СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 6α-МЕТИЛПРЕДНИЗОЛОНА И АППАРАТ ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Советский патент 1994 года по МПК C12P33/02 C12N11/00 C12M1/04 

Изобретение относится к технической микробиологии (биотехнологии), а именно к получению дегидропроизводных стероидных соединений с помощью иммобилизованных клеток в ферментере. Изобретение может быть использовано в микробиологической и фармацевтической промышленности.

Цель изобретения - ускорение процесса за счет повышения удельной активности клеток и улучшения аэрации системы.

Способ заключается в следующем.

Для получения 6 α-метилпреднизолона в реакторе с аэратором после выращивания клеток бактерий Arthrobacter globiformis 193 проводят иммобилизацию клеток в полиакриламидный гель, затем проводят трансформацию в неростовой среде (буферной) в две стадии, причем на первой стадии процесс осуществляют, используя гидрокортизон в качестве субстрата и индуктора, по окончании первой стадии процесса реакционную среду сливают, на второй стадии осуществляют трансформацию 6 α-метилгидрокортизона, по окончании процесса выделяют целевой продукт из реакционной среды. Из полученной по окончании первой стадии реакционной среды выделяют преднизолон, образовавшийся при трансформации гидрокортизона.

Следует отметить, что по сравнению с известным способом при выращивании бактерий специального индуктора не используют.

При суспендировании гидрокортизона в буферной среде с иммобилизованными клетками, во-первых, происходит образование преднизолона, во-вторых, индукция 3-кетостероид-1-ен-дегидрогеназы, в-третьих, снижение уровня эндогенных субстратов в клетке, способствующих протеканию побочного процесса 20 β-восстановления. Указанная цель достигается также тем, что способ осуществляют в аппарате, включающим емкость, аэратор и трубопроводы для подвода и отвода сжатого воздуха, емкость которого согласно изобретению снабжена циркуляционной трубой с турбиной осевого действия, а аэратор выполнен в виде раструба по ее оси.

На фиг.1 схематически изображен аппарат для осуществления способа.

Аппарат для получения 6 α-метил-преднизолона содержит емкость 1 с патрубком 2 для подвода газа и патрубком 3 для отвода отработанного газа, размещенную в емкости 1, циркуляционную трубу 4, прикрепленные к ее верхней части обечайку 5 в виде усеченного конуса, обращенного большим основанием вверх, и вертикальные радиально расположенные отбойные пластины 6, турбину 7 осевого действия, лопасти 8 которой размещены в нижней части циркуляционной трубы 4, и аэратор 9, подключенный к патрубку 2 для подвода газа. Аэратор 9 представляет собой вертикальную трубу 10, выходной участок которой имеет раструб 11 в виде усеченного конуса, обращенного большим основанием вверх и размещенного под турбиной 7 по ее оси, при этом указанное большее основание конуса раструба 11 расположено не ниже нижнего торца циркуляционной трубы 4, причем патрубки 2 и 3 для подвода и отвода газа снабжены управляемыми клапанами 12 и 13 соответственно для периодического повышения и понижения давления в емкости 1.

Аппарат работает следующим образом. Внесенную в емкость 1 реакционную смесь приводят в движение и перемешивают турбиной 7. Вследствие использования в циркуляционной трубе 4 турбины 7 осевого действия гранулы с иммобилизованными клетками равномерно распределяются по всему объему реакционной смеси, аэрация при этом осуществляется за счет частичного подсоса воздуха с поверхности фазового раздела жидкость-воздух. За содержанием растворенного кислорода в реакционной смеси постоянно осуществляют контроль с помощью датчика O₂. При снижении содержания растворенного О₂ в реакционной смеси ниже 80% насыщения открывают клапан 12, через который сжатый воздух поступает под турбину 7 с одновременным повышением давления воздуха в емкости 1 до значения 0,1-0,3 кг/см². Импульс воздуха, поступающий под турбину 7, вытесняет реакционную смесь из зоны ее действия, в связи с чем турбина 7 вращается в "холостом" режиме. Перемешивание реакционной смеси в емкости 1 временно прекращается, а отработанный воздух свободно выходит из реакционной смеси в наджикостную полость емкости 1. Далее клапан 12 закрывают и открывают клапан 13, через который избыток давления воздуха из наджидкостной полости емкости 1 сбрасывают в атмосферу. При необходимости цикл смены воздуха в аппарате повторяют.

