ДЕЗИНФИЦИРУЮЩЕЕ СРЕДСТВО Российский патент 2009 года по МПК A61L2/16 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к препаратам, обладающим биоцидными свойствами и в связи с этим перспективным в качестве дезинфицирующего средства для борьбы с бактериальными и грибковыми поражениями древесины, тканых и иных материалов, а также жилых и производственных помещений, а также способам их применения и может быть использовано в медицине, ветеринарии, текстильной и строительной индустрии, а также смежных отраслях производства.

В настоящее время для борьбы с заражением поверхностей объектов микроорганизмами используют такие препараты, как метафлор, формальдегид, алкамон, хлористые углеводороды и т.п. (GB 1476730, 1977, DE 2820409, 1981). Дезинфекцию проводят путем обмыва поверхностей раствором биоцидов или обработкой аэрозолями.

Однако указанные препараты не обладают пролонгированным действием, опасны для человека и окружающей среды, малоэффективны в низких концентрациях.

Одной из наиболее перспективных групп биоцидов являются различные производные гуанидина (GB 821113, 1959; SU 1184296, 1983; П.А. Гембицкий Синтез метацида. Хим. Пром. 1984, № 2, с.18-19; SU 1687261, 1991), сочетающие хорошие биоцидные свойства с относительной малотоксичностью. Среди указанных производных наиболее известны полигексаметиленгуанидин (ПГМГ) и его соли с кислотами, в частности, гидрохлорид (ПГМГ-ГХ) или фосфат (ПГМГ-Ф) (SU 247463, 1968; SU 1698061, 1991), предложенные для борьбы с бактериальными загрязнениями.

Наиболее известен полигексаметиленгуанидингидрохлорид (ПГМГ-ГХ), получивший наименование химическое название метоцид, обладающий пониженной токсичностью и высокими антимикробными свойствами для использования в пищевой промышленности, медицине, ветеринарии, быту. Композиции, содержащие метоцид, выпускаются в России под различными товарными знаками - Полисепт, Фогуцид, БИОР-1, Тефлекс и рядом других (Англ. пат 821113, 1959, кл. 15 (2) G, А.с. СССР 1184296, 1983, кл. D06М 14/04, П.А. Гембицкий Синтез метацида, Хим. Пром. 1984, № 2, с.18-19. Пат. СССР 1687261, 1991, кл. А61L 2/16; А.с. СССР 247463, 1968, кл. А61L 2/16, А.с. СССР 1698061, 1991, кл. В27К 3/34).

Как правило, получение ПГМГ-ГХ осуществляют путем поликонденсации дициандиамида (ДЦДА) с хлористым аммонием (ХА), а затем с гексаметилендиамином (ГМДА). При этом промежуточно образующийся гидрохлорид гуанидина (ГХГ) содержит в качестве примесей производные циануровой кислоты (или меламина) - амелид и амелин. От этих примесей ГГХ не очищается и они присутствуют в конечном продукте. (Гембицкий П.А., Лиманов В.Е. и др. Журнал прикладной химии, 1975, 48, с.1833; Гембицкий П.А., Бокша Л.Ф., Жук Д.С. // Хим. промышленность, 1984, N2, с.82; Сафонов Г.А., Гембицкий П.А., Родионов А.В. // Хим. пром., 1989, N 12, с.1478).

Однако использование существующих препаратов на основе ПГМГ требует относительно высоких концентраций активного начала. Кроме того, отмечается высокая коррозионная активность ПГМГ-ГХ и относительно короткий срок действия, а также наличие в его составе низкомолекулярных токсичных веществ.

Известно дезинфицирующее средство, представляющее собой водный раствор смеси ПГМГ-ГХ и алкилдиметилбензиламмоний хлорида (RU 2182889, 2001). Полученный продукт представляет собой смесь полимергомологов разной молекулярной массы, в том числе низкомолекулярных, отличающихся сравнительно высокой токсичностью и пониженной антимикробной активностью, а также содержит остаточные компоненты синтеза, в том числе гексаметилендиамина (ГМДА), отличающегося высокой токсичностью (остаточное содержание в продукте 1%, 2-й класс опасности по ГОСТ 12. 1.007-76, Д₅₀ 250 мг), наличием аллергических свойств.

Недостатком средства является высокая коррозионная активность, токсичность и относительно невысокая эффективность.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому препарату является разработанное авторами дезинфицирующее средство «Тефлекс», представляющее 5-20% раствор ПГМГ-ГХ - 5-20 (% масс.) в водосодержащем растворителе. Водосодержащий растворитель содержит вспомогательные добавки, улучшающие свойства ПГМГ-ГХ - неонол, гексаметилентетрамин, пропиленгликолевый эфир, мочевину, а также примесные компоненты синтеза, в частности амелин и амелид.

