканоилокси- замещенного; С₆-метиленирование образовавшегося 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-алканоилоксипроизводного гидрокортизона, например, реакцией формилирования с помощью реактива Вильсмейера или конденсацией с формальдегидом или его производным при соотношении их соответственно от 1 до 10 молей реагента на 1 моль стероида с образованием 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-алканоилокси-6-метиленпроизводного; восстановление полученного 6-метиленпроизводного в 6α-метилпроизводное, последовательное удаление защиты гидроксильных групп химическим путем (сольволизом) или поэтапно удалением 17α,20;20,21-бисметилендиокси-защиты химическим путем, а защиты 11β-гидроксильной группы - ферментативным дезацилированием; выделение 6α-метилгидрокортизона из культуральной жидкости, при этом восстановление 6-метиленпроизводного в 6α-метилпроизводное осуществляют до или после удаления защиты 11β,- 17α- и 21- гидроксильных групп полностью или частично.

В случае удаления защитной 11β-ацилоксигруппы микробиологическим дезацилированием его осуществляют с помощью штамма Agromyces mediolanus ВКМ Ас-1388 (syn. Corynebacterium mediolanum) или Nocardioides sp. ABT 13.

Еще одним изобретением заявленной группы является получение 6α-метилпреднизолона или его 11β-алканоилоксипроизводных 1,2-дегидрированием с использованием в качестве исходного вещества 6α-метилгидрокортизона или его 11β-алканоилоксипроизводных, полученных вышеописанным способом по изобретению, методом микробиологической трансформации с помощью клеток бактерий Nocardioides simplex Ac-1118 или Arthrobacter simplex ABT 21 и последующего выделения целевого продукта из культуральной жидкости.

Техническая задача в части получения 6α-метилпреднизолона (или его 11β-алканоилоксипроизводных) с использованием в качестве исходного (промежуточного соединения) полученного 6α-метилгидрокортизона или его 11β-алканоилоксипроизводных достигается получением 6α-метилпреднизолона или его 11β-алканоилоксипроизводных общей формулы (III)

где R¹=Н, или CF₃СО, или СН₃СО - группы,

из 6α-метилгидрокортизона или его 11β-алканоилоксипроизводных общей формулы (I)

где R¹=H, или CF₃CO, или СН₃СО - группы,

методом микробиологического 1,2-дегидрирования, например, в присутствии полимерных синтетических или природных соединений (включая химически модифицированные природные полимеры) с использованием концентраций исходного субстрата до 15 г/л и выделение целевого продукта из культуральной жидкости.

Таким образом, сущность заявленной группы изобретений, в которую входят получение 6α-метилгидрокортизона и его 11β-алканоилоксипроизводных и далее 6α-метилпреднизолона (или его 11β-алканоилоксипроизводных) с их использованием заключается в том, что гидрокортизон (или его 21-ацилоксипроизводное) сначала подвергают защите 11β,- 17α- и 21- гидроксильных групп, затем метиленированию положения С₆, восстановлению 6-метиленовой группы, удалению защитных группировок полностью или частично с последующим проведением микробиологической реакции 1,2-дегидрирования.

С целью повышения выхода и упрощения процесса защищенный по 11β,- 17α- и 21- гидроксильным группам гидрокортизон подвергают метиленированию положения С₆ и далее восстановлению 6-метиленовой группы в 6α-метильную, которое проводят до или после удаления защитных группировок полностью или частично.

При этом защиту гидроксильных групп проводят поэтапно образованием 17α,20;20,21-бисметилендиоксипроизводного и последующей этерификацией 11β-гидроксила, а удаление защитных группировок осуществляют поэтапно: сначала 17α,20;20,21-бисметилендиокси-защиты химическим методом с последующим химическим сольволизом 11β-алканоилокси-защиты в оптимальных условиях или наоборот.

Кроме того, 6-метиленирование может быть осуществлено с применением реактива Вильсмейера или методом конденсации с формальдегидом или его производным.

Кроме того, удаление защитных групп может быть проведено поэтапно удалением 17α,20;20,21-бисметилендиокси-защиты химическим путем, а защиты 11β-гидроксильной группы (например, CF₃СО- и СН₃СО - группы) микробиологическим дезацилированием или химическим сольволизом (например, CF₃СО - группы).

Кроме того, микробиологическое дезацилирование осуществляют с использованием в качестве биокатализатора клеток бактерий Agromyces mediolanus BKM Ac-1388 или Nocardioides sp. ABT 13.

Кроме того, микробиологическое дезацилирование может быть проведено после восстановления 6-метиленовой группы в 6-метильную.

Кроме того, проведение последующего 1,2-дегидрирования с целью получения 6α-метилпреднизолона или его 11β-алканоилоксипроизводных может быть осуществлено микробиологически с применением клеток бактерий Nocardioides simplex Ac-1118 или Arthrobacter simplex ABT 21. Проведение 1,2-дегидрирования осуществляют с использованием отмытых клеток бактерий Nocardioides simplex Ac-1118 или Arthrobacter simplex ABT 21 в присутствии циклического олигомера глюкозы β-циклодектрина.

Кроме того, получение 6α-метилпреднизолона (III, R¹=H) может быть проведено 1,2-дегидрированием с применением клеток бактерий Arthrobacter simplex ABT 21 в присутствии полимерного материала, например, N-винилкапролактама или его сополимера с виниловым спиртом.

Кроме того, микробиологическое дезацилирование может быть проведено после микробиологического 1,2-дегидрирования.

Кроме того, получение 6α-метилпреднизолона (III, R¹=H) может быть проведено 1,2-дегидрированием 11β-алканоилоксипроизводных 6α-метилгидрокортизона (II, R¹=CF₃СО или СН₃СО) комбинацией микробиологических процессов дегидрирования и дезацилирования с использованием концентраций исходного субстрата до 12, 5 г/л с выделением или без выделения промежуточного 11β-алканоилоксипроизводного 6α-метилпреднизолона (III, R¹=CF₃СО или СН₃СО - группы).

Преимущества заявляемого способа состоят в следующем:

- проведение защиты всех гидроксильных групп;

- отсутствие необходимости использования многократной кристаллизации основного продукта или хроматографирования с целью его очистки, так как удаление 17α,20;20,21-бисметилендиокси-защиты может быть осуществлено до удаления защиты 11β-гидроксильной группы, что приводит к незначительному появлению побочных соединений;

- значительно сокращаются потери основного продукта;

- общий выход 6-метилгидрокортизона из гидрокортизона составляет 68%.

Получение 6α-метилгидрокортизона и его 11β-алканоилоксипроизводных общей формулы (I) осуществляется по схеме 4.

Получение 6α-метилпреднизолона и его 11β-алканоилоксипроизводных общей формулы (III) осуществляется по схеме 5.

Ниже приводится в качестве примера подробное описание сущности изобретения. Гидрокортизон (11β,17α,21 - тригидроксипрегн-4-ен-3,20-дион) или его 21-ацилоксипроизводное общей формулы (II)

где R=H или R=Acyl,

подвергают последовательной защите 11β,-17α- и 21- гидроксильных групп сначала путем введения 17α,20;20,21-бисметилендиокси-защиты - защиты диоксиацетоновой боковой цепи (17α- и 21-гидроксильных групп) с образованием 17α,20;20,21-бисметилендиоксипроизводного (IV) - и последующей алканоилокси-защиты 11β-гидроксильной группы с образованием 11β-алканоилокси-замещенного (V). Полученный с выходом до 98,5% 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-алканоилоксигидрокортизон (V) подвергают енолизации Δ⁴-3-кетосистемы (с выделением продукта енолизации VI или in situ), например, действием каталитического количества п-толуолсульфокислоты и взаимодействию с реактивом Вильсмейера с образованием формильного производного (VII) с последующим превращением его в 6-метиленовое производное (VIII) или конденсации с производным формальдегида с образованием 6-метиленпроизводного (VIII), который далее превращают в 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-алканоилокси-6α-метилгидрокортизон (IX). Затем удалением 17α,20;20,21-бисметилендиокси-защиты химическим путем и последующим химическим или микробиологическим депротекционированием 11β-алканоилоксигруппы соединения (IX) с применением дезацилирующей культуры (предпочтительно Agromyces mediolanus BKM Ac-1388 или Nocardioides sp. ABT 13) и введением 1,2-двойной связи методом микробиологического дегидрирования культурой (предпочтительно клеток бактерий Nocardioides simplex Ac-1118 или Arthrobacter simplex ABT 21) получают 6α-метилпреднизолон (III). Депротекционирование 11β-алканоилоксигруппы может быть реализовано после введения 1,2-двойной связи в соединение (I). Депротекционирование 11β-алканоилоксигруппы может быть проведено одновременно с введением 1,2-двойной связи в соединение (I). Могут быть использованы как растущие, так и покоящиеся клетки культуры Agromyces mediolanus BKM Ac-1388 или Nocardioides sp. ABT 13, при этом нагрузка исходного субстрата составляет до 12,5 г/л, а продолжительность ферментации - от 6 до 24 часов. Нагрузка субстрата на стадии дегидрирования составляет до 15 г/л, продолжительность ферментации - от 6 до 24 часов.