Такое техническое решение позволяет поддерживать в аппарате высокий (не мене 80%) фон растворенного О₂ в месте с тем обеспечивать равномерное распределение гранул с иммобилизованными клетками и их перемешивание в реакционной смеси без образования плотной пены.

П р и м е р 1. Культуру А. globiformis 193 выращивают в колбах Эрленмейера объемом 750 мл на кукурузноглюкозной среде (глюкоза 1%, кукурузный экстракт 1%) при отсутствии индуктора 3-кетостероид-1-ен-дегидрогеназы. Культуру выращивают в течение 16 ч (конец логарифмической фазы роста) при перемешивании (200 об/мин) и температуре 29^оС. Клетки отделяют от среды центрифугированием (при 4500g), отмывают 0,01 М Nа-фосфатным буфером, рН 7,2 и готовят суспензию клеток, 100 мг клеток (сухой вес) в 6 мл (16,6 мг/мл). Включают клетки в 10%-ный полиакриламидный гель с 0,5%-ным содержанием сшивающего агента при температуре (-4^оС). Смесь (общий объем 20 мл) осторожно и тщательно перемешивают, гелеобразование начинается через 2 мин после смешивания реагентов. После этого полимеризационную камеру переносят в холодильник (-18^о) и выдерживают 10 мин до завершения процесса гелеобразования.

Образовавшийся блок геля с включенными в него клетками фрагментируют, продавливая через сито (1,25 мкм). Полученные гранулы (1,25 мкм) тщательно промывают стерильной водопроводной водой декантацией 5-8 раз. Получают около 40 мл гранул, содержащих 1,6 мг клеток мл^-1 гранул.

Трансформация гидрокортизона.

Непосредственно перед трансформацией готовят водную суспензию гидрокортизона (100 мг), обрабатывая ее ультразвуком в режиме 1,5 20 мин (МSE-110). Размер кристаллов при этом не превышает 10-15 мкм.

Трансформацию гидрокортизона иммобилизованными клетками A.globiformis проводят в периодически аэрируемых условиях в колбе на качалке при 180-200 об/мин, 29^оС. В колбу объемом 750 мл вносят 10 мл гранул, содержащих 16 мг клеток, 100 мг микрокристаллического гидрокортизона в 10 мл 0,01 М фосфатного буфера, рН 7,2, добавляют еще 90 мл буфера. Конечная концентрация клеток в реакционной смеси 0,16 мг/мл, гидрокортизона 1,0 мг/мл (соотношение субстрат-клетки = 6,25:1).

Анализ продуктов трансформации проводят методом тонкослойной хроматографии на пластинках силуфол UV-254. Разделение стероидов осуществляют в системе бензол-ацетон (3:1, об/об).

Трансформация завершается за 12 ч. По завершении процесса в реакционной среде обнаружено 96% преднизолона, 4% гидрокортизона.

Результаты превращения гидрокортизона в преднизолон представлены на фиг. 2 (кривая 1 - накопление преднизолона; кривая 2 - убыль гидрокортизона).

Следует отметить длительность периода индукции (4 ч), которая обусловлена биосинтезом 3-кетостероид-1-ен-дегидро- геназы (в присутствии хлорамфеникола появления активности как у свободных, так и иммобилизованных клеток не отмечается). После периода индукции отмечают накопление в среде преднизолона (появление активности). Вычисленная по линейному участку кинетической кривой удельная 3-кетостероид-1-ен-дегидрогеназная активность иммобилизованных клеток равна 50 нмоль мин^-1 мг^-1 клеток.

Гранулы отделяют от реакционной среды фильтрованием или декантацией промывают буферным раствором и используют для трансформации 6-α-метилгидрокортизона.

Трансформация 6 α-метилгидрокортизона.

В колбу Эрленмейера на 750 мл помещают 10 мл гранул геля с включенными в него клетками, 90 мл буфера рН 7,2 и 0,9 мл спиртового раствора 6 -метилгидрокортизона (50 мг/мл). Конечная концентрация субстрата 1 мг/мл. Трансформация проводят на качалке 180-200 об/мин при температуре 29^оС. Анализ продуктов трансформации проводят так же, как при превращении гидрокортизона.