Задачей, решаемой авторами, являлось создание менее токсичного и более эффективного и стабильного при эксплуатации препарата.

Технической задачей являлось введение в состав препарата веществ, способных повысить биоцидную активность ПГМГ и связывать токсические примеси. При этом продукты их взаимодействия либо выводятся из раствора либо образуют практически нетоксические соединения.

Было найдено, что технический результат достигался за счет введения в состав продукта от 0.001 до 2% ионов двухвалентного железа в расчете на ПГМГ. Ионы двухвалентного железа вводят, как правило, в виде водорастворимых солей железа с сильными кислотами - серной, соляной, азотной, уксусной и т.п. Из экономических соображений наиболее часто используют сульфат железа.

Полученный продукт, как правило, реализуется в виде концентрата, содержащего около 50% масс. ПГМГ-ГХ и 0.001-5% масс. солей железа в водосодержащем растворителе. В качестве последнего используется вода (средство «Тефлекс - И») или водный раствор вспомогательных добавок применяемых в средстве «Тефлекс» - неонола, гексаметилентетрамина, пропиленгликолевого эфира и мочевины (средство - «Тефлекс-Экстра»).

В этом случае в его состав входят (% масс.):

ПГМГ-Х3-20Соли Fe⁺⁺0,0001-0,5Неонол5-15Гексаметилентетрамин0.5-5Пропиленгликолевый эфир5-15Мочевина0.5-5Водаостальное

Препарат готовят следующим образом. ПГМГ-ГХ при температуре 100°С заливают водным раствором, содержащим заданное количество ионов Fe⁺⁺, после чего смесь выдерживают при перемешивании в течение 1-4 часов.

Всплывшие на поверхность комплексы низкомолекулярных продуктов полимеризации удаляют механическим путем. Полученный продукт при концентрации ПГМГ около 50% реализуется под наименованием «Тефлекс^®-индустриальный (концентрат)», при содержании ПГМГ 4% - под товарной маркой «Антиплесень^®-Тефлекс».

Особенностью заявляемого продукта наряду с повышенной чистотой (около 99% по сухому веществу) является образование комплекса между ПГМГ и солями железа, обладающего повышенной биоцидной активностью.

Для подтверждения образования комплекса было проведено количественное измерение комплексообразующей способности макромолекул ПГМГ по отношению к молекулам сульфата двух валентного железа методом спин-обменного титрования. Сущность метода спин-обменного титрования демонстрирует чертеж, где изображена зависимость ширины линии ЭПР (электронного парамагнитного резонанса) зонда - свободного радикала 2,2,6,6-тетраметил-4-оксипиперидин-1-оксила (R) от концентрации сульфата двухвалентного железа в отсутствие и в присутствии комплексообразующего полимера ПГМГ-ГЖ.

Из анализа чертежа видно, что титрование водного раствора R раствором сульфата железа в отсутствие полимера приводит к обычному линейному по концентрации уширению линий ЭПР зонда R из-за спинового обмена с аквакомплексами железа. В то же время при добавлении в раствор ПГМГ-ГХ, титрование раствором FeSO₄ не приводит к уширению линий ЭПР зонда R вплоть до определенной концентрации FeSO₄, которая зависит от концентрации добавленного полимера.

По достижении этой критической концентрации вновь начинается линейное по концентрации уширение с тем же угловым коэффициентом. Такая зависимость АН от С объясняется тем, что первые порции Fe²⁺ образуют с полимером прочные комплексы, в которых атомы железа экранированы остовом полимера от столкновений с зондом R. По соответствующей точке перегиба кривой ΔН=f(C), определяется количество сульфита железа, которое полимер может связать в комплекс. Оно оказалось равным 0.06 мг/мл 50% водного раствора ПГМГ-ГХ.

Образование подобного комплекса приводит к структурированию системы и практически полному исчезновению текучести при температуре 14°С.

Полученный в результате продукт сохраняет прозрачность и практическую бесцветность, однако характеризуется малой текучестью, повышенной вязкостью и маслянистостью.

Полученная композиция практически нетоксична (111 класс токсичности), не накапливается в организме. Проведенные испытания показали ее более высокую эффективность по сравнению с промышленно выпускаемыми препаратами на основе ПГМГ. В частности, композиция оказалась эффективной для дезинфекции вирусов.

Промышленная применимость и свойства полученной композиции иллюстрировались следующими примерами.