Выделение 6α-метилгидрокортизона из культуральной жидкости осуществляют традиционной экстракцией несмешивающимся с водой растворителем или экстракцией стероида из пасты биомассы любым подходящим растворителем после ее предварительного отделения от водной фазы. Для извлечения стероида может быть также применен сорбционный способ извлечения. Выход 6α-метилгидрокортизона на стадии микробиологического дезацилирования составляет 96-98%.

Выделение 6α-метилпреднизолона и его 11β-алканоилоксипроизводных из культуральной жидкости осуществляют экстракцией из культуральной жидкости несмешивающимся с водой растворителем или сорбционным способом извлечения. Выход 6α-метилпреднизолона или его 11β-алканоилоксипроизводных на стадии микробиологического 1,2-дегидрирования составляет 98,5-99%.

Получают целевой продукт с выходом на стадиях биотрансформации до 97% суммарно.

Общий выход 6α-метилпреднизолона из гидрокортизона или его 21-ацилоксипроизводного составляет от 52 до 67% в зависимости от использованного варианта защиты 11β-гидроксильной группы и метода метиленирования.

Полученный в соответствии с предлагаемым способом 6α-метилгидрокортизон может быть использован не только как исходный субстрат для дальнейшего превращения в 6α-метилпреднизолон, а также как самостоятельный лекарственный препарат в виде 21-эфиров [J. Am. Chem. Soc., 1956, 78(23), 6213-6214; US 4912098, 27.03.1990].

Заявленная группа изобретений иллюстрируется следующими примерами, не ограничивающими ее.

Образование бисметилендиокси-защиты диоксиацетоновой боковой цепи молекулы гидрокортизона или его 21-ацилоксипроизводного проводят с использованием минимально необходимого количества формальдегида (не менее 2 молей на 1 моль стероида) и неполярного растворителя в присутствии кислого катализатора.

В качестве донора формальдегида при осуществлении изобретения - способа получения 6α-метилгидрокортизона и его 11β-алканоилоксипроизводных - могут быть использованы полимерные соединения формальдегида (формалин, параформ, триоксан и т.п.).

В качестве неполярного растворителя при осуществлении изобретения - способа получения 6α-метилгидрокортизона и его 11β-алканоилоксипроизводных - используют, например, хлорированные углеводороды (хлористый метилен, дихлорэтан, хлороформ и т.п.), ароматические углеводороды (например, бензол, толуол и т.п.).

В качестве кислого катализатора могут быть использованы минеральные кислоты (предпочтительно серная кислота).

Ацилирование свободной гидроксильной группы при С₁₁ проводят с использованием минимально необходимого количества ангидрида (или хлорангидрида) карбоновой кислоты (не менее 1 моля на 1 моль стероида) в безводных условиях в апротонном растворителе.

В качестве апротонного растворителя при осуществлении изобретения - способа получения 6α-метилгидрокортизона и его 11β-алканоилоксипроизводных - используют, например, хлорированные углеводороды (хлористый метилен, дихлорэтан, хлороформ и т.п.), диалкилкетоны (например, ацетон, метилэтилкетон), циклические эфиры (например, тетрагидрофуран, диоксан).

В качестве производного формальдегида при получении 6-метиленпроизводных (как промежуточных продуктов при получении 6α-метилгидрокортизона и его 11β-алканоилоксипроизводных) используют диалкилацетали формальдегида (например, метилаль, диэтилацеталь и т.п.), реагенты Манниха, полученные при взаимодействии формальдегида и органического основания (например, метиламин, диметиламин, N-метиланилин и т.п.).

В качестве восстановителей в реакции восстановления 6-метиленпроизводных в 6α-метилпроизводные в заявленном изобретении используют, например, борогидрид натрия, циклогексен и другие традиционно используемые восстановители, а также восстановление осуществляют гидрированием в присутствии традиционно используемых катализаторов, например палладия, адсорбированного на угле (палладиевый катализатор) и другие.

В качестве среды для проведения реакции восстановления могут быть использованы полярные растворители, такие как низшие карбоновые кислоты (например, уксусная кислота), алифатические спирты (например, метанол, этанол) или их эфиры (например, этилацетат).

Для удаления 17α,20;20,21-бисметилендиокси-защиты при осуществлении изобретения - способа получения 6α-метилгидрокортизона и его 11β-алканоилоксипроизводных - используют, например, минеральные кислоты (предпочтительно галоидоводородные, в частности соляную или фтористоводородную) в среде низшей карбоновой кислоты (муравьиная, уксусная и т.п.).

Удаление защиты 11β-гидроксильной группы (например, трифторацетильной) может быть реализовано химическим методом (сольволизом) или (например, ацильной или трифторацетильной) проведено микробиологическим методом.

Микробиологическое дезацилирование может быть реализовано как растущими, так и покоящимися клетками бактерий Agromyces mediolanus BKM.Ас-1388 (syn. Corynebacterium mediolanus) или Nocardioides Sp. АВТ 13.

Микробиологическое 1,2-дегидрирование может быть осуществлено покоящимися (отмытыми) клетками бактерий рода Nocardioides, конкретно N. simplex Ac-1118, или Arthrobacter simplex ABT 21.

Микробиологическое дезацилирование и микробиологическое 1,2-дегидрирование могут быть осуществлены одновременно смесью бактерий N. simplex Ac-1118 (или Arthrobacter simplex ABT 21) и A. mediolanus BKM Ac-1388 (или Nocardioides. sp.ABT 13).

Пример 1. Получение 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-гидроксипрегн-4-ен-3-она (IV).

Вариант 1.

К 290 г раствора 35 г формальдегида в 60%-ной серной кислоте добавляют 100 г гидрокортизона (IIa) и 2 л дихлорэтана при температуре 10-15°С. Реакционную массу перемешивают в течение 45 минут, слои разделяют. Органический слой промывают водой и 5% раствором бикарбоната натрия до рН 7. Растворитель упаривают досуха. Остаток растирают в метаноле, осадок отфильтровывают. Получают 103,1 г 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-гидрокси-прегн-4-ен-3-она (IV) с выходом 92,4% и т.пл. 209-210°С.

Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 1.11 с (3Н, 18-СН₃), 1.43 с (3Н, 19-СН₃), 3.96 д, 3.99 д (АВ, 2Н, 21-СН₂, J=9.1), 4.45 кв (1Н, 11-H, J=3.0 Гц), 5.01 с (1Н, OCH₂O), 5.01 с (1Н, ОСН₂О), 5.03 с (1Н, OCH₂O), 5.20 с (1Н, OCH₂O), 5.66 д (1Н, 4-Н, J=1.3 Гц).

Вариант 2.

К раствору 0,5 г формальдегида в 70% серной кислоте добавляют 1 г 21-ацетата гидрокортизона (IIb) и 50 мл толуола. Реакционную массу перемешивают при комнатной температуре. По окончании реакции реакционную массу обрабатывают аналогично варианту 1. Получают 0,86 г соединения IV с выходом 86% и т.пл. 206-208°С.

Пример 2. Получение 11β-трифторацетокси-17α,20;20,24-бисметилендиокси-прегн-4-ен-3-она (Va).

К суспензии 4,6 г 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-гидрокси-прегн-4-ен-3-она (IV) в 46 мл безводного ацетона при температуре не выше +5°С добавляют 4,6 мл триэтиламина и 2,73 мл трифторуксусного ангидрида. Реакционную массу перемешивают 30 минут при этой же температуре и выливают в 165 мл воды. Осадок отфильтровывают, промывают водой до рН 7.

Получают 5,6 г 11β-трифторацетокси-17α,20;20,21-бисметилендиокси-прегн-4-ен-3-она (Vа) с выходом 98,5% и т.пл. 165-167°С.

Спектр ЯМР ¹H (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 0.97 с (3Н, 18-СН₃), 1.27 с (3Н, 19-СН₃), 3.97 с (2Н, 21-СН₂), 4.99 с (2Н, ОСН₂O), 5.01 с (1Н, ОСН₂О), 5.15 с (1Н, ОСН₂О), 5.65 кв (1Н, 11-Н, J=2.8 Гц), 5.71 д (1Н, 4-Н, J=1.3 Гц).