Процесс завершается за 13 ч, при этом в реакционной среде содержит 94% 6 α-метилпреднизолона, 1% 6 α-метилгидрокортизона. Кинетика реакции представлена на фиг. 3. Вычисленная по линейному участку кинетической кривой удельная активность иммобилизованных клеток составляет 22 нмоль мин^-1 мг^-1 клеток.

Гранулы отделяют от реакционной среды фильтрованием или декантацией, промывают буферным раствором и используют для последующих трансформаций 6 α-метилгидрокортизона.

П р и м е р 2. Выращивание культуры. А.globiformis 193 проводят в условиях, описанных в примере 1. Отмытые от среды клетки используют для приготовления суспензии, концентрации 50 мг (сухой вес) мл^-1 в 0,01 М Nа-фосфатного буфера, рН 7,2.

Полученную бактериальную суспензию включают в полиакриламидный гель, как описано в примере 1. Увеличив биомассу клеток, объем суспензии и соответственно количество соответствующих реагентов в 3 раза, получают 120 мл гранул диаметром 1,25 мкм, содержащих 4,5 мг клеток/мг гранул. Трансформацию проводят в биореакторе (ферментере) циркуляционного типа объемом 3 л, рабочий объем 2 л.

Трансформация гидрокортизона.

В реактор вносят 120 мл гранул, содержащий 540 мг клеток, 1880 мл буфера, 1,9 г гидрокортизона, измельченного, как в примере 1 (соотношение субстрат-клетки = 3,5:1).

Трансформацию ведут при температуре 28+1^оС, рН 7,2, избыточном давлении 0,1 кгс/см² (0,01 МПа), объеме подаваемого в ферментер воздуха 1,5 л/мин.

Для увеличения содержания растворенного кислорода в реакционной смеси аэрирующий воздух периодически под избыточным давлением вводят в реакционную смесь в зону работы мешалки. Контроль за содержанием растворенного кислорода в реакционной смеси проводят с помощью датчика рО₂. Процесс проходит при 80% О₂ от насыщения.

Анализ продуктов трансформации проводят так же, как и в примере 1.

Процесс завершается через 10 ч при этом в реакционной смеси обнаруживают 96% преднизолона и 4% гидрокортизона. Преднизолон выделяют известным способом.

Кинетика трансформации гидрокортизона включенным в ПААГ клетками представлена на фиг.4. Удельная активность иммобилизованных клеток составляет 50 нмоль мин^-1 мг^-1 клеток.

По окончании трансформации жидкую фазу реакционной среды сливают через штуцер ферментера в стеклянную бутыль, снабженную ситом, на котором при сливе реакционной среды скапливаются гранулы. После слива реакционной среды ферментер и гранулы на сите промывают. Для этого через верхний штуцер заливают в ферментер 300 мл стерильной воды, устанавливают скорость вращения мешалки 400 об/мин. Через 5 мин воду сливают в бутыль через сито, на котором находятся гранулы. Эти достигается одновременная промывка ферментера и гранул.

Промытые гранулы используются для проведения следующего процесса 1-ендегидрирования 6 α-метилгидрокортизона.

Трансформация 6 α-метилгидрокортизона.

В ферментер помещают 120 мл гранул, уже использованных для трансформации гидрокортизона, 1880 мл 0,01 М Nа-фосфатного буфера и 1,9 г 6 α-метилгидрокортизона в 38 мл спирта (50 мг/мл). Колбу из-под стериода споласкивают 10 мл спирта, который выливают в ферментер. Общий объем реакционной среды в ферментере составляет 2 л. Процесс проводят в тех же условиях, как описано при трансформации гидрокортизона. При соотношении субстрат: клетки, равном 3,5: 1, процесс завершается за 6 ч, при этом по данным хроматографического анализа в реакционной среде содержится 94% 6 α-метилпреднизолона, 5% его 20 -оксипроизводного, 1% 6 -метилгидрокортизона.

Кинетика процесса 1-ен-дегидрирования 6 α-метилгидрокортизона представлена на фиг. 5. Вычисленная по линейному участку кинетической кривой удельная 3-кетостероид-1-ен-дегидрогеназная активность включенных в ПААГ клеток А.globiformis равна 53 нмоль мин^-1 мг^-1 клеток.

