ПРИМЕНЕНИЕ ИНГИБИТОРА РАК ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ СУСТАВОВ Российский патент 2009 года по МПК A61K38/16 A61K39/395 A61P19/02 

Настоящее изобретение относится к применению ингибитора p21-активируемой киназы (PAK) для лечения такого заболевания суставов, как остеоартрит или ревматоидный артрит, или для лечения боли в суставах, и к применению PAK в качестве белка-мишени для поиска ингибитора PAK как лекарственного средства для лечения заболевания суставов.

Остеоартрит представляет собой самое распространенное состояние людей, приводящее к инвалидности, в западном мире. Вследствие старения популяции приходится сталкиваться с постоянно увеличивающейся популяцией пациентов, качеству жизни которых наносится значительный ущерб. Кроме того, заболевание влечет за собой значительное социоэкономическое бремя высоких прямых и косвенных затрат. Современные способы лечения нацелены на лечение боли, связанной с остеоартритом, но люди до сих пор лишены каких-либо фармакологических способов лечения, способных замедлить, остановить или даже обратить ход развития заболевания.

Остеоартрит можно рассматривать как клинический и патологический исход ряда заболеваний, приводящих в результате к структурному и функциональному нарушению синовиальных соединений. Остеоартрит возникает, когда нарушается динамическое равновесие между распадом и восстановлением тканей сустава. Структурное повреждение суставного хряща может возникать в результате чрезмерных механических нагрузок, повреждающих здоровый хрящ, а также в результате повреждения патологически измененного хряща, дегенерирующего под воздействием физиологических механических нагрузок. Морфологические изменения, наблюдаемые при остеоартрите, включают в себя эрозию хряща, а также синовиальное воспаление различной интенсивности. Эти изменения объясняют действием сложной сети биохимических факторов, включающих в себя протеолитические ферменты, приводящие к распаду макромолекул хряща. Такие цитокины, как IL-1 и TNFб, вырабатываемые активированными синовиоцитами, мононуклеарными клетками или самим суставным хрящом, значительно повышают синтез металлопротеиназ (MMP) и уровень экспрессии гена цитокина, и подавляют компенсаторные пути синтеза. Например, в регуляции экспрессии маркерных генов, имеющих отношение к остеоартриту, важную роль играет активация комплекса фактора транскрипции AP1 посредством IL-1 и/или TNFб через MAPK (митоген-активируемая протеинкиназа)-пути передачи сигнала.

Дополнительный биохимический фактор, вовлеченный в катаболизм хряща и возникновение боли при воспалении, представляет собой PGE2 (простагландин E2). PGE2, эйкозаноид, синтезируемый при посредстве циклооксигеназ (COX)-1 и -2, вовлечен в опосредуемую IL-1 деградацию протеогликана, и введение PGE2 пребывающим в сознании крысам или мышам вызывает повышенную чувствительность к боли. Эндогенная экспрессия IL-1Я приводит у человека к индукции COX-2 в суставе, пораженном остеоартритом.

Следовательно, остеоартрит характеризуется медленно прогрессирующей дегенерацией суставного хряща. Точная этиология остеоартрита еще до сих пор не известна, но, в целом, соглашаются, что деградация компонентов хрящевого матрикса происходит вследствие повышения синтеза и активации внеклеточных протеиназ, в основном, матриксных металлопротеиназ, и цитокинов, усиливающих дегенеративные процессы. Необходимы новые подходы к лечению остеоартрита, и прогресс в понимании биологии повреждений хряща привел к применению генов, продукты которых стимулируют восстановление хряща или ингибируют распад хрящевого матрикса. В нескольких исследованиях показывают, например, потенциальную важность регуляции активности IL-1 как способа снизить прогрессирующее развитие структурных изменений при остеоартрите.

Поэтому целью настоящего изобретения является открытие новых терапевтических подходов для устранения или снижения воздействия факторов, повреждающих хрящ.

Неожиданно установили, что PAK, особенно PAK1, представляет собой важный медиатор в вызываемой IL-1 активации путей передачи сигнала, приводящей к повышению экспрессии маркерных генов, имеющих отношение к остеоартриту.

PAK1 принадлежит к эволюционно-консервативному семейству серин/треониновых киназ, важных для множества клеточных функций, включающих в себя морфогенез клетки, подвижность, жизнеобеспечение, митоз и ангиогенез. PAK принадлежит к более крупному семейству протеинкиназ Ste20. Ste20p представляет собой предполагаемую киназу киназы киназы митоген-активируемой протеинкиназы дрожжей (MAP4K), вовлеченную в половой процесс у S. cerevisiae. Ее гомологи у млекопитающих, Drosophila, Caenorhabditis elegans и других организмов образуют большую пополняющуюся группу протеинкиназ, включающую в себя протеинкиназы человека. Киназы группы Ste20 дополнительно подразделяют на семейства p21-активируемой киназы (PAK) и киназы зародышевого центра (GCK). Они характеризуются наличием консервативного киназного домена и некаталитической области с высоким структурным разнообразием, что позволяет киназам взаимодействовать с различными сигнальными молекулами и регуляторными белками цитоскелета.

В нескольких публикациях была описана роль PAK в регуляции активности MAPK в клетках млекопитающих (см., например, Dan, C. et al. (2002) Mol. Cell Biol., 22, 567-577). Каскады MAPK очень важны для широкого ряда клеточных процессов передачи сигналов от внеклеточных стимулов, таких как факторы роста, цитокины и стрессовые воздействия внешней среды, для активации факторов транскрипции, приводящей к регуляции экспрессии гена (Johnson, G. L. and Lapadat, R. (2002) Science, 298, 1911-1912). Передача сигналов опосредуется линейным последовательным фосфорилированием комплекса трех киназ, включающего в себя киназу киназы MAP-киназы (MAP3K), киназу MAP-киназы (MAP2K) и MAPK. Комплекс трех киназ и механизм его активации высококонсервативен в процессе эукариотической эволюции от дрожжей до млекопитающих.

В клетках млекопитающих PAK выявляют как нижестоящие в каскаде передачи сигналов эффекторные молекулы-мишени Cdc42 и Rac1, а ее киназную активность посредством аутофосфорилирования стимулирует связывание Pak1 c GTPазами. PAK образуют специфические комплексы с активированным (связанным с GTP) p21, ингибируя GTPазную активность p21 и приводя к аутофосфорилированию и активации киназы. Киназы семейства PAK, консервативные от дрожжей до человека, напрямую активируются Cdc42 или Rac1 посредством взаимодействия с консервативным N-концевым мотивом (соответствующим остаткам с 71 по 137 в aPAK). Аутофосфорилированная киназа обладает пониженным сродством к Cdc42/Rac1, освобождая p21 для дальнейшей стимулирующей активности или снижения активности посредством белков, активирующих GTPазу (Manser, E. et al. (1994) Nature, 367, 40-46). Кроме Rac1 и Cdc42, активировать PAK и вызывать образование филоподий и растворение стрессовых волокон могут также недавно выявленные гомологи GTPаз семейства Rho, такие как Wrch-1 и Chp (Aronheim, A. et al. (1998) Curr. Biol. 8, 1125-1128). Факторы обмена гуанинового нуклеотида (GEF) и белки, активирующие GTPазу (GAP), которые регулируют GTP-GDP связанные состояния GTPаз семейства Rho, представляют собой важные определяющие факторы активируемой киназами PAK1 передачи сигнала вниз по каскаду (Zhou, K. et al. (1998) J. Biol. Chem., 273, 16782-16786).

Последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотная последовательность PAK1 указаны в SEQ ID №: 1 и 2, соответственно. Последовательности PAK1, необходимые для прочного связывания с Cdc42 и Rac, исследовали анализом свойств усеченных фрагментов и сайт-направленных мутантов, а также определением структуры раствора комплекса Cdc42 с гомологичным сегментом WASP (Burbelo, P. D. et al. (1995) J. Biol. Chem., 270, 29071-29074; Rudolph, M. G. et al. (1998) J. Biol. Chem., 273, 18067-18076; Abdul-Manan, N. et al. (1999) Nature, 399, 379-383). В аутоингибирование вовлечен сегмент, перекрывающий PBD (p21-связывающий домен) PAK1, но не совпадающий с ним (Zhao, Z. S. et al. (1998) Mol. Cell Biol, 18, 2153-2163; Lei, M. et al. (2000) Cell, 102, 387-397). Эта область ауторегуляции включает в себя домены переключения ингибирования и ингибирования киназы, препятствующие аутоактивации киназы (Lei, M. et al. (2000) Cell 102, 387-397). Мутации в области ауторегуляции приводят к образованию конститутивно-активных мутантов (Zhao, Z. S. et al. (1998), выше; Lei, M. et al. (2000) выше). Экпрессия в клетках млекопитающих домена ауторегуляции, включающего в себя аминокислоты 93-149 (PID для ингибиторного домена PAK) PAK1, предотвращает активацию посредством PAK1 нижестоящих в каскаде эффекторных молекул. Таким образом, совместная экспрессия этого ингибитора PAK и конститутивно-активной GTPазы Cdc42^G12V, активатора PAK1, предотвращает, например, образование периферических актиновых микрошипов и связанную с этим утрату стрессовых волокон, обычно вызываемую этим белком p21 (Zhao, Z. S. et al. (1998), выше).

В последних сообщениях ингибирование активности PAK1 в раковых клетках молочной железы связывали со снижением активности N-концевой киназы c-Jun, ингибированием ДНК-связывающей активности фактора транскрипции AP-1 и подавлением in vivo транскрипции, запускаемой промотором AP-1, для которого известно, что он вовлечен в инвазию рака молочной железы (Adam, L. et al. (2000) J. Biol. Chem., 275, 12041-12050). Кроме того, возбудитель гонореи Ngo вызывает активацию провоспалительных цитокинов через каскад киназ клеточного ответа на стресс, вовлекая PAK, направляющую сигнал к активации JNK и AP-1 от малых GTPаз семейства Rho (Naumann, M. et al. (1998) J. Exp. Med., 188, 1277-1286). Однако сообщения о возможной роли киназ семейства PAK в таком заболевании суставов, как остеоартрит, не поступало.

Поэтому один из предметов настоящего изобретения относится к применению ингибитора PAK для лечения заболевания суставов, особенно дегенеративного заболевания суставов, такого как остеоартрит, и/или воспалительного заболевания суставов, такого как ревматоидный артрит. Ингибитор PAK также можно применять для лечения боли в суставах, особенно снижая боль в суставах при дегенеративных заболеваниях суставов. Кроме того, ингибитор PAK можно применять для получения лекарственного средства для лечения заболевания суставов и/или для лечения боли в суставах, как указано выше.

Термин “ингибитор” по настоящему изобретению относится к биохимическому или химическому соединению, предпочтительно ингибирующему или снижающему серин/треонинкиназную активность PAK или экспрессию гена PAK или локализацию PAK в клетке, как описано, например, в Kiosses, W. B. et al. (2002) Circ. Research, April 5, 2002, 697-702. Серин/треонинкиназную активность можно измерять по стандартным протоколам, например, применяя HitHunter™ Serine/Threonine Kinase Assay of Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA. Экспрессию гена PAK можно измерять посредством RT-PCR или Вестерн-блот анализа, как описано в примерах настоящего изобретения.

Термин “PAK” относится к семейству серин/треониновых p21-активируемых киназ, включающих в себя, без ограничения, PAK1, PAK2, PAK3 и/или PAK4. Как описано выше, эти белки предпочтительно выступают в качестве мишеней малых GTP-связывающих белков Cdc42 и Rac. В частности, термин “PAK” относится к PAK человека, особенно PAK1 человека. Последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот PAK1 человека указаны в SEQ ID №: 1 и 2, соответственно. Аминокислотные последовательности PAK 2, 3 и 4 человека указаны в SEQ ID №: 3, 4 и 5, соответственно. Последовательности генов, кодирующие эти PAK человека, можно легко получить, применяя генетический код. Уникальные идентификаторы банка генов для PAK1, 2, 3 и 4 человека представляют собой NP_002567, Q13177, NP_002569 и NP_005875, соответственно. Не относящиеся к человеку гомологи можно отделять, используя последовательности генов PAK1, 2, 3 или 4 человека, применяя известные специалисту в этой области способы, например, амплификацию PCR или гибридизацию в строгих условиях (например, 60°C в 2,5Ч буфере SSC с последующими несколькими стадиями промывки в буфере с низкой концентрацией при 37°C) с приемлемыми образцами, полученными стандартными лабораторными способами, например, из последовательностей PAK человека.

Примеры таких ингибиторов PAK представляют собой ингибиторный домен PAK1 с аминокислотной последовательностью HTIHVGFDAV TGEFTGMPEQ WARLLQTSNI TKSEQKKNPQ AVLDVLEFYN SKKTSNSQKY MSFTDKS (SEQ ID №: 6), пептид PAK1 с аминокислотной последовательностью KPPAPPMRNT STM (SEQ ID №: 7), слитый белок Tat-PAK с аминокислотной последовательностью YGRKKRRQRR RGKPPAPPMR NTSTM (SEQ ID №: 8), связывающие белки или связывающие пептиды, направленные против PAK, особенно против активного участка PAK, нуклеиновые кислоты, направленные против гена PAK или самой PAK, химическую молекулу, предпочтительно малую молекулу, и/или экстракт естественного продукта.

Термин “химическая молекула” по настоящему изобретению включает в себя неполимерные органические соединения, липиды, углеводы, пептиды, предпочтительно пептиды с приблизительно от 10 до приблизительно 80 аминокислот, особенно от 10 до 25 аминокислот, и олигонуклеотиды, предпочтительно с приблизительно от 10 до приблизительно 90 нуклеотидов, особенно от 15 до 25 нуклеотидов. Особенно предпочтительны малые химические молекулы, особенно неполимерные органические соединения как синтезируемые в лаборатории, так и встречающиеся в природе, с предпочтительным молекулярным весом приблизительно от 200 г/моль до приблизительно 1500 г/моль, особенно от 400 г/моль до 1000 г/моль.

Альтернативно, ингибитор по настоящему изобретению может быть в виде экстракта естественного вещества как в неочищенном, так и в очищенном виде. Экстракт можно получать стандартными способами, такими как экстракция водой и/или спиртом и/или органическим растворителем, и/или хроматография на колонке и/или преципитация из животного, растительного или бактериального источника, подобного яду змеи, листьям или жидким продуктам бактериального брожения.

Термин "связывающий белок" или "связывающий пептид" относится к классу белков или пептидов, которые связывают и ингибируют PAK, включающих в себя, без ограничения, поликлональные или моноклональные антитела, фрагменты антитела и поддерживающие белки, направленные против PAK, например антикалины, направленные против PAK.

Процедуру получения антитела или фрагмента антитела осуществляют хорошо известными специалисту способами, например, иммунизацией PAK млекопитающего, например, кролика, в присутствии, когда это целесообразно, например, адъюванта Фрейнда и/или гелей гидроксида алюминия (см., например, Diamond, B.A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine: 1344-1349). Поликлональные антитела, формирующиеся у животного в результате иммунологической реакции, можно последовательно выделять из крови, применяя хорошо известные способы, и, например, очищать хроматографией на колонке. Моноклональные антитела можно получать, например, известным способом Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299).