Пример 3. Получение 11β-ацетокси-17α,20;20,21-бисметилендиокси-прегн-4-ен-3-она (Vb).

К раствору 10 г 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-гидрокси-прегн-4-ен-3-она (IV) в 140 мл хлористого метилена добавляют при перемешивании 7 мл триэтиламина, 20 мл уксусного ангидрида и 0.6 г диметиламинопиридина. Реакционную массу кипятят в течение 10 часов. Затем реакционную массу охлаждают и медленно выливают в раствор аммиака (50 мл 25%-ного аммиака в 500 мл воды) и перемешивают в течение 1 часа. Органический слой отделяют, водный экстрагируют хлористым метиленом. Объединенные органические слои сушат Na₂SO₄, обрабатывают осветляющим углем и упаривают. Полученный остаток перекристаллизовывают из метанола. Получают 10,64 г 11β-ацетокси-17α,20;20,21-бисметилендиокси-прегн-4-ен-3-она (Vb) с выходом 96.4 % и т.пл.158-160°С.

Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 0.99 с (3Н, 18-СН₃), 1.26 с (3Н, 19-СН₃), 2.03 с (3Н, СН₃С(О)), 3.95 д, 3.97 д (АВ, 2Н, 21-СН₂, J=9.3), 4.97 с (1Н, ОСН₂O), 4.99 дд (2Н, ОСН₂O, J=0.8, J=7.7), 5.16 с (1Н, ОСН₂O), 5.45 кв (1Н, 11-Н, J=2.9), 5.67 д (1Н, 4-Н, J=1.3).

Пример 4. Получение 3-метокси-17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-трифторацетокси-прегна-3,5-диена (VIa).

К суспензии 5 г 11β-трифторацетокси-17α,20;20,21-бисметилендиокси-прегн-4-ен-3-она (Va) в 20 мл безводного метанола добавляют 2,77 мл метилортоформиата и 50 мг сульфосалициловой кислоты. Реакционную массу выдерживают в течение 2 часов при комнатной температуре, охлаждают до температуры 5-10°С и нейтрализуют триэтиламином. После выдержки при температуре -10°С в течение 2 часов осадок отфильтровывают, промывают охлажденным 0,5% раствором триэтиламина в метаноле. Из маточного раствора после охлаждения отфильтровывают дополнительное количество осадка.

Всего получают 5,01 г 17α,20;20,21-бисметилендиокси-3-метокси-11β-трифторацетокси-прегна-3,5-диена (VIа) с выходом 97,7% и т.пл. 142-144°С.

Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 0.96 с (3Н, 18-СН₃), 1.02 с (3Н, 19-СН₃), 3.56 с (3Н, ОСН₃), 3.98 с (2Н, 21-СН₂), 5.00 с (1Н, ОСН₂O), 5.01 дд (2Н, ОСН₂O, J=1.0, J=7.1), 5.07 д (1Н, 4-Н, J=1.5), 5.14 т (1Н, 6-Н, J=3.5), 5.15 с (1Н, OCH₂O), 5.69 kb (1Н, 11-H, J=3.3).

Пример 5. Получение 3-метокси-17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-ацетоксипрегна-3,5-диена (VIb).

К раствору 0,6 г 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-ацетоксипрегн-4-ен-3-она (Vb) в 3 мл безводного метанола добавляют 0,4 мл метилортоформиата и 7 мг безводной п-толуолсульфокислоты. Реакционную массу выдерживают в течение 15 минут при комнатной температуре, охлаждают до температуры 5-10°С и нейтрализуют 0,1 мл 10% раствора триэтиламина в метаноле. Затем к реакционной массе добавляют 10 мл воды, суспензию охлаждают до 0-5°С и выдерживают в течение 1 часа. Осадок отфильтровывают, промывают водой.

Получают 0,61 г 3-метокси-17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-ацетоксипрегна-3,5-диена (VIb) с выходом 98,5% и т.пл. 180-182°С.

Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 0.98 с (3Н, 18-СН₃), 1.02 с (3Н, 19-СН₃), 2.02 с (3Н, СН₃С(О)), 3.55 с (3Н, ОСН₃), 3.96 д, 3.98 д (АВ, 2Н, 21-СН₂, J=9.1), 4.98 с (1Н, ОСН₂O), 5.00 с (1Н, ОСН₂O), 5.01 с (1Н, ОСН₂O), 5.07 с (1Н, 4-Н), 5.13 т (1Н, 6-Н, J=3.5), 5.17 с (1Н, ОСН₂O), 5.48 кв (1Н, 11-H, J = 3.1).

Пример 6. Получение 3-метокси-17α,20;20,21-бисметилендиокси- 11β-трифторацетокси-6-формилпрегна-3,5-диена (VIIа).

К раствору реактива Вильсмейера, полученного из 5,8 мл диметилформамида и 3,9 мл оксихлорида фосфора, в 58 мл дихлорэтана присыпают 10 г 17α,20;20,21-бисметилендиокси-3-метокси-11β-трифторацетоксипрегна-3,5-диена (VIа) при температуре 15°С. Через 30 минут выдержки к реакционной массе при этой же температуре добавляют 120 мл раствора AcONa в водном метаноле (соотношение AcONa : вода : метанол=0,73:0,7:5) и 250 мл воды. Через 10 минут реакционную массу разбавляют этилацетатом, органический слой отделяют, промывают водой и 5% раствором бикарбоната натрия. Растворитель упаривают досуха. Осадок фильтруют из смеси метанол-вода (1:1).

Получают 9,2 г 6-формил-замещенного 3-метокси-17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-трифторацетоксипрегна-3,5-диена (VIIа) с выходом 87,3% и т.пл 170-172°С.

Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 0.96 с (3Н, 18-СН₃), 1.13 с (3Н, 19-СН₃), 3.69 с (3Н, ОСН₃), 3.97 с (2Н, 21-СН₂), 4.99 с (2Н, ОСН₂O), 5.01 с (1Н, ОСН₂O), 5.15 с (1Н, ОСН₂O), 5.65 кв (1Н, 11-Н, J=3.2), 6.30 с (1Н, 4-Н), 10.24 с (1Н, СНО).

Пример 7. Получение 3-метокси-17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-ацетокси-6-формилпрегна-3,5-диена (VIIb).

К раствору реактива Вильсмейера, полученного из 0,15 мл диметилформамида и 0,1 мл оксихлорида фосфора, в 1,5 мл дихлорэтана, охлажденному до температуры 0-5°С, добавляют раствор 0,47 г 3-метокси-17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-ацетоксипрегна-3,5-диена (VIb) в 4 мл 0,5% раствора триэтиламина в дихлорэтане. Через 30 минут выдержки реакционную массу добавляют медленно при интенсивном перемешивании к 10% раствору KOH в метаноле. Массу перемешивают в течение 5-10 минут и разбавляют 50 мл воды. Органический слой отделяют, водный слой экстрагируют дихлорэтаном. Объединенный экстракт промывают водой до рН 7. Растворитель упаривают в вакууме досуха. К остатку добавляют 3 мл метанола. Суспензию охлаждают, осадок отфильтровывают, промывают метанолом. Из маточного раствора после концентрирования и охлаждения отфильтровывают дополнительное количество осадка.

Получают 0,42 г 6-формил-замещенного 3-метокси-17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-ацетоксипрегна-3,5-диена (VIIb) с выходом 84,2% и т.пл. 267-268°С.

Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 0.97 с (3Н, 18-СН₃), 1.12 с (3Н, 19-СН₃), 2.03 с (3Н, СН₃С(О)), 3.68 с (3Н, ОСН₃), 3.96 д, 3.98 д (АВ, 2Н, 21-СН₂, J=9.1), 4.97 с (1Н, ОСН₂O), 4.99 с (1Н, ОСН₂O), 5.00 с (1Н, ОСН₂O), 5.16 с (1Н, ОСН₂O), 5.46 кв (1Н, 11-Н, J=3.0), 6.29 с (1Н, 4-Н), 10.24 с (1Н, СНО).

Пример 8. Получение 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-трифторацетокси-6-метилен-прегн-4-ен-3-она (VIIIа).

Вариант 1.

