СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЯДРОСОДЕРЖАЩИХ КЛЕТОК ИЗ ПУПОВИННОЙ КРОВИ Российский патент 2009 года по МПК A61K35/14 A01N1/00 

Изобретение относится к области медицины и криобиологии, а именно к способам получения из пуповинной крови ядросодержащих клеток для трансплантации при лечении тяжелых заболеваний крови.

В настоящее время наиболее важным источником ядросодержащих клеток (ЯСК) является пуповинная кровь (ПК).

По сравнению с другими источниками ЯСК - костным мозгом и периферической кровью - пуповинная кровь имеет ряд преимуществ. Она содержит гемопоэтические клетки-предшественники (ГСК) и стволовые клетки с более высоким потенциалом пролиферации и самообновления. Вместе с тем вследствие малого количества стволовых клеток значительно удлиняется время восстановления гранулоцитов и тромбоцитов. По данным информационных источников трансплантация ядросодержащих клеток пуповинной крови сопряжена с меньшей степенью вероятности и тяжести реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) как в группе совместимых родственных, так и неродственных доноров и реципиентов.

Процесс забора пуповинной крови прост, занимает не более 10 минут, не вызывает никаких осложнений ни у матери, ни у ребенка.

Получение из пуповинной крови ЯСК и их хранение в качестве аллогенного трансплантата является относительно недорогим способом биологического страхования жизни и здоровья человека.

Известны различные методы получения ядросодержащих клеток (К.М.Абдулкадыров и др. Получение и клиническое применение периферических гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови. Вопросы онкологии 2000, т.46, №4, с.513-536; К.М.Абдулкадыров и др. Плацентарная кровь: альтернативный источник кроветворных стволовых клеток для трансплантаций. Создание банков пуповинной крови. Терапевтический архив, 2001, т.73, №7, с.76-78; К.М.Абдулкадыров. Гематология. Новейший справочник. М., 2004, с.890-901; Processing and cryopreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution / P.Rubistein (et al.) // Froc. Nat. Acad. USA, 1995, V.92, p.1-119-10122; Optimal processing of human umbilical cord blood for clinical banking / P. Denning-Kendall (et fl.) // Exp. Hematol, 1996, V.24, №12, p.1349-1401).

Все они включают в себя основные этапы: забор пуповинной крови, выделение из нее ядросодержащих клеток, их криоконсервирование с последующим хранением.

Для выделения ядросодержащих клеток используют как различные седиментирующие средства: крахмал (ГЭК) и т.д., так и центрифугирование.

Криоконсервирование проводят с использованием программных замораживателей и различных криопротекторов: ДМСО или ДМСО в сочетании с ГЭК или с человеческим альбумином и другие.

Недостатком известных методов является длительность и трудоемкость криоконсервирования пуповинной крови, а также высокая стоимость и возможность сбоя программных электросхем.

В качестве ближайшего аналога принят способ криоконсервирования пуповинной крови (Гришина В.В. Разработка оптимальных методов криоконсервирования кроветворных клеток пуповинной крови человека для трансплантаций. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, №1(3), с.52-59), заключающийся в том, что после рождения ребенка производят забор крови из пупочной вены путем эксфузии непосредственно в контейнер. Свежесобранную пуповинную кровь разделяют на фракции, для чего добавляют равный объем полиглюкина, перемешивают, вертикально подвешивают контейнер с полученной смесью. Смесь выдерживают в течение 50-60 минут до появления четкой границы раздела, отделяют супернатант, центрифугируют его при 2000 об/мин в течение 10 минут при +18°С, плазму удаляют. К оставшемуся осадку, представляющему собой концентрат ядросодержащих клеток, добавляют равный объем 10-12% раствора диметилсульфоксида в полиглюкине при постоянном перемешивании. Затем смесь в запаянном криомешке помещают в термостатируемый объем - контейнер для замораживания, который помещают в пары жидкого азота. Скорость охлаждения составляет 1-2°С в минуту, время охлаждения - 1-2 часа. Затем криомешок из контейнера переносят в основное хранилище, где его хранят при ультранизких температурах до трансплантации.

Недостатком способа, как и всех вышеуказанных, является малый объем пуповинной крови, получаемый при разовом сборе и невозможность ее повторного сбора.