Термин "антитело" или "фрагмент антитела" по настоящему изобретению также понимают как обозначение полученных рекомбинантно и измененных, когда это целесообразно, антител или их частей, связывающих антиген, таких как химерные антитела, антитела, сходные с человеческими, многофункциональные антитела, биспецифические или олигоспецифические антитела, одноцепочечные антитела и фрагменты F(ab) или F(ab)₂ (см., например, EP-B1-0368684, US 4816567, US 4816397, WO 88/01649, WO 93/06213 или WO 98/24884).

В качестве альтернативы классическим антителам также возможно, например, применение поддерживающих белков против PAK, например, антикалинов на основе липокалина (Beste et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1898-1903). Естественные участки липокалинов, связывающие лиганд, например, белок, связывающий ретинол, или белок, связывающий билин, можно изменять, например, способом "комбинаторного дизайна белка" таким образом, что они связывают выбранные гаптены, здесь PAK (Skerra, 2000, Biochim. Biophys. Acta, 1482, 337-50). В качестве альтернатив антителам для молекулярного распознавания признаны другие известные поддерживающие белки (Skerra (2000) J. Mol. Recognit., 13, 167-187).

Термин "нуклеиновые кислоты против гена PAK или самой PAK" относится к двухцепочечной или одноцепочечной ДНК или РНК, ингибирующей, например, экспрессию гена PAK или активность PAK, и включает в себя, без ограничения, антисмысловые нуклеиновые кислоты, аптамеры, миРНК (малые интерферирующие РНК) и рибозимы.

Нуклеиновые кислоты, например, антисмысловые нуклеиновые кислоты, можно синтезировать химически, например, фосфотриэфирным способом (см., например, Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543-584). Аптамеры представляют собой нуклеиновые кислоты, с высокой аффинностью связывающиеся с полипептидом, здесь PAK. Аптамеры можно выделять из широкого ряда различных одноцепочечных молекул РНК такими способами селекции, как SELEX (см., например, Jayasena (1999) Clin. Chem., 45, 1628-50; Klug and Famulok (1994) M. Mol. Biol. Rep., 20, 97-107; US 5582981). Также, аптамеры можно синтезировать и выбирать в их зеркальных формах, например, как L-рибонуклеотид (Nolte et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1116-9; Klussmann et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1112-5). Выделенные таким способом формы обладают тем преимуществом, что их не разрушают встречающиеся в естественных условиях рибонуклеазы, и поэтому они более стабильны.

Эндонуклеазы или экзонуклеазы, особенно ДНКазы и РНКазы, которые можно обнаружить в клетке, могут разрушать нуклеиновые кислоты. Поэтому нуклеиновые кислоты целесообразно модифицировать для придания им устойчивости к разрушению, обеспечивая тем самым поддержание высокой концентрации нуклеиновых кислот в клетке на протяжении длительного периода времени (Beigelman et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:3989-94; WO 95/11910; WO 98/37240; WO 97/29116). Как правило, такой стабильности можно достичь введением одной или более межнуклеотидных фосфатных групп или введением одной или более нефосфатных межнуклеотидных групп.

Приемлемые модифицированные межнуклеотидные группы указаны в Uhlmann and Peyman (1990), выше (см. также Beigelman et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:3989-94; WO 95/11910; WO 98/37240; WO 97/29116). Модифицированные межнуклеотидные фосфатные радикалы и/или нефосфатные мостики в нуклеиновой кислоте, которые можно использовать в одном из применений по изобретению, включают в себя, например, метиловый эфир фосфиновой кислоты, фосфотиоат, фосфоамидат, фосфодитиоат и/или сложные эфиры фосфорной кислоты, тогда как нефосфатные межнуклеотидные аналоги включают в себя, например, силоксановые мостики, карбонатные мостики, карбоксиметиловые сложные эфиры, ацетамидатные мостики и/или тиоэфирные мостики. Также подразумевают, что эта модификация улучшит устойчивость фармацевтической композиции, которую можно использовать в одном из применений по изобретению.

Применение приемлемых антисмысловых нуклеиновых кислот дополнительно описано, например, в Zheng and Kemeny (1995) Clin. Exp. Immunol., 100, 380-2; Nellen and Lichtenstein (1993) Trends Biochem. Sci., 18, 419-23, Stein (1992) Leukemia, 6, 697-74 или Yacyshyn, B. R. et al. (1998) Gastroenterology, 114, 1142).

Получение и применение миРНК в качестве средств для интерференции РНК в процессе снижения или выключения экспрессии гена, здесь экспрессии гена PAK, описано, например, в Elbashir, S. M. et al. (2001) Genes Dev., 15, 188 или Elbashir, S. M. et al. (2001) Nature, 411, 494.

Рибозимы также представляют собой приемлемые средства для ингибирования трансляции нуклеиновых кислот, здесь гена PAK, поскольку они способны специфически связывать и разрезать мРНК. Они описаны, например, в Amarzguioui et al. (1998) Cell. Mol. Life Sci., 54, 1175-202; Vaish et al. (1998) Nucleic Acids Res., 26, 5237-42; Persidis (1997) Nat. Biotechnol., 15, 921-2 или Couture and Stinchcomb (1996) Trends Genet., 12, 510-5.

Таким образом, указанные нуклеиновые кислоты можно применять для ингибирования или снижения экспрессии генов PAK в клетках, как in vivo, так и in vitro, и, следовательно, для применения в качестве ингибитора PAK в смысле настоящего изобретения. Для применения в качестве антисмыслового олигонуклеотида или рибозима предпочтительны одноцепочечная ДНК или РНК, соответственно. Для получения лекарственного средства, как правило, в рецептуру, в зависимости от способа введения, включают ингибиторы PAK по настоящему изобретению вместе с одной или более фармацевтически приемлемыми добавками или вспомогательными веществами, такими как физиологический буферный раствор, например раствор хлорида натрия, деминерализованная вода, стабилизаторами, такими как ингибиторы протеазы или нуклеазы, предпочтительно апротинин, е-аминокапроновая кислота или пепстатин A, или комплексообразующими веществами, такими как ЭДТА, препаратами геля, такими как белый вазелин, парафин с низкой вязкостью и/или желтый воск, и т.д.

Дополнительно, приемлемые добавки представляют собой, например, детергенты, такие как, например, Triton X-100 или дезоксихолат натрия, а также многоатомные спирты, такие как, например, полиэтиленгликоль или глицерин, сахара, такие как, например, сахароза или глюкоза, цвиттерионные соединения, такие как, например, аминокислоты, такие как глицин или, особенно, таурин или бетаин, и/или белок, такой как, например, альбумин бычьей или человеческой сыворотки. Предпочтительны детергенты, многоатомные спирты и/или цвиттерионные соединения.

Предпочтительно, pH физиологического буферного раствора составляет приблизительно 6,0-8,0, особенно, приблизительно pH 6,8-7,8. особенно, приблизительно pH 7,4, и/или осмолярность составляет приблизительно 200-400 миллиосмоль/литр, предпочтительно приблизительно 290-310 миллиосмоль/литр. Как правило, pH лекарственного средства достигают, применяя приемлемый органический или неорганический буфер, такой как, например, предпочтительно используемый фосфатный буфер, трис-буфер (трис(гидроксиметил)аминометан), буфер HEPES ([4-(2-гидроксиэтил)пиперазино]этансульфокислота) или буфер MOPS (3-морфолино-1-пропансульфокислота). Выбор соответствующего буфера, как правило, зависит от желаемой молярной концентрации буфера. Для инъекционных и инфузионных растворов приемлем, например, фосфатный буфер.