Пример 1. Получение и свойства композиций. К 1 кг ПГМГ-ГХ при температуре 100°С добавляли 1 л водного раствора, содержащего заданные количества FeSO₄ и иных вспомогательных веществ, после чего смесь выдерживали при перемешивании в течение 1-4 часов. Всплывшие на поверхность комплексы низкомолекулярных продуктов полимеризации удаляли механическим путем. Полученный продукт разбавляли до необходимой рабочей концентрации ПГМГ-ГХ.

Состав полученных образцов приведен в таблице 1.

Таблица 1Состав композиций№Время, чСостав композиции, % масс.ПГМГ-ГХFeSO₄неонолГМТПГЭмочевинаВода1 30,0001    96,99992 100.03    89,973 200,5    79,54 50,0155150.569,495 100,0110310363,996 50,01150.55569,49

Пример 2. Сопоставление бактерицидного действия композиций. На базе кафедры микробиологии, иммунологии и вирусологии Санкт-Петербургской медицинской академии им. И.И. Мечникова проводились сравнительные испытания биоцидного действия заявляемых композиций по примеру 1 путем исследования методом лунок в агаре. Результаты регистрировались по диаметру зоны отсутствия роста тест-микроорганизмов вокруг лунок до разведения 1/200 и по радиусу отсутствия роста вокруг разведений 1/500, 1/1000.

Использованные разведения препаратов: без разведения, 1/10, 1/20, 1/50, 1/100, 1/500, 1/1000.

Тест-микробами являлись бактерии - Staphylococcus aureus (St.aur), Escherichia coli (E.coli); плесневые грибы - Aspergillus fumigatus (Asp.fm), Penicillium chrysogenum (Pen.ch).

Результаты приведены в табл.2 и показывают зоны отсутствия роста в мм.

Таблица 2Влияние состава композиции на биоцидные характеристикиПрепаратб/рв1/101/201/1001/2001/5001/1000Комп.126181512101,52Комп.229201814132,54Комп.3281715121011,0Комп.432161411920,5Комп.529221712931,5Комп.6271816121021.5

Полученные результаты свидетельствуют, что наиболее эффективными являются композиции 2 и 5, на которых в дальнейшем были проведены основные исследования.

Пример 3. Сопоставление бактерицидного действия заявляемого и промышленно выпускаемых препаратов.

На базе кафедры микробиологии, иммунологии и вирусологии Санкт-Петербургской медицинской академии им. И.И. Мечникова проводились сравнительные испытания биоцидного действия препаратов ПГМГ-ГХ: Полисепт, композиция 2 по примеру 1 и Тефлекс при одинаковых концентрациях ПГМГ-ГХ.

В работе использовали метод десятикратных разведений веществ в бульоне (от 10^-1 до 10^-6 степени) с добавлением густой взвеси культур и последующей инкубацией при 37°С 18 ч для бактерий и дрожжеподобных грибов. Плесневые грибы после 18 часового инкубирования выдерживали при температуре 22°С пять суток. Результаты исследований показали, что минимальная ингибирующая концентрация цельных веществ составила:

Таблица 3.Влияние природы препаратов на основе ПГМГ-НХ на биоцидную активностьПрепаратS.aureusE.coliВас.antracisCandida spp.Scopulariosis spp.Полисепт2×10^-62×10^-32×10^-12×10^-32×10^-4Комп.22×10^-62×10^-42×10^-22×10^-52×10^-6Тефлекс2×10^-62×10^-32×10^-12×10^-32×10^-4

Полученные результаты показали, что заявляемая композиция обладает более высокими биоцидными характеристиками по сравнению с известными препаратами на основе ПГМГ-ГХ.

Пример 4. Сопоставлялось защитное действие хлорида (МЦ), фосфата (ФЦ) и ацетата (АЦ) ПГМГ, полученных по методике примера 1 для композиции №2.

Для проведения испытаний отбеленная целлюлоза нарезалась на квадраты (S=1 см²) и стерилизовалась в воздушном стерилизаторе при 180°С 60 мин. В предварительных экспериментах проверялась токсичность использованной целлюлозы для тест- штаммов микроорганизмов.

В эксперименте были использованы эталонные штаммы E.coli, S.aureus и B.subtilis var. anthracoides, применяемые для оценки качества дезинфектантов, а также штамм Aspergillus niger №23.

Рабочие растворы дезинфектантов готовили непосредственно перед использованием. Препарат МЦ растворяли в горячей стерильной водопроводной воде. Для приготовления рабочего раствора препарата ФЦ и АЦ концентрированный (20%) раствор препарата разводили стерильной водопроводной водой в 20 раз.

