Способ сохранения жизнеспособности гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после отмывки от криопротектора Российский патент 2024 года по МПК A01N1/00 

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической трансфузиологии. Решение вопросов долгосрочного хранения клеток крови в условиях низких и ультранизких температур стало возможным при введении в биологические системы криопротекторов - веществ, которые обладают способностью предупреждать повреждение биологических объектов и обеспечивать их сохранность в жизнеспособном и функционально полноценном состоянии после замораживания-отогревания. С 2003 г. при криоконсервировании трансплантационного материала начал применяться высокоочищенный диметилсульфоксид (ДМСО) в конечной концентрации 5,0-7,5%. [1] Наиболее эффективной для криоконсервации гемопоэтических стволовых клеток CD34+ (ГСК) и применения в клинической практике признана 10% концентрация ДМСО. Замораживание ГСК до ультранизких температур считается эффективным и надежным технологическим решением, обеспечивающим долговременное хранение до трансплантации.

ДМСО относится к оксидам, представляет собой молекулу (молекулярная масса - 78,13 г/моль) со свойствами амфифильности (гидрофильная группу сульфоксида и две гидрофобные метиловые группы). Вещество является высокополярным, хорошо проникает в клетки, связывает молекулы воды в растворе посредством водородных связей, что, в свою очередь, блокирует отток воды из цитоплазмы и предотвращает дегидратацию клеток во время замораживания. При кристаллизации растворов, содержащих ДМСО, получается близкая к аморфной, мелкоячеистая структура, которая малотравматична для клеток. ДМСО относится к хладоограждающим веществам внутриклеточного типа [2]. Для компенсации токсического действия и повышения цитопротективных свойств ДМСО необходим подбор оптимальной его концентрации, обеспечивающей максимальные криопротекторные свойства при минимальном повреждающем действии на ядерные клетки крови (ЯКК). Рядом авторов проведены исследования по уменьшению конечной концентрации ДМСО [4]. В результате данных работ было показано, что снижение концентрации ниже 7-5% приводит к значительным потерям стволовых клеток, что является существенным недостатком указанного методического подхода [2, 3].

В качестве прототипа изобретения использована работа группы авторов [5], которые предлагают отмывание биоматериала от ДМСО. Для удаления криопротектора из взвеси декриоконсервированных стволовых клеток авторы используют раствор, содержащий 2,5% человеческого альбумина и 5% Декстран 40 в изотоническом растворе натрия хлорида, в объеме равном объему взвеси клеток, с последующим центрифугированием при 400 g в течении 10 мин. Затем супернатант удаляют, а осажденные клетки медленно ресуспендируют в новой порции раствора содержащего 2,5% альбумина и 5% Декстрана до объема, подходящего для инфузии пациентам. Из представленных в прототипе результатов следует, что предложенный способ обеспечивает удовлетворительные результаты сохранности клеток, однако количество жизнеспособных лейкоцитов снижается на 39%.

Предлагаемый способ сохранения жизнеспособности гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после отмывки от криопротектора заключается в уменьшении (минимизации) количества ДМСО, вводимого в организм реципиента при трансплантации ГСК и создания благоприятных условий для отмытых клеток для более длительного хранения.

Указанная цель достигается благодаря отмыванию гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови от криопротектора (ДМСО) с использованием разработанного раствора. Способ позволяет сохранить 86,9±13,2% жизнеспособных ГСК в течение 48 часов.

ПРИМЕР ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СРЕДСТВА

Заявляемый способ сохранения жизнеспособности гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после отмывки от криопротектора на основе диметилсульфоксида после размораживания гемопоэтических стволовых клеток включает в себя несколько этапов и отличается тем, что непосредственно перед процедурой отмывания готовят раствор 450 мл 0,9% раствора Натрия хлорида + 45 мл 10% раствора Гидроксиэтилкрахмала + 1 мл (5000МЕ) Гепарина.

Размораживание производится на водяной бане при температуре +37 градусов Цельсия до полного оттаивания, 3-5 минут. Далее вся работа осуществляется в комплексе чистых помещений с классом чистоты не ниже D. Непосредственно работа с биоматериалом осуществляется в ламинарном шкафу Thermo HERA Safe D-63505 с соблюдением условий по чистоте класса А.

Концентрат гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови с помощью шприца 20 мл переносится в цетрифужную пробирку объемом 50 мл. Добавляется вышеописанный раствор до отметки 50 мл.