Лекарственное средство можно вводить общепринятым способом, например, в виде лекарственного средства для перорального применения, такого как, например, таблетки или капсулы, через слизистые оболочки, например, полости носа или рта, в виде диспозиторий, имплантированных под кожу, посредством инъекций, инфузий или гелей, содержащих лекарственные средства по изобретению. Кроме того, для лечения конкретного заболевания суставов, как указано выше, лекарственное средство можно вводить местно или локально, при необходимости в виде липосомных комплексов. Более того, лечение можно проводить, применяя трансдермальную терапевтическую систему (TTS), обеспечивающую возможность контролируемого по времени высвобождения лекарственных средств. TTS известны из, например, EP 0944398 A1, EP 0916336 A1, EP 0889723 A1 или EP 0852493 A1.

Как правило, инъекционные растворы применяют, если в организм следует ввести только относительно малые количества раствора или суспензии, например, приблизительно от 1 до приблизительно 20 мл. Инфузионные растворы, как правило, применяют, если следует ввести большее количество раствора или суспензии, например, один или более литров. Поскольку, в отличие от инфузионного раствора, в случае инъекционных растворов вводят только несколько миллилитров, незначительные отличия pH и осмотического давления инъекционного раствора от таковых крови или тканевой жидкости не становятся заметными в отношении болевых ощущений или становятся заметными в незначительной степени. Поэтому, как правило, в разведении препарата по изобретению перед применением необходимости нет. Однако в случае введения относительно больших количеств, препарат по изобретению следует за короткий период времени перед введением развести до такой степени, чтобы получить, по крайней мере приблизительно, изотонический раствор. Пример изотонического раствора представляет собой раствор хлорида натрия с концентрацией 0,9%. В случае инфузии разведение можно выполнять, применяя, например, стерильную воду, а введение осуществлять, например, так называемым обходным путем.

Указанные выше нуклеиновые кислоты можно применять в "голой" форме, в виде векторов для переноса генов или в комплексе с липосомами или частицами золота.

Примеры векторов для переноса генов представляют собой вирусные векторы, например, аденовирусные векторы или ретровирусные векторы (Lindemann et al. (1997), Mol. Med., 3, 466-76; Springer et al. (1988) Mol. Cell., 2, 549-58). Как правило, применение комплексов с липосомами приводит к очень высокой эффективности трансфекции, особенно в клетках кожи (Alexander and Akhurst, 1995, Hum. Mol. Genet. 4:2279-85). При липофекции небольшие однослойные везикулы, состоящие из катионных липидов, получают обработкой суспензии липосом ультразвуком. ДНК посредством ионных взаимодействий удерживается на поверхности липосом в таком количестве, что суммарный заряд остается положительным, а вся плазмидная ДНК образует комплекс с липосомами. В дополнение к смесям липидов DOTMA (бромид 1,2-диолеилоксипропил-3-триметиламмония) и DOPE (диолеоилфосфатидилэтаноламин), применяемым Felgner, P. L. et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 84, 7413-7414, к настоящему времени синтезировали большое количество препаратов липидов и проверили их эффективность в трансфекции различных линий клеток (Behr et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6982-6986; Gao and Huang (1991), Biochim. Biophys. Acta, 1189, 195-203; Felgner et al. (1994) J. Biol. Chem., 269, 2550-2561). Примеры препаратов липидов представляют собой DOTAP (метилсульфат N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония) или DOGS (диоктадециламидоглицилспермин).

Вспомогательные вещества, повышающие перенос нуклеиновых кислот в клетку, могут представлять собой, например, белки или пептиды, связывающиеся с ДНК или синтетическими молекулами пептид-ДНК, что обеспечивает возможность транспорта нуклеиновой кислоты в ядро клетки (Schwartz et al. (1999) Gene Therapy 6:282; Brandén et al. (1999) Nature Biotech., 17, 784). Также, вспомогательные вещества включают в себя молекулы, обеспечивающие возможность высвобождения нуклеиновых кислот в цитоплазме клетки (Planck et al. (1994) J. Biol. Chem., 269, 12918; Kichler et al. (1997) Bioconj. Chem., 8, 213) или, например, липосомы (Uhlmann and Peyman (1990), выше).

Другую, особенно приемлемую форму можно получать нанесением указанных выше нуклеиновых кислот на частицы золота и выстреливанием этими частицами в ткани или клетки, используя то, что обозначают термином "генный пистолет" (Wang et al. (1999) J. Invest. Dermatol. 112:775-81, Tuting et al. (1998) J. Invest. Dermatol. 111:183-8).

Другой предмет настоящего изобретения относится к применению PAK или гена PAK в качестве мишени для поиска ингибитора PAK для лечения заболевания суставов, особенно такого дегенеративного заболевания суставов, как остеоартрит, или такого воспалительного заболевания суставов, как ревматоидный артрит, и/или для лечения боли в суставах, особенно снижая боль в суставах при дегенеративных заболеваниях суставов. Предпочтительно, ингибитор PAK можно применять в виде лекарственного средства, как описано выше.

Соответственно, настоящее изобретение также относится к способу скрининга ингибитора PAK, где способ содержит стадии:

(a) предоставления PAK или гена PAK,

(b) предоставления тестируемого соединения, и

(c) измерения или выявления воздействия тестируемого соединения на PAK или ген PAK.

Как правило, PAK или ген PAK предоставляют, например, в системе анализа и приводят, непосредственно или косвенно, в контакт с тестируемым соединением, особенно биохимическим или химическим тестируемым соединением, например, в виде библиотеки химических соединений. Затем измеряют или выявляют воздействие тестируемого соединения на PAK или ген PAK. После этого можно анализировать и/или выделять приемлемые ингибиторы. Для скрининга библиотек химических соединений предпочтительно применение известных специалисту или коммерчески доступных высокопроизводительных систем анализа.

Термин "библиотека химических соединений" по настоящему изобретению относится к множеству химических соединений, полученных из любого из многочисленных источников, включая в себя химически синтезированные молекулы и естественные вещества, или полученных способами комбинаторной химии.

Как правило, воздействие тестируемого соединения на PAK или ген PAK измеряют или выявляют гетерогенным или гомогенным анализом. Как применяют здесь, гетерогенный анализ представляет собой анализ, включающий в себя одну или более стадий промывки, тогда как в гомогенном анализе нет необходимости в таких стадиях промывки. Реагирующие вещества и соединения только смешивают и измеряют.

Приемлемые функциональные анализы могут быть основаны на экспрессии гена PAK, прямой активации PAK такими GTPазами, как Cdc42, Rac1, Wrch-1 или Chp, или образовании комплекса с активированным (связанным с GRP) p21. При наличии биохимического или химического соединения, которое следует проверить как ингибитор PAK, экспрессию гена, прямую активацию или образование комплекса с другими белками, например белками клетки, как, например, указано выше, можно измерять способами, как правило, известными специалисту. Как правило, в коммерчески доступных системах киназного анализа количественным способом регистрируют количество фосфата, которое включил в себя субстрат.

Например, предотвращение образования периферических актиновых микрошипов и связанной с ним утраты стрессовых волокон можно измерять, как указано в Zhao, Z. S. et al. (1998), выше.

Гетерогенные анализы представляют собой, например, анализы ELISA, DELFIA, SPA и анализы в планшете для сцинтилляции.

Различные компании предлагают анализы на основе ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ). В анализе применяют выбранные случайным образом пептиды, которые может фосфорилировать киназа, такая как PAK. Как правило, образцы, содержащие киназу, разводят в буфере для реакции, содержащем, например, ATP и необходимые катионы, а затем добавляют в лунки планшета. Реакции останавливают простым удалением смесей. Затем промывают планшеты. Реакцию запускают, например, добавлением к киназе биотинилированного субстрата. После реакции добавляют специфическое антитело. Как правило, образцы переносят в планшеты, предварительно заблокированные G-белком, и после промывки добавляют, например, стрептавидин-HRP. Затем удаляют несвязавшийся стрептавидин-HRP (пероксидаза хрена), запускают пероксидазную цветную реакцию добавлением субстрата пероксидазы и измеряют в приемлемом денситометре оптическую плотность.