Испытываемые дезинфектанты за 24 часа до начала эксперимента наносили на стерильные тест-объекты из расчета 0,1 мл 1% раствора на один тест-объект, что соответствует дозе 1 мг/см² (10 г/м²). Объекты высушивали в термостате при 37°С. Оценку активности препаратов проводили через 1 сутки, 7 суток и 1 месяц после обработки тест-объектов.

Штаммы Е.coli и S.aureus выращивали на мясопептонном агаре при 37°С в течение 18-24 ч. В.subtilis var. anthracoides выращивали на этой же среде при 37°С 48 ч. Aspergillus niger № 23 выращивали на Сабуро-агаре при 37°С 48 ч, а затем при 22°С еще 48 ч. Рабочую суспензию микроорганизмов готовили путем последовательных 10-кратных разведений исходной суспензии с концентрацией 10⁹ КОЕ/мл (10 ед. по стандарту мутности). При проведении экспериментов микробная нагрузка составляла 10⁶ КОЕ/тест-объект. В качестве контроля использовали тест-объекты, не обработанные дезинфектантами. Были использованы две экспозиции тест-объектов, 1 ч и 24 ч. После экспозиции тест-объекты стерильным пинцетом переносили в пробирки и мясопептонным бульоном и инкубировали в термостате. Все эксперименты проводили в трех повторностях. Положительным результатом считали отсутствие роста в пробирках после инкубации. Полученные результаты приведены в табл.4.

Таблица 4.Антимикробная активность композиций на основе солей ГМПГ.Тест-микроорганизмЭкспозиция, чВремя после обработки, сутПрепаратМПФЦАЦЕ.coli1 ч1 сут+++++++++24 ч+++++++++1 ч7 сут+++++++++24 ч+++++++++1 ч30 сут+++++++++24 ч+++++++++S.aureus1 ч1 сут+++++++++24 ч+++++++++1 ч7 сут+++++++++24 ч+++++++++

 1 ч30 сут+++++++++24 ч+++++++++B.subtilis var. anthracoides1 ч1 сут++++++++-24 ч+++++++++1 ч7 сут++++++-++24 ч+++++++++1 ч30 сут+++++++++24 ч++++++++-Aspergillus niger №231 ч1 сут+++++++++24 ч+++++++++1 ч7 сут+++++++++24 ч+++++++++1 ч30 сут+++++++-+24 ч+++++++++

Полученные данные показали, что препараты МЦ, ФЦ и АЦ обладают выраженной гермицидной активностью, в том числе в отношении спорообразующих бактерий и плесеней.

Пример 5. В ФГУ «С. Петербургский НИИЭМ им. Пастера» МЗ РФ проводилось изучение возможности использования композиции в качестве противовирусного средства в соответствии с методиками, изложенными в сборнике "Методы испытаний дезинфекционных средств для оценки их безопасности и эффективности", М., 1998 г., ч.2. В качестве тест-вируса использовался вирус полиомиелита вакцинный 1-го типа, per. N ˜ 584/02, полученный из Коллекции Национального Института Биологических стандартов и контроля, Великобритания, код №95/602, титр вируса составляет 7,5 lg TCD₅₀.

Использовали клеточную культуру Нер-2, полученную из Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова.

Исследовали образец 5, полученный по примеру 1 в виде 3% раствора. Время экспозиции с дезинфектантом 30 мин, нейтрализатор - 80% сыворотка крупного рогатого скота (КРС).

В ходе исследования были проведены суспензионные опыты без белковой нагрузки и с белковой нагрузкой - 40% сывороткой КРС, а также осуществлялась обработка вируса дезинфицирующим средством и обработка после экспозиции смеси вируса с дезинфектантом и нейтрализатором.

Инфицирование чувствительных клеточных культур, обработанных вирусом, проводилось в ходе инкубации при 37°С в атмосфере 5% СО₂ и 98% влажности в течение 5-7 суток. При отсутствии ЦПД проводили дополнительно пассаж на клеточной культуре.

Использовали следующие контроли: клеточной культуры в течение всего периода наблюдения, вируса в раститровке от 10^-1 до 10^-7; дезинфектанта; нейтрализатора. Результаты исследований приведены в таблице 5.

Таблица 5Результаты изучения вирулицидного действия композиции 5СубстратыВремя обеззараживания, минТитр вируса в lg TCD₅₀ в экспериментах№ 1№ 2№ 3Вирус (контроль)-7,07,06,7Вирус без белковой нагрузки 30<1.0<1.0<1.0+ дезинфектант+ нейтрализаторВирус с белковой нагрузкой 30<1.0<1.0<1.0+ дезинфектант+ нейтрализатор

Показано, что композиция не обладает токсичностью для клеток. При этом обнаружено полное ингибирование репродуцирования вируса полиомиелита при 3% концентрации исследуемой композиции при экспозиции 30 мин.