Культуральную жидкость подкисляют 10%-ным раствором серной кислоты до рН 2,5-3,5, охлаждают, осадок отфильтровывают. Из маточного раствора экстрагируют стероид бутилацетатом (2 раза по 1 л). Бутилацетатный экстракт отмывают водой до нейтральной реакции и упаривают. Осадок после упаривания присоединяют ко садку, отфильтровыванному ранее. Получают 90% технического 6 α-метилпреднизолона. Объединенный технической продукт растворяют в 20-и кратном количестве смеси хлористый метилен : метанол (1 :1, об/об), добавляют 1,5 г угля и кипятят 0,5 ч. Уголь, отфильтровывают и к фильтрату при 30^о добавляют 80 мл гексана. При этом выпадает осадок. Реакционную массу охлаждают при 0-5^оС в течение 2 ч, осадок отфильтровывают, промывают 4 мл той же смеси (охлажденной) и сушат. Получают 1,61 г 6 α-метилпреднизолона (урбазона). Это почти белый кристаллический порошок с температурой плавления 232^оС удельным вращением +79^о (1%-ный раствор в диоксане). Выход 85%.

Длительность процесса, включая выращивание клеток, последовательные трансформации гидрокортизона и 6 -метилгидрокортизона, составляет 34 ч, что на 8 ч меньше, чем при известном способе.

Иммобилизованные в полиакриламидный гель клетки А.globiformis могут быть использованы без потери активности для получения 6 -метилпреднизолона до 20 раз.

П р и м е р 4. Выращивание клеток А.globiformis, иммобилизацию и трансформацию гидрокортизона проводят как в примере 1.

Трансформацию 6 α-метилгидрокортизона проводят так же, как в примере 1, за исключением того, что концентрация субстрата составляет 0,6 г/л. Процесс завершается за 7 ч. В реакционной среде содержится 98% 6 α-метилпреднизолона, 1% его 20 β-оксипроизводного и 1% остаточного 6 α-метилгидрокортизона.

Повышение концентрации 6 α-гидрокортизона выше 1,5 г/л нецелесообразно, так как субстрат оказывает ингибирующее действие на фермент, в результате чего процесс проходит в режиме низкой скорости и не доходит до конца. Низкая растворимость субстрата обуславливает спонтанное его "высаживание" (осаждение) на поверхностях ферментера или стенках колбы и на гранулах, что препятствует его дальнейшему превращению. Кроме того, увеличение количества вносимого субстрата предполагает увеличение концентрации токсичного для м/с растворителя (метанола) в реакционной среде, что приводит к уменьшению стабильности системы иммобилизованных клеток.

Концентрация клеток в гранулах геля подобрана для процесса трансформации 6 -метилгидрокортизона в 6 α-метилпреднизолон. При меньшем содержании клеток (меньше 1,6 мг/мл) почти пропорционально увеличивается длительность процесса (время трансформации).

Увеличение концентрации клеток (более 4,8 мг/мл гранул) не приводит к пропорциональному увеличению скорости процесса из-за диффузионных затруднений для субстрата и кислорода. Кроме того, в этих условиях (анаэробных условиях внутри гранул) интенсивно протекают восстановительные процессы (20 β-восстановление), что приводит к значительному снижению (до 40%) выхода целевого продукта.

П р и м е р 5. Выращивание клеток, иммобилизацию осуществляют, как в примере 1. Трансформацию гидрокортизона осуществляют как в примере 1 за исключением того, что в колбу вносят 500 мг микрокристаллического гидрокортизона в 10 мл фосфатного буфера. При этом его конечная концентрация в реакционной смеси составляет 5 г/л (соотношение субстрат : клетки = 6,25 : 1).

Процесс завершается за 38 ч, причем период индукции составляет также 4 ч.

После завершения процесса в реакционной среде обнаруживают 94% преднизолона и 6% гидрокортизона.

Дальнейшее увеличение "концентрации" гидрокортизона при данной концентрации клеток приводит к еще большему увеличению длительности процесса, что технологически неудобно.

При меньшей концентрации гидрокортизона выделение продукта преднизолона нецелесообразно с технологической точки зрения.

Результаты, демонстрирующие эффективность способа, представлены в таблице. 2 мг иммобилизованных клеток трансформируют 31,4 мг 6 α-метилгидрокортизона (за 10 использований в течение 88 ч), в то время как в случае свободных клеток с помощью 1 мг растущей культуры трансформируют 0,83 мг стероида.