Анализы на основе DELFIA (флуоресцентный иммунный анализ с усиленной диссоциацией лантанидов) представляют собой твердофазные анализы. Как правило, антитело метят европием или другим лантанидом и, после отмывки несвязавшихся антител, меченных европием, регистрируют флуоресценцию европия.

Как правило, в SPA (сцинтилляционный проксимальный анализ) и в анализе в планшете для сцинтилляции для улавливания меченных радиоактивным изотопом субстратов используют взаимодействия биотин/авидин. Как правило, реакционная смесь включает в себя киназу, биотинилированный пептид в качестве субстрата и г-[P³³]ATP. После реакции стрептавидин улавливает биотинилированные пептиды. При регистрации посредством SPA стрептавидин связывают на содержащих сцинтиллятор каплях, тогда как при регистрации посредством планшета для сцинтилляции стрептавидин связывают с внутренней стороной лунок микропланшетов, содержащих сцинтиллятор. Однажды зафиксированный, субстрат, меченный радиоактивным изотопом, достаточно сближен со сцинтиллятором, чтобы стимулировать излучение света.

Альтернативные гомогенные анализы, представляют собой, например, TR-FRET, FP, ALPHA и генные анализы.

Анализы на основе TR-FRET (резонансный перенос энергии флуоресценции с разрешением во времени) представляют собой анализы, в которых, как правило, используют резонансный перенос энергии флуоресценции между европием и APC, модифицированным аллофикоцианином, или другими красителями с перекрывающимся спектром, такими как Cy3/Cy5 или Cy5/Cy7 (Schobel, U. et al. (1999) Bioconjugate Chem. 10, 1107-1114). После возбуждения, например, европия светом длиной волны 337 нм молекула флуоресцирует на длине волны 620 нм. Но если этот флуорофор достаточно сближен с APC, европий передаст свою энергию возбуждения APC, флуоресцирующему на длине волны 665 нм. Киназный субстрат, как правило, представляет собой субстрат, меченный биотином. После киназной реакции добавляют вместе со стрептавидин-APC (P)-специфические антитела, меченные европием. Фосфорилированные пептиды приводят в близкий контакт меченное европием антитело и стрептавидин-APC. Непосредственная близость APC к флуорофору европию приводит к гашению флуоресценции европия, способствуя флуоресценции APC (FRET).

Анализы на основе поляризации флуоресценции (FP) представляют собой анализы, в которых для возбуждения флуоресцентного субстрата в виде пептидов в растворе используют поляризованный свет. Эти флуоресцентные пептиды находятся в растворе в свободном вращающемся состоянии, приводя к деполяризации излучаемого света. Когда пептид в качестве субстрата связывается с большей молекулой, такой как (P)-Tyr, скорость его вращения значительно снижается, и излучаемый свет остается высокополяризованным. Как правило, для киназного анализа существуют два варианта:

(a) (P)-специфическое антитело связывают с флуоресцентной фосфопептидной меткой. Фосфорилированные продукты конкурируют за флуоресцентный фосфопептид из антитела, приводя к изменению поляризации с высокой до низкой.

(b) Фосфорилированный пептид в качестве субстрата связывается с фосфоспецифическим антителом, приводя к изменению поляризации с низкой до высокой.

Анализы на основе ALPHA (гомогенный анализ с усиленной при сближении люминесценцией) представляют собой анализы, основывающиеся на передаче синглетного кислорода между донорной и акцепторной каплями, приводящимися в пространственную близость фосфорилированным пептидом. При возбуждении на 680 нм фотосенсибилизаторы в донорных каплях переводят атмосферный кислород в кислород в синглетном состоянии, диффундирующий на расстояние в 200 нм. Хемилюминесцентные группы в акцепторных каплях передают энергию на флуоресцентные акцепторы в капле, которые затем излучают свет длиной волны приблизительно 600 нм.

Для высокопроизводительного скрининга соединений, в частности, можно применять анализы на основе EFC (комплементация фрагментов фермента) или эквивалентные анализы. Анализ EFC основан на сконструированном ферменте в-галактозидазе, содержащем два фрагмента - акцептор фермента (EA) и донор фермента (ED). Когда фрагменты разделены, в-галактозидазная активность отсутствует, но когда фрагменты соединены вместе, они взаимодействуют (дополняют), образуя активный фермент. В анализе EFC применяют конъюгат ED-анализируемое вещество, в котором анализируемое вещество можно распознать посредством специфически связывающегося белка, такого как антитело или рецептор. В отсутствие специфически связывающегося белка конъюгат ED-анализируемое вещество способен дополнять EA, образуя активную в-галактозидазу, дающую положительный люминесцентный сигнал. Если специфически связывающийся белок связывает конъюгат ED-анализируемое вещество, то комплементация EA предотвращается, и сигнал отсутствует. Если анализируемое вещество предоставляют в свободном состоянии (в образце), то оно конкурирует с конъюгатом ED-анализируемое вещество за связь со специфически связывающимся белком. Анализируемое вещество в свободном состоянии высвобождает конъюгат ED-анализируемое вещество для комплементации EA, давая сигнал, зависящий от присутствующего в образце количества анализируемого вещества в свободном состоянии.

Пример генного анализа представляет собой двухгибридная система анализа (Fields and Sternglanz (1994) Trends in Genetics, 10, 286-292; Colas and Brent (1998) TIBTECH, 16, 355-363). В этом анализе клетки трансформируют векторами экспрессии, которые экспрессируют слитые белки, состоящие из полипептида по изобретению и ДНК-связывающего домена фактора транскрипции, такого как Gal4 или LexA. Трансформированные клетки дополнительно содержат ген-репортер, промотор которого включает в себя участки связывания с соответствующим ДНК-связывающим доменом. Если второй слитый белок взаимодействует с полипептидом, экспрессию гена-репортера можно значительно повысить трансформацией другим вектором экспрессии, который экспрессирует второй слитый белок, содержащий известный или неизвестный полипептид и домен активации, например, из Gal4 или вируса простого герпеса VP16. Следовательно, эту систему анализа можно применять для скрининга биохимических или химических соединений, ингибирующих взаимодействие между PAK и, например, GTPазами, такими как Cdc42, Rac1, Wrch-1 или Chp, или активированным (связанным с GTP) p21 (см., например, Vidal and Endoh (1999) Trends in Biotechnology, 17, 374-81). Таким образом, возможно быстро установить новые активные соединения, которые можно применять для лечения заболеваний суставов.

Альтернативно, в случае, когда тестируемое соединение представляет собой белок или пептид, для измерения или выявления воздействия тестируемого соединения на PAK можно применять совместную экспрессию этого тестируемого соединения с такой GTPазой, как Rac1, Wrch-1, Chp или конститутивно активная Cdc42, в качестве активатора PAK в присутствии PAK, например, как указано в Zhao, Z.S. et al. (1998), выше.

Другой пример генного анализа представляет собой функциональный анализ, где активность киназы преобразуют в функциональный ответ клетки, такой как рост, блокирование роста, дифференцировка или апоптоз. Для этого способа скрининга особенно приемлемую модельную систему представляют собой дрожжи. Например, в PAK1-дрожжевом функциональном анализе, при культивировании на содержащей глюкозу среде, например, клетки PAK1-дрожжей растут как обычные клетки дрожжей. Однако воздействие галактозы вызывает внутриклеточную экспрессию PAK1, приводящую клетку дрожжей к гибели. Соединения, ингибирующие активность PAK1, в этом случае предотвращают гибель клетки.