К смеси 10 г NaOAc, 150 мл хлороформа и 150 мл метилаля добавляют 14 мл POCl₃. Смесь кипятят в атмосфере аргона при перемешивании 1 час. Затем добавляют 10 г 3-метокси-17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-трифторацетокси-прегна-3,5-диена (VIа) и по каплям в течение 1-1,5 ч еще 14 мл POCl₃ и кипячение продолжают. После завершения реакции (4-6 часов) кипячение прекращают, реакционную смесь охлаждают и медленно выливают в раствор 160 мл 25 % NH₃ в 1 л воды со льдом. Интенсивно перемешивают в течение 1 часа. Водный слой отделяют, к органическому слою добавляют 100 мл 5 % раствора HCl и интенсивно перемешивают 1 час. Органический слой отделяют, промывают дважды водой, растворитель упаривают. После кристаллизации получают 8,5 г 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-трифторацетокси-6-метилен-прегн-4-ен-3-она (VIIIа) с выходом 85,3% и т.пл. 176-178°С.

Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 0.96 с (3Н, 18-СН₃), 1.17 с (3Н, 19-СН₃), 3.97 с (2Н, 21-СН₂), 5.00 м (1Н, 6-С=СН₂ и 2Н, ОСН₂O), 5.02 с (1Н, ОСН₂O), 5.08 т (1Н, 6-С=СН₂, J=1.9), 5.15 с (1Н, ОСН₂O), 5.66 кв (1Н, 11-Н, J=2.9), 5.86 с (1Н, 4-Н).

Вариант 2.

К раствору 10 г 3-метокси-17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-трифторацетокси-прегна-3,5-диена (VIа) в смеси 75 мл тетрагидрофурана и 10 мл этанола добавляют при перемешивании и комнатной температуре 4,3 мл N-метиланилина, 260 мг п-толуолсульфокислоты и 3,6 мл водного 37%-ного раствора формальдегида. Реакционную массу выдерживают в течение 1 часа, затем добавляют 25 мл концентрированной соляной кислоты и перемешивают 30 мин. Смесь экстрагируют хлористым метиленом, органический слой промывают водой до нейтральной реакции, растворитель упаривают. После кристаллизации получают 9,4 г 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-трифторацетокси-6-метилен-прегн-4-ен-3-она (VIIIа) с выходом 92% и т.пл. 166-168°С.

Вариант 3.

В условиях примера 8, вар.1, из 514 мг 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-трифторацетоксипрегн-4-ен-3-она (Vа) получают 380 мг 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-трифторацетокси-6-метиленпрегн-4-ен-3-она (VIIIа) с выходом 74% и т. пл. 158-160°С, после перекристаллизации из этанола т.пл. 178-180°С.

Вариант 4.

К раствору 1,03 г 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-трифторацетоксипрегн-4-ен-3-она (Vа) в 5,6 мл тетрагидрофурана при перемешивании добавляют 0,27 мл N-метиланилина, 0,2-0,3 мл 37%-ного водного раствора формальдегида и 10 мг трихлоруксусной кислоты. Реакционную смесь нагревают до 40-45°С и выдерживают при перемешивании 6 часов. После охлаждения добавляют 2,5 мл концентрированной соляной кислоты и перемешивают 30 мин. Смесь экстрагируют хлористым метиленом, органический слой промывают водой до нейтральной реакции, сушат сульфатом натрия. После упаривания растворителей остаток хроматографируют на силикагеле смесью гексана и этилацетата. Получают 0.931 г 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-трифторацетокси-6-метиленпрегн-4-ен-3-она (VIIIа) с выходом 90,8% и т.пл.168-170°С.

Пример 9. Получение 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-ацетокси-6-метилен-прегн-4-ен-3-она (VIIIb).

Вариант 1.

В условиях примера 8, вар. 1, из 10 г 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-ацетоксипрегн-4-ен-3-она (Vb) получают 7,7 г 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-ацетокси-6-метиленпрегн-4-ен-3-она (VIIIb) с выходом 75% и т. пл. 190-192°С.

Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 0.98 с (3Н, 18-СН₃), 1.17 с (3Н, 19-СН₃), 2.03 с (3Н, СН₃С(О)), 3.96 д, 3.98 д (АВ, 2Н, 21-СН₂, J=9.4), 4.97 т (1Н, 6-С=СН₂, J=1.9), 4.98 с (1Н, ОСН₂O), 4.99 с (1Н, (OCH₂O)), 5.01 с (1Н, OCH₂О), 5.05 т (1Н, 6-C=СН₂, J=1.9), 5.17 с (1Н, ОСН₂O), 5.48 кв (1Н, 11-Н, J=2.8), 5.84 с (1Н, 4-Н).

Вариант 2.

В условиях примера 8, вар. 2, из 9 г 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-ацетоксипрегн-4-ен-3-она (Vb) получают 8,2 г 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-ацетокси-6-метиленпрегн-4-ен-3-она (VIII b) с выходом 88.7% и т. пл. 194-195°С.

Пример 10. Получение 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-гидрокси-6-метиленпрегн-4-ен-3-она (VIII с).

Вариант 1.

К суспензии 5 г 3-метокси-17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-трифторацетокси-6-формилпрегна-3,5-диена (VIIа) в 100 мл смеси метанола и хлористого метилена (1:1) добавляют порциями 0,5 г борогидрида натрия в течение 20 минут. Реакционную массу выдерживают при комнатной температуре в течение 15 минут. По окончании реакции восстановления формильной группы к реакционной массе добавляют по каплям 10% водный раствор соляной кислоты до рН 3. Массу перемешивают в течение 15 минут. Затем реакционную массу нейтрализуют 10% водным раствором NaOH и добавляют 50 мл воды. Слои разделяют, водный слой экстрагируют хлористым метиленом, затем объединенные органические экстракты промывают водой, осадок отфильтровывают, промывают водой. Растворитель упаривают досуха. Осадок отфильтровывают из метанола.

Получают 4,2 г 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-гидрокси-6-метиленпрегн-4-ен-3-она (VIIIс) с выходом 90,15% и т.пл. 220-223°С.

Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 1.10 с (3Н, 18-СН₃), 1,34 с (3Н, 19-СН₃), 3.97 д, 4.00 д (АВ, 2Н, 21-СН₂, J=9.1), 4.43 м (1Н, 11-Н), 4.95 т (1Н, 6-С=СН₂, J=2.0), 5.01 с (1Н, ОСН₂O), 5.02 с (1Н, ОСН₂O), 5.03 с (1Н, ОСН₂O), 5.05 т (1Н, 6-С=СН₂, J=2.0), 5.20 с (1Н, ОСН₂O), 5.84 с (1Н, 4-Н).

Вариант 2.

К раствору реактива Вильсмейера в 60 мл дихлорметана, полученного из 6 мл диметилформамида и 4 мл оксихлорида фосфора, добавляют раствор 10 г 3-метокси-17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-трифторацетокси-прегна-3,5-диена (VI а) в 30 мл дихлорметана. Реакционную смесь выдерживают при температуре 15°С в течение 1 часа, затем выливают в 150 мл раствора AcONa в водном метаноле при температуре 0°С.

После этого к смеси добавляют 120 мл метанола и 10% водный раствор NaOH до рН 9 и смесь выдерживают в течение 1,5 часов при комнатной температуре.

По окончании реакции гидролиза трифторацетокси-защиты к реакционной массе добавляют 1 г борогидрида натрия порциями в течение 20 минут, затем дают выдержку в течение 15 минут для завершения реакции восстановления формильной группы в оксиметильную.

По окончании реакции восстановления к реакционному раствору добавляют 10% раствор соляной кислоты до рН 3 и выдерживают в течение 30 минут при комнатной температуре.

По окончании реакции дегидратации реакционную массу нейтрализуют 10% водным раствором NaOH и разбавляют водой. Органический слой отделяют, водный слой экстрагируют дихлорметаном. Объединенные экстракты осветляют углем, растворитель упаривают до минимального объема, суспензию охлаждают, осадок отфильтровывают, промывают охлажденным метанолом.

Получают 6,5 г 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-гидрокси-6-метиленпрегн-4-ен-3-она (VIIIс) с выходом 80,3% и т.пл. 223-225°С.

Вариант 3.

К смеси 10 г NaOAc, 150 мл хлороформа и 150 мл метилаля добавляют 14 мл POCl₃. Смесь кипятят в атмосфере аргона при перемешивании 1 час. Затем добавляют 10 г 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-трифторацетокси-прегн-4-ен-3-она (Vа) и по каплям в течение 1-1,5 ч еще 14 мл POCl₃ и кипячение продолжают. После завершения реакции (4-6 часов) кипячение прекращают, реакционную смесь охлаждают и медленно выливают в раствор 160 мл 25%-ного NH₃ в 1 л воды со льдом. Интенсивно перемешивают в течение 1 часа. Водный слой отделяют, к органическому слою добавляют 100 мл 5%-ного раствора HCl и интенсивно перемешивают 1 час. Органический слой отделяют, промывают дважды водой, растворитель упаривают. Остаток растворяют в 80 мл смеси тетрагидрофуран-метанол, к полученному раствору при перемешивании по каплям добавляют раствор 2 г гидроксида калия в 4 мл воды. Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 часа, нейтрализуют 1 мл уксусной кислоты и выливают в 800 мл воды. Осадок отфильтровывают, промывают водой до рН 7. После перекристаллизации из метанола получают 6,4 г 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-гидрокси-6-метиленпрегн-4-ен-3-она (VIIIс) с выходом 78,8% и т. пл. 219-221°С.