Таким образом, предлагаемый способ и аппарат позволяют сократить длительность процесса превращения 6 α-метилгидрокортизона в 6 α-метилпреднизолон при уменьшении содержания клеток в реакционной среде, увеличении нагрузки субстрата и сохранении выхода целевого продукта, увеличить эффективность процесса не только за счет сокращения продолжительности процесса трансформации стероидов, но и за счет повторного использования иммобилизованных клеток; дополнительно получить другое ценное лекарственное вещество преднизолон; кроме того, исключить использование дорогостоящего индуктора ацетата кортизона.

Изобретение относится к биотехнологии и используется для получения стероидных соединений, являющихся лекарственными препаратами. Цель изобретения - ускорение процесса за счет повышения удельной активности клеток и улучшения аэрации системы. Способ осуществляется следующим образом. Для получения 6α -метилпреднизолона (МП) процесс микробиологической трансформации 6α -метилгидрокортизона проводят в две стадии в неростовой среде, используя клетки бактерий Arthrobacter globiformis 193, иммонобилизованные в полиакриламидный гель. На первой стадии процесса в качестве субстрата и индуктора используют гидрокортизон. По окончании первой стадии реакционную среду сливают. На второй стадии многократно осуществляют трансформацию МП. Целевой продукт выделяют. На второй стадии многократно осуществляют трансформацию МП. Целевой продукт выделяют из реакционной среды. Из реакционной среды первой стадии дополнительно выделяют преднизолон. Способ осуществляют в аппарате. Внесенную в емкость 1 аппарата реакционную смесь перемешивают турбиной осевого действия 7. При снижении содержания растворенного кислорода в реакционной смеси открывают клапан 12 на патрубке 2, через который сжатый воздух поступает под турбину 7 с одновременным повышением давления воздуха в емкости 1 до значения 0,1-0,3 кг/см² . Воздух, поступающий под турбину 7, вытесняет реакционную смесь из зоны ее действия и турбина вращается в "холостом" режиме. Отработанный воздух свободно выходит из реакционной смеси в наджидкостную полость. Клапан 12 закрывают и открывают клапан 13, через который избыточный воздух из наджидкостной полости реактора сбрасывают в атмосферу. Аппарат, кроме того, содержит патрубок 3 для отвода газа, циркуляционную трубу 4 с обечайкой 5 и отбойными пластинами 6, турбина 7 снабжена лопастями 8, а аэратор 9 выполнен в виде трубы 10 с раструбом 11. Аппарат обеспечивает улучшенную аэрацию системы. 2 с.п. ф-лы, 5 ил. 1 табл.

1. Способ получения 6α -метилпреднизолона, включающий выращивание клеток бактерий Arthrobacter globiformis 193 и трансформацию 6α -метилгидрокортизона при аэрации с последующим, выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью ускорения процесса за счет повышения удельной активности клеток и улучшения аэрации системы, после выращивания клеток проводят их иммобилизацию в полиакриламидном геле, затем трансформацию ведут в неростовой среде в две стадии, причем на первой стадии процесс осуществляют, используя гидрокортизон в качестве субстрата и индуктора, по окончании первой стадии процесса из среды выделяют преднизолон, а на второй стадии в качестве субстрата используют 6α -метилгидрокортизон, при этом аэрацию осуществляют, подавая воздух импульсно с вытеснением всего объема отработанного газа. 2. Аппарат для получения 6α -метилпреднизолона, содержащий емкость с патрубком для подвода газа и патрубком для отвода отработанного газа, размещенную в емкости циркуляционную трубу, прикрепленные к ее верхней части обечайку в виде усеченного конуса, обращенного большим основанием вверх, и вертикальные радиально расположенные отбойные пластины, турбину осевого действия, лопасти которой размещены в нижней части циркуляционной трубы, и аэратор, подключенный к патрубку для подвода газа, отличающийся тем, что, с целью ускорения процесса, аэратор представляет собой вертикальную трубу, выходной участок которой имеет раструб в виде усеченного конуса, обращенного большим основанием вверх и размещенного под турбиной по ее оси, при этом указанное основание конуса расположено не ниже нижнего торца циркуляционной трубы, причем патрубки для подвода и отвода газа снабжены управляемыми клапанами для периодического и повышения и понижения давления в емкости.