Другой анализ основан на связанных с твердой фазой полипептидах, таких как PAK, GTPазы, такие как Cdc42, Rac1, Wrch-1 или Chp, или активированный (связанный с GTP) p21, и на интерференции с соединениями, которые следует проанализировать. Таким образом, тестируемое соединение содержит, например, поддающийся обнаружению маркер, например, соединение может быть с радиоактивной меткой, флуоресцентной меткой или люминесцентной меткой, как уже указано выше. Кроме того, соединения могут быть связаны с белками, позволяющими косвенное обнаружение, например, посредством ферментативного катализа с применением пероксидазного анализа, в котором используют хромогенный субстрат, или посредством связывания поддающегося обнаружению антитела. Другая возможность представляет собой исследование комплексов белков, связанных с твердой фазой, масс-спектрометрией (SELDI). Изменения в конформации, например, PAK или других белков, указанных выше, как результат взаимодействия с тестируемым веществом можно обнаружить, например, посредством изменения флуоресценции эндогенного остатка триптофана в полипептиде.

Также, полипептиды, связанные с твердой фазой, могут быть частью матрицы. Способы получения таких матриц с применением химии твердой фазы и фотолабильных защитных групп описаны, например, в US 5744305. Также, эти матрицы можно приводить в контакт с тестируемым соединением или библиотеками соединений и анализировать на взаимодействие, например на связывание или изменение конформации.

В другом осуществлении настоящего изобретения способ выполняют, используя целые клетки. Как правило, растущие на дне многолуночных планшетов клетки фиксируют и делают проницаемыми, блокируют и инкубируют, например, с первичным (P)-специфическим антителом против представляющего интерес субстрата. Затем для образования сигнала применяют, например, меченные европием или связанные с HRP вторичные антитела в сочетании со специфическими хемилюминесцентными или цветными веществами, например, как указано выше. В сочетании с использованием микроскопа можно определить на уровне одной клетки не только количество (P)-специфических антител, но также и вызываемые фосфорилированием перемещения субстрата или морфологические изменения клеток.

Преимущественно, способ по настоящему изобретению осуществляют в роботизированных системах, например, включающих в себя роботизированное нанесение покрытия и роботизированную систему переноса жидкости, например, используя микрожидкостные технологии, т.е. формирование структуры с каналами.

В другом осуществлении настоящего изобретения способ выполняют в виде высокопроизводительной системы скрининга. В такой системе способ скрининга, преимущественно, автоматизирован и миниатюризирован, в частности в нем используют миниатюризированные лунки и контролируемые роботом микрожидкостные технологии.

В другом осуществлении настоящее изобретение также относится к способу получения лекарственного средства для лечения заболевания суставов, особенно, дегенеративного заболевания суставов, такого как остеоартрит, или воспалительного заболевания суставов, такого как ревматоидный артрит, и/или для лечения боли в суставах, особенно, снижая боль в суставах при дегенеративных заболеваниях суставов, где способ содержит стадии:

(a) выполнения способа по любому из пп.13-19 формулы изобретения,

(b) выделения измеренного или выявленного тестируемого соединения, приемлемого для лечения заболевания суставов и/или боли в суставах, и

(c) составления рецептуры измеренных или выявленных тестируемых соединений с одним или более фармацевтически приемлемых носителей или вспомогательных веществ, например, указанных выше.

Следующие фигуры, последовательности и примеры поясняют настоящее изобретение, не ограничивая объем изобретения.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1A-C показана экспрессия PAK1 в экстрактах клеток HEK293 и в первичных хондроцитах человека.

Экстракты клеток HEK293 человека, а также первичные хондроциты человека, полученные из хрящей пациентов с остеоартритом и из контрольных хрящей, разделяли двухмерным электрофорезом в геле. Белки переносили Вестерн-блотом на мембраны PVDF и выявляли PAK1 посредством специфического антитела.

На фиг.2 показано, что сверхэкспрессия PAK1-ID подавляет вызываемую IL-1в экспрессию MMP13 в клетках SW1353 человека.

Ингибиторный домен PAK1 субклонировали в вектор pCEP4 и трансфицировали в клетки SW1353. В качестве стимулирующего вещества, где указано, применяли IL-1в в концентрации 10 нг/мл в течение 24 часов. Собирали супернатанты и определяли посредством ELISA количество белка MMP13. Величины представлены в условных единицах и отражают по крайней мере 3 независимых результата ±SD. Заштрихованная в клетку колонка отражает эксперименты с вектором pCEP4 (пустой вектор), а черная колонка отражает эксперименты с вектором pCEP4_PAK1-ID.

На фиг.3 показано, что сверхэкспрессия PAK1-ID подавляет вызываемую IL-1в экспрессию PGE2 в клетках SW1353 человека.

Ингибиторный домен PAK1 субклонировали в вектор pCEP4 и трансфицировали в клетки SW1353. Клетки стимулировали 24 часа сочетанием IL-1в и TNFб, оба в концентрации 10 нг/мл. Собирали супернатанты и определяли посредством ELISA количество белка MMP13. Величины в условных единицах представляют собой среднее значение двух экспериментов. Пунктирная колонка отражает эксперименты с наличием IL-1в и TNFб и отсутствием вектора. Заштрихованная в клетку колонка отражает эксперименты с вектором pCEP4 (пустой вектор) и наличием IL-1в и TNFб. Черная колонка отражает эксперименты с вектором pCEP4_PAK1-ID и наличием IL-1в и TNFб.

На фиг.4 показано, что сверхэкспрессия PAK1-ID подавляет вызываемую IL-1в экспрессию IL-8 в клетках HEK293 человека.

Субклонированный в вектор pCDNA3.1 ингибиторный домен PAK1 в течение короткого времени трансфицировали в клетки HEK293. В течение указанных периодов времени клетки стимулировали, применяя IL-1в в концентрации 10 нг/мл. Собирали супернатанты и определяли посредством ELISA количество белка IL-8. Величины в условных единицах представляют собой среднее значение двух экспериментов. Круги отражают эксперименты с вектором pCDNA3.1_PAK1-ID и наличием IL-1в, а квадраты отражают эксперименты с вектором pCDNA3.1 (пустой вектор) и наличием IL-1в.

ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID №: 1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты PAK1.

SEQ ID №: 2 представляет собой аминокислотную последовательность PAK1.

SEQ ID №: 3 представляет собой аминокислотную последовательность PAK2.

SEQ ID №: 4 представляет собой аминокислотную последовательность PAK3.

SEQ ID №: 5 представляет собой аминокислотную последовательность PAK4.

SEQ ID №: 6 представляет собой аминокислотную последовательность ингибиторного домена PAK1 (PAK1-ID).

SEQ ID №: 7 представляет собой аминокислотную последовательность богатой пролином ингибиторной последовательности PAK1 по Kiosses, W. B. (2002), выше.

SEQ ID №: 8 представляет собой аминокислотную последовательность синтетического пептида, содержащего последовательность богатого пролином PAK1, слитую с многоосновной последовательностью из белка Tat HIV, по Kiosses, W. B. (2002), выше.

SEQ ID №: 9 представляет собой первый праймер PCR, направленный к консервативным последовательностям кДНК PAK1 человека и мыши.

SEQ ID №: 10 представляет собой второй праймер PCR, направленный к консервативным последовательностям кДНК PAK1 человека и мыши.

SEQ ID №: 11 представляет собой первый праймер PCR для амплификации PAK1-ID.

SEQ ID №: 12 представляет собой второй праймер PCR для амплификации PAK1-ID.