Объема крови, находящегося в пупочном канатике, часто бывает недостаточно для выделения максимального количества ядросодержащих клеток, необходимого для успешного восстановления кроветворения при последующей трансплантации.

Кроме того, при замораживании материала отсутствует контроль за снижением температуры, что важно для подтверждения стабильности этих параметров и, следовательно, жизнеспособности материала (ЯСК).

Не предусматривается наличие паспорта хранящегося образца с характеристиками важнейших показателей, необходимых для решения вопроса о возможности его трансплантации.

Задачей изобретения является создание способа получения ядросодержащих клеток из пуповинной крови, позволяющего заготовить и сохранить для успешной трансплантации максимально возможное количество ядросодержащих клеток, повысить надежность и гарантию сохранения их жизнеспособности.

Сущность изобретения состоит в том, что способ получения ядросодержащих клеток из пуповинной крови характеризуется тем, что разовый забор пуповинной крови от одного донора выполняют в два этапа в непрерывном режиме, на первом этапе проводят эксфузию крови из дистального отдела пупочной вены в контейнер №1, на втором этапе, после рождения плаценты, производят забор оставшейся в ней крови путем перфузии, для чего плаценту помещают в лоток корневой частью вверх, выполняют пункцию прилегающего к ней проксимального отдела пупочной вены, нагнетают в нее из контейнера №2 антикоагулянт до набухания, затем плаценту поднимают таким образом, чтобы находящаяся в ней кровь вместе с антикоагулянтом вытекала в контейнер, после спадения вены плаценту пальпируют, извлекая остатки крови, свежесобранные эксфузат и перфузат крови смешивают, используя двухпортовую систему с двумя полипропиленовыми иглами, путем перевода перфузата, находящегося в контейнере №2, в основной мешок с кровью - контейнер №1, затем из пуповинной крови выделяют концентрат ядросодержащих клеток, перед проведением его последующего замораживания на криомешок с находящимся в нем концентратом накладывают термопару TXA-O-L с диапазоном измеряемых температур от -200°С до +500°С, подключенную к многоканальному измерителю-регулятору температур ИРТ-4/16, с помощью которого на протяжении всего периода охлаждения производят измерение температуры, осуществляют подачу на компьютер информации в виде графической кривой, производят сохранение заданных параметров в энергонезависимой памяти, затем к полученному образцу биоматериала, предназначенному для хранения в замороженном виде, прилагают полученную графическую кривую снижения температуры и паспорт, содержащий все необходимые для последующей трансплантации качественные и количественные характеристики, включая количество жизнеспособных ядросодержащих клеток.

Использование изобретения позволяет получить следующий технический результат.

Предлагаемый способ позволяет собрать от одного донора при разовом сборе максимальное количество пуповинной крови и выделить максимально возможное количество ядросодержащих клеток, необходимое для проведения успешной трансплантации. Объем получаемой пуповинной крови примерно на 1/3 больше, чем при использовании известного способа. Дополнительный объем крови, полученный за счет перфузии, составляет в среднем 30 мл, а количество выделенных ЯСК увеличивается на 30,2+5,6%. Повышается гарантия и надежность максимального сохранения жизнеспособности ядросодержащих клеток за счет оптимизации процесса их замораживания.

Измерение температуры на протяжении всего периода ее снижения с получением графической кривой позволяет подтвердить качество хранящихся образцов и гарантировать их жизнеспособность.

Предусмотренное в способе наличие качественной и количественной характеристик образца не только гарантирует и подтверждает жизнеспособность ЯСК, но и дает всю необходимую информацию специалисту для принятия решения перед проведением трансплантации.

Способ дает возможность целевого использования образца и обеспечивает эффективность трансплантации и соответственно проводимого лечения при тяжелых заболеваниях крови, в том числе онкологических.

Технический результат достигается за счет разработанных авторами новой технологии забора пуповинной крови, оптимизации процесса замораживания ЯСК и обеспечения возможности подтверждения качества полученного биоматериала, предназначенного для трансплантации.

Технология забора пуповинной крови по предлагаемому способу предусматривает максимальный разовый забор от одного донора в два этапа в непрерывном режиме. Она включает проведение эксфузии крови из пупочной вены на этапе, когда плацента еще находится в полости матки, и предложенный авторами дополнительный забор крови, оставшейся в плаценте, после ее рождения.