Далее проводят центрифугирование (Центрифуга с охлаждением ThermoMultifuge IS-R) при 300g в течение 10 минут. Надосадочная жидкость удаляется (электронный дозатор Thermo, для серологических пипеток). Осадок ресуспендируется в вышеуказанном отмывающем растворе в соотношении 1:1 V/V. Данный этап повторяется 3 раза.

После третьего центрифугирования и удаления надосадочной жидкости, осадок ресуспендируется в вышеуказанном отмывающем растворе в соотношении 1:1 V/V. Далее полученные отмытые ГСК доводятся до нужного объема отмывочным раствором из расчета не более 20*10’⁸ лейкоцитов в 20 мл вышеописанного раствора.

В результате процедуры отмывания в биопродукте происходит полная замена криоконсервирующего раствора, содержащего ДМСО, на отмывочный раствор, сокращается время контакта размороженных ядросодержащих клеток (ЯСК) с внеклеточным ДМСО, а разработанный раствор является благоприятной средой для сохранения жизнеспособности отмытых гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови [4, 5].

Экспериментальные исследования выполнены на базе отделения заготовки крови и ее компонентов Государственного бюджетного учреждения здравоохранения Медицинский центр Династия.

Оценивали общее количество лейкоцитов (до замораживания, после размораживания, после отмывки и спустя 48 часов после отмывки). Подсчет числа жизнеспособных кроветворных клеток-предшественников проводили методом проточной цитометрии по наличию экспрессии маркера CD34 с окраской на жизнеспособные клетки красителем 7AAD. Сохранность лейкоцитов и ГСК определяли, как соотношение абсолютного количества лейкоцитов и CD34-позитивных клеток после размораживания (отмывания) к аналогичному показателю до криоконсервирования и спустя 48 часов после отмывания. Условия хранения концентрата ГСК +4-+8 гр. Данное количество лейкоцитов и СД34+ клеток содержится в единице концентрата пуповинной крови (ед.ПК) объемом 20 мл).

Среднее количество лейкоцитов до замораживания варьировало составило 17,4+2,11×10⁸/ед. ПК (медиана-18.15×10⁸), а содержание CD34-положительных клеток - 5,5+0,41+0,41 ×10⁶ (медиана - 5,73×10⁶). После размораживания до отмывания от криоконсерванта содержание лейкоцитов составило 17,06+2,52×10⁸ (медиана 17,78×10⁸), a CD34+ клеток -5,39+0,35×10⁶ (медиана -5,61×10⁶). Потеря лейкоцитов и CD34+ клеток после размораживания составила 2% (n=200) от их исходного уровня (таблица 1).

Таблица 1. Характеристика лейкоцитов и СД34+ клеток до криозамораживания, после размораживания, после отмывки и через 48 часов Показатель До замораживания
N=200 После размораживания
N=200 После отмывки
N=200 Спустя 48 часов после отмывки
N=200 Спустя 48 часов после отмывки
(контроль, использовался 0,9% раствор натрия хлорида)
N=200 Абсолютное количество лейкоцитов ×10⁸ / ед.ПК Среднее значение 17,41
+2,11 17,06
+2,52 16,8
+1,91 15,12*
+1,54 11,94
+1,96 Медиана 18,15 17,78 17,52 15,77* 12,44 Количество СД34+ позитивных, жизнеспособных клеток *10⁶/ ед.ПК Среднее значение 5,5
+0,41 5,39
+0,35 5,31
+0,39 4,78*
+0,37 2,27
+0,28 Медиана 5,73 5,61 5,53 4,98* 2,12

*p<0,01 (сравнение с контролем)

После проведения процедуры отмывания от криоконсерванта размороженных лейкоцитов их количество составило 16,8+0,35+0,35×10⁸ (медиана 17,52×10⁸), a CD34+ клеток - 5,31+0,39×10⁶ (медиана - 5,53×10⁶) Потеря лейкоцитов и CD34+ клеток после размораживания составила 1,5% (n=200) от их уровня после разморозки. Спустя 48 часов после проведения процедуры отмывания от криоконсерванта размороженных лейкоцитов их количество составило 15,12+1,54×10⁸ (медиана 15,77×10⁸) a CD34+ клеток - 4,78+0,37×10⁶ (медиана - 4,98×10⁶). Потеря лейкоцитов и CD34+ клеток спустя 48 часов после размораживания составила 10% (n=200) от их уровня после разморозки. Спустя 48 часов после проведения процедуры отмывания от криоконсерванта размороженных лейкоцитов в контроле с использованием 0,9% раствора натрия хлорида их количество составило 11,94+1,96×10⁸ (медиана 12,44×10⁸) a CD34+ клеток - 2,27+0,28×10⁶ (медиана - 2,12×10⁶). Потеря лейкоцитов и CD34+ клеток спустя 48 часов после размораживания в контроле составила 30% и 60 % соответственно (n=200) от их уровня до разморозки.