ПРИМЕРЫ

1. СПОСОБЫ

1.1 Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (RT-PCR)

Сначала, для предотвращения загрязнения геномной ДНК, обрабатывали тотальную РНК (1 мкг) 1 единицей свободной от РНКазы ДНКазы I. Затем проводили обратную транскрипцию РНК, обработанной ДНКазой I, в кДНК, используя обратную транскриптазу Thermoscript (Life Technologies, Inc.) с применением праймеров олиго(dT)20, по предоставляемому производителем способу. Проводили PCR, используя в качестве праймеров, направленных к консервативным последовательностям кДНК PAK1 человека и мыши, 5'-TGGCTGGAGGCTCCTTGACA-3' (SEQ ID №: 9) и 5'-GAGGGCTTGGCAATCTTCAGGA-3' (SEQ ID №: 10) (MWG Biotech AG, Germany). Условия PCR представляли собой 95°C/30 сек, 60°C/30 сек и 72°C/45 сек в течение 25 циклов, с применением 2,6 единицы ДНК-полимеразы Expand High Fidelity PCR (Roche Diagnostics GmbH, Germany) на 50 мкл реакционной смеси.

1.2 Схема векторных конструктов

Амплифицировали посредством PCR последовательность, кодирующую в полипептиде PAK1 остатки с 83 по 149, установленные как аутоингибиторный домен PAK1 (Zhao, Z. S. et al. (1998), выше). Для амплификации использовали праймеры

5'-ATCGCCACCATGTACCCTTATGATGTGCCAGATTATGCCCACACAATTCATGTCGGTTTTG-3' (SEQ ID №: 11)

(подчеркнута последовательность Козака, гемагглютининовая (HA) метка выделена жирным шрифтом) и

5'-ATCTTATGACTTATCTGTAAAGCTCATG-3' (SEQ ID №: 12) (MWG, Biotech AG, Germany). Условия PCR представляли собой 95°C/30 сек, 60°C/30 сек и 72°C/30 сек в течение 25 циклов, с применением 2,6 единицы ДНК-полимеразы Expand High Fidelity PCR (Roche Diagnostics GmbH, Germany) на 50 мкл реакционной смеси. Продукт PCR субклонировали в вектор pCR-TOPO2.1 (Invitrogen GmbH, Germany). PAK1, меченный HA, вводили в участки HindIII и XbaI pcDNA3.1 млекопитающего (Invitrogen GmbH, Germany). В плазмиду pCEP4 (Invitrogen GmbH, Germany) вставляли PAK1-ID, используя участки рестрикции 5' HindIII и 3' NotI. Все плазмиды проверяли секвенированием.

1.3 Культура клеток

Культуры хондросаркомы человека SW1353 растили в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей 10% эмбриональную телячью сыворотку (FCS) и пенициллин/стрептомицин (37°C, 5% CO₂). Для трансфекций культивировали 6×104/лунка в течение ночи и на следующий день трансфицировали, используя 2 мкг ДНК и 10 мкл GenePORTER™ Transfection Reagent (Gene Therapy Systems, Inc., San Diego, CA, USA). Через 3 часа добавляли равный объем среды, содержащий 20% FCS, и инкубировали в течение ночи. В случае сверхэкспрессии вектора pCEP4 (Invitrogen GmbH, Germany) проводили через два дня после трансфекции отбор клеток, применяя 200 мкг/мл гигромицина B (Invitrogen GmbH, Germany). Эффективность трансфекции оценивали, используя FACScan (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Inc., Mountain View, CA, USA) и инвертированный флуоресцентный микроскоп. В большинстве экспериментов в каждую лунку 6-луночного 35-мм планшета переносили 60000 клеток. Перед стимуляцией клетки промывали забуференным фосфатом солевым раствором (PBS) и культивировали 30 минут в DMEM без FCS. Клетки для эксперимента помещали на 24 часа в 1 мл DMEM без сыворотки, с 10 нг/мл IL-1в человека (Roche Diagnostics GmbH, Germany) или без него и с 10 нг/мл TNFб (Roche Diagnostics GmbH, Germany) или без него.

Клетки эмбриональной почки человека (HEK) 293 поддерживали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой. Для экспериментов с трансфекцией проводили за 24 часа до трансфекции посев клеток в 6-луночные планшеты по 5×10⁵ клеток на лунку. Клетки инкубировали 4 часа в 1,0 мл среды без сыворотки, содержащей 20 мкл lipofectAMINE^® (Life Technologies, Inc., USA) и 5,0 мкг тотальной ДНК на лунку (плазмиды pcDNA3.1-PAK1(83-149) или используемого в качестве контроля пустого вектора pcDNA.1). Клетки или оставляли без обработки, или стимулировали интерлейкином-1в (10 нг/мл; R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA) с последующим периодом восстановления (16 часов) в среде, содержащей 10% эмбриональную телячью сыворотку. Снимали супернатант культур и наблюдали за экспрессией IL-8 (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA), PGE2 (SpiBiom Inc.) и MMP-13 (Amersham Pharmacia Biotech, Inc.) посредством ELISA по способу, предоставляемому производителем.

1.4 Анализ Вестерн-блот и ELISA

Для оценки экспрессии пептидов PAK^183-149, меченных HA, клетки лизировали в 100 мкл буфера для лизиса (20 мМ MOPS, 2 мМ EGTA, 5 мМ ЭДТА, 0,5% нонидет P-40), дополненном свободным от ЭДТА полным коктейлем ингибиторов протеаз (Roche Diagnostics GmbH, Germany), и определяли концентрацию белка, используя набор для анализа BCA Protein (Pierce Biotechnology, Inc. Rockford, IL, USA). Перед переносом на PVDF мембрану (Millipore Corp., USA) белки разделяли в 4-12% NuPAGE геле (Invitrogen GmbH, Germany).

Белковые экстракты из первичных хондроцитов человека из ткани пациента, страдающего остеоартритом, так же, как и из обычной ткани, получали стандартными способами. Экспрессию PAK1 исследовали двухмерным электрофорезом в геле и иммуноблоттингом, используя 30 мкг белков. Изоэлектрическое фокусирование для 2D-электрофореза в геле выполняли, применяя 7-см IPG пластины с линейным фиксированным градиентом pH 3-10 (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA) в protein IEF Cell (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA). Заключительную стадию фокусирования проводили 8 часов при 4000 В. Разделение во втором направлении проводили в NuPAGE Novex 4-12% ZOOM Gel (Invitrogen GmbH, Germany) и переносили белки на мембрану PVDF (Millipore Corp., USA).

При иммуноблоттинге белки PAK^183-149, меченные HA, и PAK1 выявляли, используя поликлональное антитело с меткой HA (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA) и поликлональное антитело бPAK(N-20) (Santa Cruz), соответственно. Вкратце, мембраны блокировали в течение 1 часа при комнатной температуре, применяя TBS-T (150 мМ NaCl, 20 мМ Tris, pH 7,6, 0,1% Tween 20), содержащий 5% обезжиренное сухое молоко; инкубировали 1 час при комнатной температуре в TBS-T, содержащем или антитело с меткой HA в разведении 1/500, или антитела бPAK(N-20) в разведении 1/50, и в заключение инкубировали 1 час в TBS-T, содержащем 1/10000, связанное с пероксидазой хрена антитело к кролику (Pierce). Мембраны обрабатывали, применяя ECL в соответствии с инструкциями производителя (Amersham Pharmacia Biotech, Inc.).

Для анализа уровней белков MMP13, IL-8 и PGE2 оценивали супернатанты культур клеток, используя ELISA для MMP13 (Amersham Pharmacia Biotech, Inc.), IL-8 (R&D Systems, Inc. Minneapolis, MN, USA) и PGE2 (SpiBio), как указано поставщиком.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ

2.1 Экспрессия PAK1 в линиях клеток хондросаркомы человека и в первичных хондроцитах мыши

Экспрессию PAK1 в линиях клеток хондроцитов человека SW1353, а также в первичных клетках мыши, стимулированных или нестимулированных ретиноевой кислотой, анализировали, применяя RT-PCR.