Вариант 4.

К раствору 10 г 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-трифторацетокси-прегн-4-ен-3-она (Vа) в 75 мл тетрагидрофурана при перемешивании добавляют 10 мл этанола, 10 мл этилортоформиата и 260 мг п-толуолсульфокислоты и нагревают до 40°С. Реакционную массу выдерживают в течение 1 часа и при комнатной температуре добавляют 4,3 мл N-метиланилина и 3-6 мл водного 37%-ного раствора формальдегида. Реакционную массу выдерживают в течение 1 часа, затем добавляют 25 мл концентрированной соляной кислоты и перемешивают 30 мин. Смесь экстрагируют хлористым метиленом, органический слой промывают водой до нейтральной реакции, растворитель упаривают. Остаток растворяют в 80 мл смеси тетрагидрофуран-метанол, к полученному раствору при перемешивании по каплям добавляют раствор 2 г гидроксида калия в 4 мл воды. Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 часа, нейтрализуют 1 мл уксусной кислоты и выливают в 800 мл воды. Осадок отфильтровывают, промывают водой до рН 7. После перекристаллизации из метанола получают 6,8 г 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-гидрокси-6-метиленпрегн-4-ен-3-она (VIII с) с выходом 83,7% и т. пл. 222-224°С.

Пример 11. Получение 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-трифторацетокси-6-метилпрегн-4-ен-3-она (IXа).

К раствору 10 г 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-трифторацетокси-6-метиленпрегн-4-ен-3-она (VIII а) в 100 мл этанола и 100 мл уксусной кислоты добавляют 1,56 г палладиевого катализатора (Pd/C 5,4%), нагревают до кипения и добавляют 15 мл циклогексена. Реакционную смесь кипятят при перемешивании в течение 4 часов. Катализатор отфильтровывают и промывают горячим этанолом. Фильтрат выливают в 2 л дистиллированной воды и перемешивают 10 мин. Осадок отфильтровывают и промывают дистиллированной водой до рН 7. Получают 9,7 г 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-трифторацетокси-6-метилпрегн-4-ен-3-она (IX а) с выходом 96,6% и т. пл. 121-123°С.

Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 0.96 с (3Н, 18-СН₃), 1.07 д (3Н, 6-СН₃, J=6.3), 1.24 с (3Н, 19-СН₃), 3.97 с (2Н, 21-СН₂), 4.99 с (2Н, OCH₂O), 5.01 с (1Н, ОСН₂О), 5.16 с (1Н, ОСН₂O), 5.65 кв (1Н, 11-H, J=2.1), 5.73 с (1Н, 4-Н).

Пример 12. Получение 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-ацетокси-6-метилпрегн-4-ен-3-она (IXb).

В условиях примера 11 из 3 г 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-ацетокси-6-метиленпрегн-4-ен-3-она (VIII b) получают 2,9 г 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-ацетокси-6-метилпрегн-4-ен-3-она (IXb) с выходом 96,2%, т.пл. 132-134°С.

Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 0.98 с (3Н, 18-СН₃), 1.05 д (3Н, 6-СН₃, J=6.4), 1.23 с (3Н, 19-СН₃), 2.03 с (3Н, СН₃С(О)), 3.95 д, 3.97 д (АВ, 2Н, 21-СН₂, J=9.2), 4.97 с (1Н, ОСН₂O), 4.98 с (1Н, ОСН₂O), 5.00 с (1Н, ОСН₂O), 5.17 с (1Н, ОСН₂O), 5.46 кв (1H, 11-H, J=2.8 Гц), 5.71 д (1Н, 4-Н, J=1.4).

Пример 13. Получение 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-гидрокси-6-метилпрегн-4-ен-3-она (IXс).

В условиях примера 11 из 10 г 17α,20,20,21-бисметилендиокси-11β-гидрокси-6-метиленпрегн-4-ен-3-она (VIII с) получают 9,54 г 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-гидрокси-6-метилпрегн-4-ен-3-она (IXс) с выходом 95% и т. пл. 264-266°С.

Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 1.04 д (3Н, 6-СН₃, J=6.4), 1.11 с (3Н, 18-СН₃), 1.41 с (3Н, 19-СН₃), 3.96 д, 3.99 д (АВ, 2Н, 21-СН₂, J=9.2), 4.41 м (1Н, 11-H), 5.00 с (1Н, ОСН₂О), 5.01 с (1Н, ОСН₂O), 5.03 с (1Н, OCH₂О), 5.20 с (1Н, OCH₂O), 5.70 д (1Н, 4-Н, J=1.4).

Пример 14. Получение 11β-трифторацетокси-17α,21-дигидрокси-6-метиленпрегн-4-ен-3,20-диона (Ха).

Суспензию 5 г 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-трифторацетокси-6-метиленпрегн-4-ен-3-она (VIIIа) в 20 мл уксусной кислоты охлаждают до 0-2°С и добавляют при перемешивании 75 мл концентрированной соляной кислоты. Реакционную смесь выдерживают при данной температуре 30 мин и выливают в 300 мл воды. Смесь перемешивают 10 мин и экстрагируют 200 мл хлористого метилена. Объединенные органические слои промывают водой до рН 7, растворитель упаривают. Остаток хроматографируют на силикагеле смесью гексана и этилацетата. Получают 4 г 11β-трифторацетокси-17α,21-дигидрокси-6-метиленпрегн-4-ен-3,20-диона (Ха) с выходом 87% и т. пл. 119-121°С.

Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 0.80 с (3Н, 18-СН₃), 1.17 с (3Н, 19-СН₃), 4.27 дд, 4.64 дд (АВ, 2Н, 21-СН₂, J=4.5, J=19.9), 5.01 т (1Н, 6-C=CH₂, J=1.9), 5.10 т (1Н, 6-C=CH₂, J=1.9) 5.67 кв (1Н, 11-H, J=2.8 Гц), 5.87 с (1Н, 4-Н).

Пример 15. Получение 11β-ацетокси-17α,21-дигидрокси-6-метиленпрегн-4-ен-3,20-диона (Xb).

В условиях примера 14 из 2 г 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-ацетокси-6-метиленпрегн-4-ен-3-она (VIIIb) получают 1,6 г 11β-ацетокси-17α,21-дигидрокси-6-метиленпрегн-4-ен-3,20-диона (Xb) с выходом 88% и т. пл. 136-138°С.

Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 0.82 с (3Н, 18-СН₃), 1.25 с (3Н, 19-СН₃), 2.01 с (3Н, СН₃С(О)), 4.26 дд, 4.63 дд (АВ, 2Н, 21-CH₂, J=4.3, J=19.9), 4.98 т (1Н, 6-C=CH₂, J=1.9), 5.07 т (1Н, 6-С=СН₂, J=1.9), 5.48 кв (1Н, 11-H, J=2.8 Гц), 5.85 с (1Н, 4-Н).

Пример 16. Получение 11β,17α,21-тригидрокси-6-метиленпрегн-4-ен-3,20-диона (Xс).

В условиях примера 14 из 5 г 17α,20;20,21-бисметилендиокси-11β-гидрокси-6-метиленпрегн-4-ен-3-она (VIIIс) получают 3,3 г 11β,17α,21-тригидрокси-6-метиленпрегн-4-ен-3,20-диона (Xс) с выходом 73,4% и т. пл. 198-200°С.

Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 0.94 с (3Н, 18-СН₃), 1.34 с (3Н, 19-СН₃), 4.31 дд, 4.65 дд (АВ, 2Н, 21-СН₂, J=4.8, J=19.8), 4.50 м (1Н, 11-H), 4.97 т (1Н, 6-С=СН₂, J=1.9), 5.07 т (1Н, 6-С=СН₂, J=1.9), 5.85 с (1Н, 4-Н).

Пример 17. Получение 11β-трифторацетокси-17α,21-дигидрокси-6-метилпрегн-4-ен-3,20-диона (Ia).

Вариант 1.

В условиях примера 14 из 2 г 11β-трифторацетокси-17α,20;20,21-бисметилендиокси-6-метилпрегн-4-ен-3-она (IXа) получают 1,65 г 11β-трифторацетокси-17α,21-дигидрокси-6-метилпрегн-4-ен-3,20-диона (Iа) с выходом 89,8% и т. пл. 126-128°С.

Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 0.80 с (3Н, 18-СН₃), 1.07 д (3Н, 6-СН₃, J=6.3), 1.24 с (3Н, 19-СН₃), 4.26 дд, 4.63 дд (АВ, 2Н, 21-СН₂, J=4.5, J=19.9), 5.67 кв (1H, 11-H, J=2.8), 5.74 д (1H, 4-Н, J=1.5).

Вариант 2.

В условиях примера 11 из 3 г 11β-трифторацетокси-17α,21-дигидрокси-6-метиленпрегн-4-ен-3,20-диона (Xа) получают 2,9 г 11β-трифторацетокси-17α,21-дигидрокси-6-метилпрегн-4-ен-3,20-диона (Iа) с выходом 96,2% и т. пл. 130-132°С.

Пример 18. Получение 11β-ацетокси-17α,21-дигидрокси-6-метилпрегн-4-ен-3,20-диона (Ib).

Вариант 1.

В условиях примера 14 из 2 г 11β-ацетокси-17α,20;20,21-бисметилендиокси-6-метилпрегн-4-ен-3-она (IXb) получают 1,56 г 11β-ацетокси-17α,21-дигидрокси-6-метилпрегн-4-ен-3,20-диона (Ib) с выходом 86% и т.пл. 142-144°С.

Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 0.81 с (3Н, 18-СН₃), 1.06 д (3Н, 6-СН₃, J=6.4), 1.24 с (3Н, 19-СН₃), 2.00 с (3Н, СН₃С(О)), 4.25 дд, 4.63 дд (АВ, 2Н, 21-СН₂, J=4.9, J=20.0), 5.48 кв (1H, 11-H, J=2.8), 5.71 д (1H, 4-Н, J=1.4).

Вариант 2.

В условиях примера 11 из 1 г 11β-ацетокси-17α,21-дигидрокси-6-метиленпрегн-4-ен-3,20-диона (Xb) получают 0,97 г 11β-ацетокси-17α,21-дигидрокси-6-метилпрегн-4-ен-3,20-диона (Ib) с выходом 96,5% и т.пл. 146-148°С.

Пример 19. Получение 11β,17α,21-тригидрокси-6α-метилпрегн-4-ен-3,20-диона (6α-метилгидрокортизона Iс).

Вариант 1.

В условиях примера 11 из 1 г 11β,17α,21-тригидрокси-6-метиленпрегн-4-ен-3,20-диона (6-метиленгидрокортизона Хс) получают 0,9 г 6α-метилгидрокортизона (Iс) с выходом 90%, т.пл. 204-206°С.

Вариант 2.

Получение 6α-метилгидрокортизона (Iс) из 11β-трифторацетилокси-6α-метилгидрокортизона (Iа) осуществляют химическим сольволизом в условиях, аналогичных описанным в US 4330541, 18.05.1982. Для этого 1 г соединения (I а) перемешивают при комнатной температуре в смеси 20 мл метанола и 1 мл триэтиламина. По окончании реакции раствор нейтрализуют уксусной кислотой, концентрируют в вакууме, остаток выливают в 20 мл охлажденной воды. Осадок отфильтровывают, промывают водой, сушат. Получают 0,76 г соединения (Iс) с выходом 95,4% и т.пл.202-204°С.

Вариант 3.

Получение 6α-метилгидрокортизона (Iс) из 11β-ацетокси-6α-метилгидрокортизона (Ib) осуществляют путем дезацилирования бактериями Agromyces mediolanus ВКМ Ас-1388.

Клетки выращивают на среде следующего состава, г/л: дрожжевой автолизат 10,0; Na₂HPO₄ 0,3; КН₂PO₄ 4,3; вода дистиллированная, рН 5,4-5,6.

Выращивание инокулята проводят в колбах вместимостью 0,75 л, содержащих по 100 мл среды, на качалке (220 об/мин) при температуре 28-30°С в течение 24 час.

Выращивание трансформирующей культуры проводят в ферментере вместимостью 3 л, содержащем 1,6 л среды роста при подаче воздуха (0,5 л/мин), перемешивании (500 об/мин) и температуре 28°С. Среда роста содержит, г/л: дрожжевой автолизат 10,0; Na₂HPO₄ 0,3; КН₂PO₄ 4,3; воду дистиллированную, рН 5,4-5,6. Через 24 часа роста бактерий в ферментер вносят 20 г переосажденного 11β-ацетокси-6α-метилгидрокортизона (Ib).

Приготовление переосажденного 11β-ацетокси-6α-метилгидрокортизона (Ib). 20 г 11β-ацетокси-6α-метилгидрокортизона (Ib) растворяют в 100 мл ДМФ на кипящей водяной бане и сразу же выливают в 1000 мл смеси воды и измельченного льда при интенсивном перемешивании. Суспензию центрифугируют со скоростью 5000 g в течение 10 мин. Осадок суспендируют в 200 мл среды роста и вносят в ферментер для трансформации.

Проведение трансформации.

Трансформацию стероида проводят в условиях роста, добавляя субстрат (в концентрации 12,5 г/л) после 24 час роста клеток.

По окончании процесса трансформации 6α-метилгидрокортизон (Iс) извлекают экстракцией этилацетатом, кристаллизуют из гексана. Получают 14,23 г (95%) 6α-метилгидрокортизона.

Вариант 4.

В условиях варианта 3 из 11β-трифторацетилокси-6α-метилгидрокортизона (Ia) путем деацилирования бактериями A. mediolanus BKM Ас-1388 получают 6α-метилгидрокортизон (Iс).

Вариант 5.

Получение 6α-метилгидрокортизона (Iс) из 11β-ацетокси-6α-метилгидрокортизона (Ib) путем деацилирования бактериями Nocardioides sp.АВТ-13. Выращивание клеток и процесс трансформации осуществляют, как указано в условиях варианта 3.

Вариант 6.

В условиях варианта 3 из 11β-трифторацетилокси-6α-метилгидрокортизона (Ia) путем деацилирования бактериями Nocardioides sp.ABT 13 получают 6α-метилгидрокортизон (Iс).

Пример 20. Получение 6α-метиленгидрокортизона (Xс).

Вариант 1.

В условиях варианта 2 примера 19 из 11β-трифторацетилокси-6α-метиленгидрокортизона (Xа) получают 6α-метиленгидрокортизон (Xс).

Вариант 2.

Получение 6α-метиленгидрокортизона из 11β-ацетокси-6α-метиленгидрокортизона (Xb) осуществляют путем микробиологической трансформации с использованием бактерий A. mediolanus BKM Ас-1388 в условиях примера 19. Из 6,8 г 11β-ацетокси-6α-метиленгидрокортизона (Xb) получают 4,68 г 6α-метиленгидрокортизона с выходом 92%.

Пример 21. Получение 11β-трифторацетилокси-6α-метилпреднизолона (IIIа).

Для получения 11β-трифторацетилокси-6α-метилпреднизолона (IIIа) путем микробиологической трансформации 11β-трифторацетилокси-6α-метилгидрокортизона (Iа) используют бактерии Nocardioides simplex Ac-1118.

Клетки выращивают при температуре 28°С на качалке (220 об/мин) в течение 16-20 часов в колбах вместимостью 750 мл, содержащих по 100 мл среды следующего состава г/л: глюкоза 10, кукурузный экстракт 10/л, вода водопроводная, рН 7,0-7,2. В качестве индуктора 3-кетостероид-1,2-дегидрогеназы используют ацетат кортизона (150 мг/л), который вносят в виде спиртового раствора (при посеве или за 5 часов до окончания процесса выращивания клеток). Клетки отделяют от среды центрифугированием (5000 g в течение 15 мин), дважды промывают 0,01 М Na-фосфатным буфером и затем суспендируют в том же буфере. При этом концентрация клеток составляет 50 мг/мл. Суспензию используют в дальнейшей работе для проведения процесса 1,2-дегидрирования.

Трансформацию проводят отмытыми клетками в колбах Эрленмейера (750 мл), содержащих по 100 мл реакционной среды каждая, на качалке (200-220 об/мин) при температуре 28-30°С. Среда для трансформации содержит 0,01 М Na-фосфатный буфер (рН 7,2), 1 г/л клеток (вес сухой биомассы), 24 г/л β-циклодекстрина, 4 г/л 11β-трифторацетата 6α-метилгидрокортизона, растворенного в метаноле (80 мг/мл). Концентрация метанола в реакционной среде при этом составляет 5%.