Пример 6. В СПб ГУЗ «Городской диагностический центр (вирусологический)» были проведены испытания применения композиции №2 в качестве дезинфицирующего средства в отношении аденовируса.

Были использованы аденовирус 6 типа и перевиваемая клеточная культура НЕР-2, полученные из коллекции клеточных культур и вирусов НИИ гриппа РАМН. Предварительно аденовирус прошел 2 пассажа на тканевой культуре с целью восстановления инфекционной активности.

Для выполнения исследований выращивали клеточную культуру НЕР-2 в пенициллиновых флаконах с покровными стеклами. В качестве ростовой среды использовали среду Игла ДМЭМ с добавлением 10% сыворотки КРС, в качестве поддерживающей - среду Игла ДМЭМ с 2% КРС. Готовился рабочий раствор композиции 2 на основе дистиллированной воды. Для исследования брались равные объемы вирусной суспензии с разведении 10^-1 и дизенфиктанта, смешивали и оставляли для экспозиции на 30 мин.

Покровные стекла использовали для исследования методом флюоресцирующих антител (МФА) с аденовирусным флюоресцирующим диагностикумом производства НИИ гриппа РАМН, жидкую фазу - для исследования методом ПЦР на наличие ДНК аденовируса с использованием диагностического набора производства ЦНИИЭ МЗРФ.

1 мл смеси смешивали с 5 мл нейтрализатора - 0.5% раствора сульфонола и оставляли на 30 мин, после чего вводили по 0.2 мл смеси в пенициллиновые флаконы с клеточной культурой.

Одновременно выполнялись следующие контроли:

1. Клеточная культура незараженная.

2. Клеточная культура, зараженная вирусом с разведении 10^-1.

3. Клеточная культура с добавлением дезинфектанта (вместо суспензии вируса и нейтрализатора добавляется соответствующий объем среды).

4. Клеточная культура с добавлением нейтрализатора (вместо суспензии вируса и дезинфектанта добавляется соответствующий объем среды).

Флаконы выдерживали при 37°С, просмотр проводили под световым микроскопом ежедневно в течение 5 суток, отбор проб для исследований осуществляли в первые (через 24 часа после заражения) и пятые сутки. Методом световой микроскопии было показано, что в опыте на протяжении 5 суток деструкции клеточного монослоя не наблюдалось, методом МФА было показано, что специфическая гранулярная флюоресценция, локализованная в цитоплазме клеток НЕР-2 наблюдалась только в препарате - контроль вируса.

Аналогичные результаты были получены методом ПЦР. Результаты анализов свидетельствуют, что 3% раствор композиции в условиях нормальной протеиновой нагрузки обладает вирулицидной активностью в отношении аденовируса.

Анализ приведенных в примерах данных показал, что предлагаемая биоцидная композиция характеризуется более высокой эффективностью и широким спектром потенциального применения, в частности, для использования против вирусов, бактерий и различного рода грибов.

Изобретение относится к области медицины, ветеринарии, текстильной и строительной индустрии, а также смежным отраслям производства. Дезинфицирующее средство содержит полигексаметиленгуанидин гидрохлорид, соли двухвалентного железа и сильных кислот, водосодержащий растворитель. В качестве водосодержащего растворителя оно содержит воду или водный раствор с вспомогательными добавками, такими как неонол, гексаметилентетрамин, пропиленгликолевый эфир, мочевину. Изобретение обеспечивает более высокую бактерицидную эффективность и широкий спектр потенциального применения, в частности, для использования против вирусов, бактерий и различного рода грибов. 5 з.п. ф-лы, 5 табл., 1 ил.

1. Дезинфицирующее средство на основе солей полигексаметиленгуанидина и водосодержащего растворителя, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит от 0.001 до 2% ионов двухвалентного железа в расчете на полигексаметилен-гуанидин.2. Дезинфицирующее средство по п.1, отличающееся тем, что оно содержит следующие ингредиенты, мас.%:

Полигексаметиленгуанидин гидрохлорида3-50Солей двухвалентного железа0.001-5Водосодержащий растворительостальное

Полигексаметиленгуанидин гидрохлорид5-20Соли двухвалентного железа0,0001-0,5Неонол5-15Гексаметилентетрамин0.5-5Пропиленгликолевый эфир5-15Мочевина0.5-5Водаостальное