Из полученных в этом эксперименте результатов ясно видно, что PAK1 экспрессируется как в линии клеток хондросаркомы человека SW1353, так и в первичных хондроцитах мыши. В ряде дальнейших экспериментов для подтверждения экспрессии PAK1 в линии клеток хондроцитов человека CH8 использовали RT-PCR.

Результаты, показанные на уровне РНК, были также подтверждены на уровне белка анализом Вестерн-блот с применением специфического антитела к PAK1 (фиг.1).

Взятые вместе, результаты на уровнях РНК и белка подтверждают, что PAK1 экспрессируется в линиях клеток хондроцитов человека и мыши и в первичных хондроцитах.

2.2 Взаимосвязь экспрессии ингибиторного домена PAK1 с передачей сигнала IL-1:

MMP13 (матриксная металлопротеиназа-13) представляет собой важный маркерный белок для вызываемой IL-1 экспрессии белков, имеющих отношение к остеоартриту. Для исследования необходимости PAK1 для передачи сигнала от IL-1, ведущего к индукции экспрессии MMP13, сверхэкспрессировали ингибиторный домен PAK1 (PAK1-ID) в линии клеток хондросаркомы человека SW1353 (фиг.2).

Воздействие IL-1в на трансфицированные, а также на нетрансфицированные клетки SW1353 приводило к значительному повышению экспрессии и высвобождению MMP13 в среду. Из результатов этого эксперимента ясно видно, что сверхэкспрессия PAK1-ID на ~55% ингибирует вызываемую IL-1в экспрессию MMP13 в линии клеток хондроцитов человека SW1353. Кроме того, в трансфицированных, а также в нетрансфицированных клетках SW1353 можно было наблюдать секрецию на основном уровне MMP13 в среду. В этих нестимулированных клетках экспрессия PAK1-ID может на >80% ингибировать вызываемую IL-1в экспрессию MMP13. Взятые вместе, результаты подтверждают, что PAK1 необходим для вызываемой IL-1в экспрессии MMP13.

Другой важный маркерный ген представляет собой простагландин PGE2. Регуляцию экспрессии PGE2 в клетках SW1353 анализировали в присутствии и отсутствие PAK1-ID, соответственно, (фиг.3).

Сходно с результатами, которые наблюдали для ингибирования экспрессии MMP13, эти результаты подтвердили, что ингибирование PAK1 сверхэкспрессией PAK1-ID приводит к значительному снижению активности индуцируемых IL-1в путей передачи сигналов. В линии клеток SW1353 вызываемую IL-1в экспрессию PGE2 ингибировали более чем на 50%. Кроме того, регуляция PGE2 указывает на вовлечение PAK1 в процессы, связанные с болью при остеоартрите.

В дополнение к эффекту PAK1-ID в клетках SW1353, авторы также исследовали его эффект, т.е. воздействие на активность PAK1 ее биологического ингибитора, в линии клеток эмбриональной почки человека HEK293 (фиг.4).

Результат этого эксперимента подтвердил открытия, сделанные в исследованиях на клетках SW1353. PAK1 играет важную роль в регуляции индуцируемого IL-1в каскада сигналов, спускающихся от активации IL-1R к активации факторов транскрипции, повышающих экспрессию маркерных генов, имеющих отношение к остеоартриту и боли, таких как MMP13, IL-8 и PGE2.

Изобретение относится к применению ингибитора р21-активируемой киназы (PAK1) для лечения заболевания суставов, такого как остеоартрит или ревматоидный артрит, или для лечения боли в суставах, и к применению PAK1 в качестве белка-мишени для поиска ингибитора PAK1 как лекарственного средства для лечения заболевания суставов. Изобретение обеспечивает снижение или устранение воздействия факторов, повреждающих хрящ. 5 н. и 16 з.п. ф-лы, 4 ил.

1. Применение ингибитора р21-активируемой киназы (РАК) для получения лекарственного средства для лечения заболевания суставов, где р21-активируемая киназа (РАК) представляет собой РАК1.

2. Применение по п.1, где заболевание суставов представляет собой дегенеративное заболевание суставов или воспалительное заболевание суставов.

3. Применение по п.2, где дегенеративное заболевание суставов представляет собой остеоартрит.

4. Применение по п.2, где воспалительное заболевание суставов представляет собой ревматоидный артрит.

5. Применение ингибитора РАК1 для получения лекарственного средства для лечения боли в суставах.

6. Применение по п.5, где боль в суставах связана с дегенеративным заболеванием суставов.

7. Применение по любому из пп.1-6, где ингибитор РАК1 представляет собой ингибиторный домен РАК1 с аминокислотной последовательностью HTIHVGFDAV TGEFTGMPEQ WARLLQTSNI TKSEQKKNPQ AVLDVLEFYN SKKTSNSQKY MSFTDKS (SEQ ID №:6), пептид РАК1 с аминокислотной последовательностью KPPAPPMRNT STM (SEQ ID №:7), слитый пептид Tat-PAK с аминокислотной последовательностью YGRKKRRQRR RGKPPAPPMR NTSTM (SEQ ID №:8), связывающий белок или связывающий пептид, направленный против РАК1, нуклеиновую кислоту, направленную против гена РАК1 или РАК1, химическую молекулу и/или экстракт природного продукта.

8. Применение по п.7, где связывающий белок или связывающий пептид представляет собой антитело, связывающую антиген часть антитела или поддерживающий белок против РАК1, предпочтительно антикалин.

9. Применение по п.8, где нуклеиновая кислота представляет собой антисмысловую нуклеиновую кислоту, аптамер, миРНК или рибозим.

10. Применение РАК1 или гена РАК1 в качестве белка-мишени для поиска ингибитора РАК1 как лекарственного средства для лечения заболевания суставов или боли в суставах.

11. Способ скрининга ингибитора РАК1, где способ предусматривает стадии:
(a) получения РАК1 или гена РАК1,
(b) получения тестируемого соединения и
(c) измерения или выявления воздействия тестируемого соединения на РАК1 или ген РАК1.

12. Способ по п.11, где тестируемое соединение получают в виде библиотеки химических соединений.

13. Способ по п.11, где воздействие тестируемого соединения на РАК1 или ген РАК1 измеряют или выявляют гетерогенным или гомогенным анализом.

14. Способ по п.13, где гетерогенный анализ представляет собой ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), DELFIA (флуоресцентный иммунный анализ с усиленной диссоциацией лантанидов), SPA (сцинтилляционный проксимальный анализ) или анализ в планшете для сцинтилляции.

15. Способ по п.13, где гомогенный анализ представляет собой анализ TR-FRET (резонансный перенос энергии флуоресценции с разрешением во времени), анализ FP (поляризация флуоресценции), ALPHA (гомогенный анализ с усиленной при сближении люминесценцией), анализ EFC (комплементация фрагментов фермента) или генный анализ.

16. Способ по любому из пп.11-15, где способ осуществляют на матрице.

17. Способ по любому из пп.11-13, где способ осуществляют, применяя целые клетки.

18. Способ по любому из пп.11-15, где способ осуществляют в роботизированной системе.

19. Способ по любому из пп.11-15, где способ осуществляют, применяя микрожидкостные технологии.

20. Способ по любому из пп.11-15, где способ представляет собой способ высокоэффективного скрининга ингибитора РАК1.

21. Способ получения лекарственного средства для лечения заболевания суставов и/или боли в суставах, где способ предусматривает стадии:
(a) получения РАК1 или гена РАК1,
(b) получения тестируемого соединения,
(c) измерения или выявления воздействия тестируемого соединения на РАК1 или ген РАК1;
(d) выделения измеренного или выявленного тестируемого соединения, приемлемого для лечения заболевания суставов и/или боли в суставах, и
(e) составления композиции измеренных или выявленных тестируемых соединений с одним или более фармацевтически приемлемых носителей или вспомогательных веществ.