При этом авторы исходили из того факта, что в плаценте остается достаточный для дополнительного забора объем крови, и разработали способ ее максимального забора путем перфузии. Хотя объем пуповинной крови, оставшейся в плаценте после родов, относительно мал - примерно 30 мл, высокая концентрация клеток-предшественников обеспечивает успешное приживление трансплантата и восстановление кроветворения у пациентов, масса тела которых не превышает 40-50 кг.

В процессе замораживания образцов проводят непрерывное измерение температуры в течение всего периода охлаждения на протяжении 1-2 часов, осуществляют контроль за ее снижением, получают точную графическую кривую снижения температуры, наличие которой позволяет повысить надежность и гарантию сохранения жизнеспособности ЯСК. С этой целью авторами впервые использован микроконтроллерный многоканальный измеритель-регулятор температур ИРТ-4/16, предназначенный для построения автоматических систем контроля и управления температурой производственных и технологических процессов (ТФАП. 421455.006 РЭ и ПС), (ТФАП. 422455.006-01, ТФАП. 421455.006-02), позволяющий сохранить и накопить измеренные параметры.

Наличие паспорта хранящегося образца, содержащего важную информацию: регистрационный номер, дату и время начала и окончания работ, перечисление материалов, использованных в работе, описание методики выделения, концентрирования, криоконсервирования, объем биоматериала, способ хранения, количество ядросодержащих клеток в конечном биоматериале, дату и время помещения концентрата в условия плавного и щадящего замораживания, количество жизнеспособных клеток после замораживания и размораживания, количество CD34⁺ - клеток, «чистоту» материала, дату и время помещения материала на длительное хранение в биохранилище в жидкий азот, а также наличие точной графической кривой снижения температуры на 1-2°С в минуту до -70°С - дает специалисту всю необходимую информацию для принятия решения перед использованием, подтверждает и гарантирует качество биоматериала, обеспечивая таким образом успешное проведение трансплантации.

Способ осуществляется следующим образом.

Производят разовый забор пуповинной крови от одного донора в два этапа в непрерывном режиме.

Медсестра готовит рабочее место - стол для манипуляций, на который укладывают в стерильных условиях пластиковые контейнеры с антикоагулянтом.

На первом этапе забор пуповинной крови производят путем эксфузии из дистального отдела пупочной вены, расположенной в пупочном канатике, следующим образом.

После рождения головки (кожный разрез в случае кесарева сечения) врач берет в руку мешок, снимает колпачок с иглы, надавливает на мешок до появления капли антикоагулянта. После рождения ребенка убеждаются в целостности пуповины и отсутствии видимых повреждений, после чего накладывают два стерильных зажима на расстоянии 2 см друг от друга параллельно на пуповину на расстоянии 10 см от ребенка. Пуповину между зажимами пересекают, у места зажима ее берут левой рукой с марлевой салфеткой. Место планируемой пункции пуповины на протяжении не менее 10 см обрабатывают 70% спиртом, а затем иодонатом. Время экспозиции действия антисептика составляет 30 сек. Затем вену пунктируют (эту манипуляцию осуществляет врач) максимально близко к зажиму, срез иглы при этом направлен вверх.

Медсестра располагает контейнер для забора крови ниже уровня нахождения роженицы. При тенденции спадения вены врач поглаживающими движениями по пуповине максимально отживает остатки крови. Получаемую кровь перемешивают с антикоагулянтом, находящимся в контейнере №1, путем его плавного покачивания в течение всей процедуры сбора и непосредственно после в течение 10 секунд во избежание образования сгустков. Признаками окончания забора является запустевание пуповинной вены и ее спадение. Время забора варьирует в пределах от 5 до 8 минут.

Извлекают иглу из вены и закрывают колпачком. После максимального оттока крови из магистрали в контейнер на магистрали завязывают три узла с интервалом 5 см и затягивают их.