По окончании процесса трансформации (через 24 часа) по данным ВЭЖХ анализа культуральная жидкость содержит 99% соединения (IIIа) и не более 1% непревращенного субстрата (Iа).

Продукт извлекают экстракцией этилацетатом, кристаллизуют из гексана. Получают 11β-трифторацетилокси-6α-метилпреднизолон (IIIa).

Циклодекстрин регенерируют. Степень регенерации не менее 90%.

Пример 22. Получение 11β-ацетокси-6α-метилпреднизолона (IIIb).

Для превращения 11β-ацетокси-6α-метилгидрокортизона (Ib) в 11β-ацетокси-6α-метилпреднизолон (IIIb) используют бактерии N. simplex Ac-1118.

Клетки выращивают, как указано в примере 21.

Трансформацию проводят отмытыми клетками в колбах Эрленмейера (750 мл), содержащих по 100 мл реакционной среды каждая, на качалке (200-220 об/мин) при температуре 28-30°С. Среда для трансформации содержит 0,01 М Na-фосфатный буфер, рН 7,2, 2 г/л клеток (вес сухой биомассы), 36 г/л β-циклодекстрина, 6 г/л 11β-ацетокси-6α-метилгидрокортизона (Ib), растворенного в метаноле (100 мг/мл). Концентрация метанола в реакционной среде при этом составляет 6%.

По окончании процесса трансформации по данным ВЭЖХ-анализа культуральная жидкость содержит не менее 99% 11β-ацетокси-6α-метилпреднизолона (IIIb) и не более 1% непревращенного субстрата (Ib).

Продукт извлекают экстракцией этилацетатом, кристаллизуют из гексана. Получают 11β-ацетокси-6α-метилпреднизолон (IIIb), т.пл 120-122°С.

Спектр ЯМР ¹Н (CDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 0.83 с (3Н, 18-СН₃), 1.12 д (3Н, 6-СН₃, J=6.2), 1.26 с (3Н, 19-СН₃), 2.06 с (3Н, СН₃С(О)), 4.24 дд, 4.62 дд (АВ, 2Н, 21-СН₂, J=3.2, J=20.0), 5.53 кв (1H, 11-H, J=2.8), 6.02 с (1H, 4-H), 6.26 дд (1Н, 2-H, J=1.3, J=10.2), 6.92 д (1H, 1-H, J=10.2).

Циклодекстрин регенерируют. Степень регенерации не менее 90%.

Пример 23. Получение 6α-метилпреднизолона (IIIс).

Вариант 1.

Для получения 6α-метилпреднизолона (IIIс) путем микробиологической трансформации 6α-метилгидрокортизона (Iс) используют бактерии Arthrobacter simplex АВТ21.

Клетки выращивают, как указано в примере 21.

Трансформацию проводят в колбах Эрленмейера (750 мл), содержащих 100 мл реакционной среды следующего состава: 0,01 М Na-фосфатный буфер, 3 г/л клеток (вес сухой биомассы), 1,5 г 6α-метилгидрокортизона, растворенного в 7 мл метанола, 9 г β-циклодекстрина. Концентрация субстрата в реакционной среде составляет 15 г/л.

Продолжительность процесса трансформации составляет 12-16 часов.

В конце трансформации культуральная жидкость содержит не менее 14,4 г/л (96,5 мол.%) 6α-метилпреднизолона и не более 2% исходного 6α-метилгидрокортизона.

Циклодекстрин регенерируют. Степень регенерации не менее 90%.

Вариант 2.

В условиях варианта 2 примера 19 из 11β-трифторацетилокси-6α-метилпреднизолона (IIIа) получают 6α-метилпреднизолон (IIIс) с выходом 95%.

Вариант 3.

Удаление 11β-трифторацетилоксигруппы у соединения (IIIа) с образованием 6α-метилпреднизолона (IIIс) осуществляют путем микробиологической трансформации с использованием бактерий A. mediolanus BKM Ac-1388.

Бактерии A. mediolanus выращивают на среде следующего состава, г/л: глюкоза 3,0; дрожжевой автолизат 10,0; K₂HPO₄ 1,71; Na₂HPO₄×12 Н₂О 4,57; NaCl 2,0, вода дистиллированная до 1000 мл, рН 7,0.

Выращивание клеток проводят в колбах Эрленмейера (0,75 л), содержащих по 100 мл среды каждая, на качалке (220 об/мин) при температуре 28-30°С. Оптическая плотность (λ=540 нм) при 20-кратном разбавлении составляет 0,3. По окончании роста клеточную массу отделяют от среды центрифугированием в асептических условиях. Из 100 мл культуральной жидкости получают 1,0-1,2 г влажной биомассы, которую используют для дезацилирования.

Отмытые клетки добавляют в культуральную жидкость, полученную, как описано в примере 21, и содержащую 11β-трифторацетилокси-6α-метилпреднизолон (IIIa) в концентрации 3,96 г/л; рН реакционной среды доводят до значения 7,5 и инкубируют на качалке (220 об/мин) при температуре 28-30°С в течение 24 часов. По окончании процесса трансформации по данным анализа в реакционной среде содержится 3,4 г/л (99%) 6α-метилпреднизолона (IIIс), 0,034 г/л (1%) 6α-метилгидрокортизона (Iс) и следы 11β-трифторацетилокси-6α-метилгидрокортизона (Ia).

Вариант 4.

Для получения 6α-метилпреднизолона (IIIс) из 11β-трифторацетилокси-6α-метилгидрокортизона (Iа) используют смесь бактерий N. simplex Ac-1118 и A. mediolanus ВКМ Ac-1388.

Клетки бактерий N. simplex Ac-1118 выращивают, как указано в примере 21.

Клетки бактерий A. mediolanus BKM Ac-1388 выращивают, как указано в варианте 3 примера 23.

Трансформацию проводят отмытыми клетками в колбах Эрленмейера (750 мл), содержащих по 100 мл реакционной среды каждая, на качалке (200-220 об/мин) при температуре 28-30°С в течение 36-40 часов. Среда трансформации содержит 0,01 М Na-фосфатный буфер (рН 7,2), 1 г/л клеток (вес сухой биомассы) N. simplex, 2 г/л клеток А. mediolanus, 50 г/л β-циклодекстрина, 6 г/л исходного субстрата (Iа), растворенного в метаноле (100 мг/мл). Концентрация метанола в реакционной среде при этом составляет 6%. По окончании процесса трансформации по данным анализа в реакционной среде содержится 5,4 г/л (99%) 6α-метилпреднизолона (IIIс), 0,049 г/л (1%) 6α-метилгидрокортизона (Iс) и следы 11β-трифторацетилокси-6α-метилгидрокортизона (Iа).

Вариант 5.

Для получения 6α-метилпреднизолона (IIIс) из 11β-ацетокси-6α-метилгидрокортизона (I b) используют смесь бактерий N. simplex Ac-1118 и A. mediolanus ВКМ Ac-1388.

Клетки бактерий N. simplex Ac-1118 выращивают, как указано в примере 21.

Клетки бактерий A. mediolanus BKM Ас-1388 выращивают, как указано в варианте 3 примера 23.

Трансформацию проводят отмытыми клетками в колбах Эрленмейера (750 мл), содержащих по 100 мл реакционной среды, на качалке (200-220 об/мин) при температуре 28-30°С в течение 44 часов. Среда трансформации содержит 0,01 М Na-фосфатный буфер (рН 7,2), 1 г/л клеток (вес сухой биомассы) N. simplex, 2 г/л клеток A. mediolanus, 24 г/л β-циклодекстрина, 4 г/л 11β-ацетокси-6α-метилгидрокортизона (I b), растворенного в метаноле (80 мг/мл). Концентрация метанола в реакционной среде при этом составляет 5%. По окончании процесса трансформации по данным анализа в реакционной среде содержится 3,52 г/л (98,5%) 6α-метилпреднизолона (III с), 1% 6α-метилгидрокортизона (Iс) и следы 11β-ацетокси-6α-метилгидрокортизона (Ib).

Вариант 6.

Для получения 6α-метилпреднизолона (IIIс) путем микробиологической трансформации 6α-метилгидрокортизона (Iс) используют бактерии Arthrobacter simplex АВТ21.

Клетки выращивают, как указано в примере 21.

Трансформацию проводят в колбах Эрленмейера (750 мл), содержащих по 100 мл реакционной среды следующего состава: 0,01 М Na-фосфатный буфер, 2,5 г поливинилкапролактама (М.м. 900000), 3 г/л клеток (вес сухой биомассы), 1,5 г 6α-метилгидрокортизона, растворенного в 7 мл метанола. Концентрация субстрата в реакционной среде составляет 15 г/л.