Сохранность содержания лейкоцитов и CD34+ клеток составила 86,9% от их исходного уровня до криоконсервирования. Выявлены значимые отличия в сохранности в течение 48 ч лейкоцитов и CD34+ клеток при проведении процедуры отмывания от криоконсерванта предложенным способом в сравнении с использованием с использованием 0,9% раствора натрия хлорида (р<0,01).

ЛИТЕРАТУРА

1. Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 25 июля 2003 г. №325 «О развитии клеточных технологий». - URL: http://www.rba.ru (дата обращения: 06.05.2019).

2. Kostyaev A.A., Utyomov S.V., Andreev A.A., Polezhaeva Т.V., Martusevich А.K, Isaeva N.V., Sherstnyov P.S., Vetoshkin K.A., Kalinina E.N., Knyazev M.G. A fourclasssystematizationofbiocryoconservants. The first class of cold preserving solutions - endocellular cryoprotectants. Vestnikgematologii. 2016; 12 (3); 28-35. (inRuss.)].

3. Консервирование живых тканей или органов Патентообладатель А01N1/02: ЛобынцеваГ.С (UA) Приоритеты: публикация патента: 10.08.2004.

4. Патент RU 2563117 "Комбинированный криопротектор диметилсульфоксид/реополиглюкин" для криоконсервации стволовых клеток и способ их криоконсервации для клинического применения, авторы патента: Астрелина Т.A. (RU), Кобзева И.В RU. https://findpatent.ru/patent/256/2563117.html) 2012-2019.

5. Processing and cryopreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution / P. Rubinstein, L. Dobrila, R. Rosenfield., et. al. // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1995. - Vol. 92, №22. - P. 10119-10122.

6. Влияние отмывания криопротектора диметилсульфоксида на свойства гемопоэтических стволовых клеток трансплантационного материала / Степанов А.А., Коротаев Е.В., Бессмельцев С.С2, Рабинович В.И., Астахова Л.П., Пономарев С.А. www.medline.ru Т., 14, Гематология 25 мая 2013.

7. Сохранность количества размороженных гемопоэтических стволовых клеток после процедуры отмывания от диметилсульфоксида / К.А Ветошкин, Н.В. Минаева, Н.А. Зорина [и др.] // Трансфузиология. Тезисы IV Московской международной конференции специалистов производственной и клинической трансфузиологии. - 2018. - С. 32-34.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу сохранения жизнеспособности гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после отмывки от криопротектора. Указанный способ заключается в том, что проводят размораживание концентрата пуповинной крови с гемопоэтическими стволовыми клетками CD34+ (ГСК); отмывают ГСК от криопротектора, трехкратно центрифугируют при 300g в течение 10 минут, удаляют надосадочный слой, полученный осадок ресуспендируют с получением отмытых клеток, которые далее доводят до нужного объема отмывочным раствором из расчета не более 20*10’8 лейкоцитов в 20 мл указанного раствора. Изобретение эффективно для сохранения жизнеспособности гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после отмывки от криопротектора. 1 табл., 1 пр.

Способ сохранения жизнеспособности гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после отмывки от криопротектора, заключающийся в том, что проводят размораживание концентрата пуповинной крови с гемопоэтическими стволовыми клетками CD34+ (ГСК); отмывают ГСК от криопротектора с помощью раствора, состоящего из 450 мл 0,9% раствора Натрия хлорида, 45 мл 10% раствора Гидроксиэтилкрахмала и 1 мл или 5000МЕ Гепарина, и трехкратно центрифугируют при 300g в течение 10 минут, удаляют надосадочный слой, полученный осадок ресуспендируют в вышеуказанном отмывающем растворе с получением отмытых клеток, которые далее доводят до нужного объема отмывочным раствором из расчета не более 20*10’⁸ лейкоцитов в 20 мл указанного раствора.