После рождения плаценты (или ее отделения от стенок матки) производят забор оставшейся в ней крови путем перфузии. Плаценту помещают в лоток корневой частью вверх, накладывают зажим на пуповину на расстоянии 5-10 см от плаценты, дезинфицируют место пункции вены. Берут контейнер №2 для забора крови, содержащий антикоагулянт. Выполняют пункцию прилегающего к плаценте проксимального отдела пупочной вены, нагнетают в нее из контейнера антикоагулянт в объеме 30-60 мл до набухания. Затем плаценту поднимают таким образом, чтобы находящаяся в ней кровь вместе с антикоагулянтом вытекала в контейнер, постоянно его покачивая. После спадения вены плаценту пальпируют, извлекая остатки крови.

После окончания процедуры извлекают иглу из вены и закрывают ее колпачком.

Свежесобранные эксфузат и перфузат пуповинной крови смешивают, используя двухпортовую систему с двумя полипропиленовыми иглами. Смешивание осуществляют путем перевода перфузата, находящегося в контейнере №1, в основной мешок с кровью - контейнер №2, после чего пустую систему с мешком, где содержался перфузат, отпаивают.

Из пуповинной крови выделяют концентрат ядросодержащих клеток общеизвестным способом (Гришина В.В. Разработка оптимальных методов криоконсервирования кроветворных клеток пуповинной крови человека для трансплантаций. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. №1(3), с.52-59). Пуповинную кровь разделяют на фракции путем добавления равного объема полиглюкина. Смесь тщательно перемешивают и выдерживают в течение 50-60 минут, отделяют супернатант, центрифугируют его при 2000 об/мин, плазму удаляют, к полученному осадку - концентрату ядросодержащих клеток - добавляют равный объем 10-12% раствора диметилсульфоксида в полиглюкине.

Перед проведением последующего замораживания на криомешок с находящимся в нем концентратом ЯСК накладывают термопару TXA-O-L с диапазоном измеряемых температур от -200°С до +500°С, подключенную к многоканальному измерителю-регулятору температур ИРТ-4/16 (ТФАП. 421455.006 РЭ и ПС), (ТФАП. 422455.006-01, ТФАП. 421455.006-02). Затем концентрат клеток в запаянном криомешке помещают в контейнер для замораживания, который, в свою очередь, помещают в пары жидкого азота. Скорость охлаждения материала составляет 1-2°С в минуту, время охлаждения 1-2 часа.

На протяжении всего периода охлаждения производят измерение температуры, осуществляя подачу на компьютер информации в виде графической кривой снижения температуры, производят сохранение заданных параметров в энергонезависимой памяти с указанием даты и времени, в том числе при отключении напряжения питания.

К полученному образцу биоматериала, предназначенному для хранения в замороженном виде, прилагают полученную графическую кривую снижения температуры и паспорт. Его наличие является обязательным условием для последующего решения о возможности трансплантации образца.

Паспорт содержит все необходимые для последующей трансплантации качественные и количественные характеристики: присвоенный образцу регистрационный номер, дату и время начала и окончания работ, перечень использованных в работе материалов, описание методики выделения ЯСК, концентрирования, криоконсервирования, объем биоматериала, который будет храниться, способ хранения, количество ядросодержащих клеток в конечном биоматериале, дату и время помещения концентрата в условия плавного и щадящего замораживания, количество жизнеспособных ЯСК после замораживания и размораживания, количество CD34⁺, характеристику «чистоты» материала, дату и время помещения материала на длительное хранение в биохранилище в жидкий азот.

Криомешок из контейнера переносят в основное хранилище с жидким азотом, где он сохраняется до трансплантации.

Предлагаемый способ использован для получения более 100 образцов ядросодержащих клеток. Объем разового забора пуповинной крови для получения одного образца составил 90±10 мл. Количество выделенных ядросодержащих клеток составило в среднем 93,2±6,3% от исходного. Все образцы характеризовались высокой жизнеспособностью до замораживания и после размораживания - более 90%.

Биоматериал, полученный предложенным способом, успешно применен в НИИ Детской онкологии и гематологии ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН г.Москвы при проведении первой в России последовательной трансплантации ЯСК из пуповинной крови и стволовых клеток из периферической крови от двух родственных, частично совместимых доноров больному с нейробластомой IV степени.