Продолжительность процесса трансформации составляет 15 часов.

В конце трансформации культуральная жидкость содержит не менее 14,6 г/л (98 мол.%) 6α-метилпреднизолона и не более 1,5% исходного 6α-метилгидрокортизона.

Поливинилкапролактам регенерируют. Степень регенерации не менее 90%.

Вариант 7.

Для получения 6α-метилпреднизолона (IIIс) путем микробиологической трансформации 6α-метилгидрокортизона (Iс) используют бактерии Arthrobacter simplex АВТ21.

Клетки выращивают, как указано в примере 21.

Трансформацию проводят в колбах Эрленмейера (750 мл), содержащих 100 мл реакционной среды следующего состава: 0,01 М Na-фосфатный буфер, 1,8 г сополимера N-винилкапролактама с виниловым спиртом (в соотношении 72:28), 3 г/л клеток (вес сухой биомассы), 1,5 г 6α-метилгидрокортизона, растворенного в 7 мл метанола. Концентрация субстрата в реакционной среде составляет 15 г/л.

Продолжительность процесса трансформации составляет 16 часов.

В конце трансформации культуральная жидкость содержит не менее 14,5 г/л (97,5 мол.%) 6α-метилпреднизолона и не более 2% исходного 6α-метилгидрокортизона.

Сополимер N-винилкапролактама с виниловым спиртом регенерируют. Степень регенерации не менее 90%.

Изобретение относится к улучшенным способам получения 6α-метилгидрокортизона или его 11β-алканоилоксипроизводных и 6α-метилпреднизолона или его 11β-алканоилоксипроизводных с использованием полученного 6α-метилгидрокортизона или его 11β-алканоилоксипроизводных. Получают 6α-метилгидрокортизон и его 11β-алканоилоксипроизводные способом, включающим предварительную защиту 11β,- 17α- и 21-гидроксильных групп гидрокортизона или его 21-ацилоксипроизводного поэтапно с образованием 17α,20;20,21-бисметилендиоксипроизводного (БМДО-защита диоксиацетоновой боковой цепи) и последующей этерификацией 11β-гидроксильной группы, метиленированием С₆ положения, восстановлением 6-метиленовой группы в 6α-метильную. Реакцией 1,2-дегидрирования 6α-метилгидрокортизона и его 11β-алканоилоксипроизводных путем микробиологической трансформации с помощью микробных клеток получают 6α-метилпреднизолон или его 11β-алканоилоксипроизводные. 2 н. и 15 з.п. ф-лы.

1. Способ получения 6α-метилгидрокортизона или его 11β-алканоилоксипроизводных общей формулы (I)

где R¹ - H, или CF₃СО, или СН₃СО - группы;
из гидрокортизона или его 21-ацилоксипроизводного общей формулы (II)

где R - H или Acyl,
включающий предварительную защиту 11β-, 17α- и 21-гидроксильных групп гидрокортизона или его 21-ацилоксипроизводного сначала путем бисметилендиокси-защиты диоксиацетоновой боковой цепи образованием 17α,20;20,21-бисметилендиоксипроизводного, затем алканоилокси-защиты 11β-гидроксильной группы образованием 11β-алканоилоксизамещенного; последующее С₆ метиленирование с образованием 6-метиленпроизводного, восстановление 6-метиленпроизводного в 6α-метилпроизводное, удаление защит гидроксильных групп химическим методом сольволиза и/или микробиологическим дезацилированием, при этом восстановление 6-метиленпроизводного в 6α-метилпроизводное осуществляют до или после удаления защит 11β,- 17α- и 21- гидроксильных групп всех или частично.

2. Способ получения 6α-метилгидрокортизона или его 11β-алканоилоксипроизводных по п.1, отличающийся тем, что 6-метиленирование осуществляют с применением реактива Вильсмейера или методом конденсации с формальдегидом или его производным.

3. Способ получения 6α-метилгидрокортизона (I, R¹ - H) по п.1, отличающийся тем, что удаление защитных групп проводят поэтапно удалением 17α,20;20,21-бисметилендиокси-защиты химическим путем, а защиты 11β-гидроксильной группы, такой, как CF₃СО- или СН₃СО-группы, микробиологическим дезацилированием или химическим сольволизом.

4. Способ получения 6α-метилгидрокортизона по п.3, отличающийся тем, что удаление защиты 11β-гидроксильной группы осуществляют с помощью бактерий Agromyces mediolanus BKM Ac-1388 или Nocardioides sp.АВТ13.

5. Способ получения 6α-метилгидрокортизона по п.4, отличающийся тем, что удаление защиты 11β-гидроксильной группы осуществляют в условиях роста трансформирующей культуры.

6. Способ получения 6α-метилгидрокортизона (I, R¹ - H) по п.1, отличающийся тем, что микробиологическое дезацилирование проводят после восстановления 6-метиленовой группы в 6α-метильную.

7. Способ получения 6α-метилпреднизолона или его 11β-алканоилоксипроизводных общей формулы (III)

где R¹ - Н, или CF₃СО, или СН₃СО - группы;
1,2-дегидрированием 6α-метилгидрокортизона или его 11β-алканоилоксипроизводных формулы (I), полученных способом по пп.1-6, последующей микробиологической трансформацией с помощью клеток бактерий Nocardioides simplex Ac-1118 или Arthrobacter simplex ABT 21 и дальнейшим выделением целевого продукта из культуральной жидкости.

8. Способ получения 6α-метилпреднизолона (III, R¹ - H) по п.7, отличающийся тем, что удаление эфирной защиты 11β-гидроксильной группы проводят после микробиологического 1,2-дегидрирования.

9. Способ получения 6α-метилпреднизолона или его 11β-алканоилоксипроизводных по п.7, отличающийся тем, что 1,2-дегидрирование проводят ферментативно с применением клеток бактерий Nocardioides simplex Ac-1118 или Arthrobacter simplex ABT 21 в присутствии циклического олигомера глюкозы β-циклодекстрина.

10. Способ получения 6α-метилпреднизолона или его 11β-алканоилоксипроизводных по п.9, отличающийся тем, что 1,2-дегидрирование осуществляют с использованием покоящихся клеток бактерий Nocardioides simplex Ac-1118 или Arthrobacter simplex ABT 21.

11. Способ получения 6α-метилпреднизолона по п.7, отличающийся тем, что микробиологическое дезацилирование проводят с помощью бактерий Agromyces mediolanus BKM Ac-1388 или Nocardioides sp.ABT 13.

12. Способ получения 6α-метилпреднизолона по п.11, отличающийся тем, что микробиологическое дезацилирование осуществляют с использованием покоящихся клеток трансформирующей культуры.

13. Способ получения 6α-метилпреднизолона (III, R¹ - H) по п.7, отличающийся тем, что микробиологическое дезацилирование и микробиологическое 1,2-дегидрирование осуществляют одновременно смесью бактерий Nocardioides simplex Ac-1118 (или Arthrobacter simplex ABT 21) и Agromyces mediolanus BKM Ac-1388 (или Nocardioides sp.ABT 13).

14. Способ получения 6α-метилпреднизолона по п.13, отличающийся тем, что одновременное дезацилирование и 1,2-дегидрирование проводят покоящимися клетками бактерий Nocardioides simplex Ac-1118 (или Arthrobacter simplex ABT 21) и Agromyces mediolanus BKM Ac-1388 (или Nocardioides sp.ABT 13).

15. Способ получения 6α-метилпреднизолона (III, R¹ - H) no п.7, отличающийся тем, что 1,2-дегидрирование 11β-алканоилоксипроизводных 6α-метилгидрокортизона (I, R¹ - CF₃CO или СН₃СО), полученных по одному из пп.1-6, проводят с использованием последовательности микробиологических процессов дегидрирования и дезацилирования с выделением или без выделения промежуточного 11β-алканоилоксипроизводного 6α-метилпреднизолона (III, R¹ - CF₃СО или СН₃СО-группы).

16. Способ получения 6α-метилпреднизолона (III, R¹ - H) по п.7, отличающийся тем, что 1,2-дегидрирование 11β-алканоилоксипроизводных 6α-метилгидрокортизона (I, R¹ - CF₃СО или СН₃СО), полученных по одному из пп.1-6, проводят с использованием последовательности микробиологических процессов дезацилирования и дегидрирования без выделения промежуточного 6α-метилгидрокортизона.

17. Способ получения 6α-метилпреднизолона (III, R¹ - H) по п.7, отличающийся тем, что 1,2-дегидрирование проводят ферментативно с применением клеток бактерий Arthrobacter simplex ABT 21 в присутствии N-винилкапролактама или его сополимера с виниловым спиртом.