Изобретение относится к области медицины и криобиологии, а именно к способам получения из пуповинной крови ядросодержащих клеток для трансплантации при лечении тяжелых заболеваний крови. Способ заключается в том, что разовый забор пуповинной крови от одного донора выполняют в два этапа в непрерывном режиме, на первом этапе проводят забор крови путем эксфузии из дистального отдела пупочной вены с последующим перемешиванием с антикоагулянтом в контейнере №1 в течение всей процедуры сбора; на втором этапе, после рождения плаценты, проводят забор оставшейся в ней крови путем перфузии, для чего плаценту помещают в лоток корневой частью вверх, выполняют пункцию прилегающего к плаценте проксимального отдела пупочной вены, нагнетают в нее антикоагулянт из контейнера №2 до набухания, плаценту поднимают таким образом, чтобы находящаяся в ней кровь вместе с антикоагулянтом вытекала в контейнер, после спадения вены плаценту пальпируют, извлекая остатки крови, затем свежесобранные эксфузат и перфузат объединяют путем перевода крови из контейнера №2 в контейнер №1, добавляют равный объем полиглюкина, смесь перемешивают, выдерживают в течение 50-60 минут, отделяют супернатант, центрифугируют его при 2000 об/мин, плазму удаляют, к полученному осадку, содержащему концентрат ядросодержащих клеток, добавляют равный объем 10-12% раствора диметилсульфоксида в полиглюкине, перед проведением последующего замораживания смесь помещают в криомешок, накладывают на него термопару с диапазоном измеряемых температур от -200°С до +500°С, подключенную к многоканальному измерителю-регулятору температур ИРТ-4/16, с помощью которого на протяжении всего периода охлаждения производят измерение температуры, осуществляют подачу на компьютер информации в виде графической кривой, производят сохранение заданных параметров в энергонезависимой памяти, затем к полученному образцу, содержащему целевой продукт, предназначенному для хранения в замороженном виде, прилагают полученную графическую кривую снижения температуры и паспорт, содержащий все необходимые для последующей трансплантации качественные и количественные характеристики, включая количество жизнеспособных ядросодержащих клеток. Способ позволяет собрать от одного донора при разовом сборе максимальное количество пуповинной крови и выделить максимально возможное количество ядросодержащих клеток, необходимое для проведения успешной трансплантации. Повышается гарантия и надежность максимального сохранения жизнеспособности ядросодержащих клеток.

Способ получения ядросодержащих клеток из пуповинной крови, характеризующийся тем, что разовый забор пуповинной крови от одного донора выполняют в два этапа в непрерывном режиме, на первом этапе проводят забор крови путем эксфузии из дистального отдела пупочной вены с последующим перемешиванием с антикоагулянтом в контейнере №1 в течение всей процедуры сбора; на втором этапе, после рождения плаценты, проводят забор оставшейся в ней крови путем перфузии, для чего плаценту помещают в лоток корневой частью вверх, выполняют пункцию прилегающего к плаценте проксимального отдела пупочной вены, нагнетают в нее антикоагулянт из контейнера №2 до набухания, плаценту поднимают таким образом, чтобы находящаяся в ней кровь вместе с антикоагулянтом вытекала в контейнер, после спадения вены плаценту пальпируют, извлекая остатки крови, затем свежесобранные эксфузат и перфузат объединяют путем перевода крови из контейнера №2 в контейнер №1, добавляют равный объем полиглюкина, смесь перемешивают, выдерживают в течение 50-60 мин, отделяют супернатант, центрифугируют его при 2000 об/мин, плазму удаляют, к полученному осадку, содержащему концентрат ядросодержащих клеток, добавляют равный объем 10-12% раствора диметилсульфоксида в полиглюкине, перед проведением последующего замораживания смесь помещают в криомешок, накладывают на него термопару с диапазоном измеряемых температур от -200 до 500°С, подключенную к многоканальному измерителю-регулятору температур ИРТ-4/16, с помощью которого на протяжении всего периода охлаждения производят измерение температуры, осуществляют подачу на компьютер информации в виде графической кривой, производят сохранение заданных параметров в энергонезависимой памяти, затем к полученному образцу, содержащему целевой продукт, предназначенному для хранения в замороженном виде, прилагают полученную графическую кривую снижения температуры и паспорт, содержащий все необходимые для последующей трансплантации качественные и количественные характеристики, включая количество жизнеспособных ядросодержащих клеток.