ОБЛАСТЬ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к жидкой композиции, содержащей по меньшей мере одну разновидность белка и пептида, подходящую для получения мелких капель из жидкой композиции, к способу получения капель из жидкой композиции и к эжекционному устройству, использующему способ получения капель из жидкой композиции.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В последние годы было сделано много попыток использовать раствор белка в виде капель. Примеры таких попыток включают в качестве способа доставки лекарственного средства введение через слизистую оболочку и нанесение на биочип или биосенсор, поскольку для них нужны только следовые количества белка. Кроме того, способ применения микрокапель жидкого белка также привлекал внимание в области скрининга биологически активных веществ (выложенная японская патентная заявка № 2002-355025; Allain LR, et al., «Fresenius J. Anal. Chem.» 2001, Vol. 371, p. 146-150; и Howard EI, Cachau RE «Biotechniques» 2002, Vol. 33, p.1302-1306).
В последнее время ожидается, что белки, в частности, ферменты или подходящие белки, обладающие биологической активностью, можно будет производить в большом количестве с помощью методик генной рекомбинации, таким образом, что образование жидких капель белка может стать эффективным средством для исследования и применения белка в качестве нового лекарственного средства и прикладной области. В основном, способы введения пациенту различных лекарственных средств с использованием мелких капель жидкости стали более важными, в частности в отношении введения белков, пептидов и других биологических веществ через легкие. Легкие имеют альвеолы с площадью поверхности величиной от 50 до 140 м2, эпителий, который представляет собой такой чрезвычайно тонкий абсорбционный барьер, как 0,1 мкм, кроме того, обладает ферментативной активностью ниже ферментативной активности желудочно-кишечного тракта, и они соответственно привлекли внимание в качестве пути введения, заменяющего инъекции лекарственных средств, на основе высокомолекулярных пептидов, представленных инсулином.
В основном известно, что внутрилегочное депонирование мелких жидких капель лекарственного средства сильно зависит от аэродинамического размера частиц, и прежде всего для доставки капель в альвеолы, глубокие участки легких, необходимо разработать форму введения, способную вводить капли с размером частиц от 1 до 5 мкм и узким распределением по размеру частиц с высокой воспроизводимостью и стабильным составом.
Существовали некоторые традиционные способы введения композиции в полости тела, в частности по периметру органов дыхания, которые теперь будут пояснены примерами. Существует ингалятор с заданной дозой (MDI), распыляющий композицию в форме суспензионного аэрозоля, обеспечивающий количественное распыление с использованием сжиженного негорючего или невоспламеняющегося газа для создания давления и регулирующий единицу объема сжиженного газа, выбрасываемого единовременно. Однако проблемой использования ингалятора является то, что размер капель в вышеописанном диапазоне недостаточно контролируется, и кроме того, газ, создающий давление, может быть вреден для здоровья. Также существует способ распыления, используемый для распыления жидкой композиции, в котором используется вода и этанол в качестве среды, и жидкая композиция преобразуется в микрокапли путем эжектирования ее вместе с газом под давлением для доставки через капилляр. В связи с этим для способа распыления теоретически возможно контролировать распыляемый объем путем определения объема жидкости жидкой композиции, подаваемой через такой капиллярный поток, но трудно контролировать диаметр капли.
В частности, при атомизации распылительного типа задействован газ под давлением, применяемый в способе получения микрокапель из жидкости, в дальнейшем в качестве газа для транспортировки атомизированных микрокапель в потоке. По этой причине конструктивно трудно изменять количество (плотность) микрокапель, плывущих в потоке воздуха, для транспортировки в соответствии с назначением.
В качестве способа получения вышеописанных капель с узким распределением по размеру частиц существуют сведения относительно использования устройства, производящего капли, которое образует чрезвычайно мелкие микрокапли на основе принципа, используемого в струйной печати (например, патент США № 5894841 и выложенная патентная заявка Японии № 2002-248171). Здесь будет описана такая струйная система. Система состоит из введения жидкости, эжектируемой в небольшую камеру, приложения выталкивающей силы к жидкости и эжектирования капель через отверстие. Используемый способ выталкивания включает, например, способ формирования пузырьков для эжектирования капель через отверстие в камере с использованием электротермического преобразователя, такого как тонкопленочный резистор (тепловое струйное устройство), и способ прямого выталкивания жидкости через отверстие в камере с использованием пьезоосциллятора (пьезоструйное устройство). Камера и отверстие встроены в элемент печатающей головки, и элемент печатающей головки соединен с источником подачи жидкости, а также с датчиком регулирования эжектирования капель.
При создании лекарственного средства, абсорбируемого из легких, необходимо точно контролировать дозировку, особенно для вышеописанной белковой композиции, так, чтобы образование жидких капель, основанное на принципе струйной системы, было в предпочтительном виде, поскольку можно регулировать скорость эжектирования. Кроме того, хотя требуется надежное эжектирование жидкости, раствор белка, имеющий только выровненное поверхностное натяжение и вязкость, эжектируется неустойчиво, поскольку был случай, когда раствор белка едва ли эжектировался с высокой степенью воспроизводимости и эффективности.
Образование жидких капель вышеописанного белка и пептида на основе принципа струйной системы имеет проблему, касающуюся того, что белок имеет хрупкую пространственную конфигурацию, что, следовательно, может быть причиной агрегации и разложения белка при разрушении конфигурации. Когда жидкие капли образуются на основе принципа струйной системы, к жидким каплям прикладывается физическая сила, такая как давление и поперечная сила, и каждая мелкая жидкая капля имеет свою характерную высокую поверхностную энергию. Они делают конфигурацию большинства белков нестабильной (при использовании тепловой струйной системы в дополнение к силам добавляется к тому же нагревание). Образование жидких капель, особенно на основе принципа струйной системы, имеет проблему, касающуюся того, что при хранении в течение длительного периода система является нестабильной, и более того, вышеописанная физическая сила чрезвычайно выше поперечной силы и тепловой энергии, применяемых при нормальном перемешивании и термообработке. (Считается, например, что к жидким каплям в тепловой струйной системе прилагается кратковременная нагрузка в 90 атмосфер при 300°C). Кроме того, к жидким каплям одновременно прилагается множество физических сил. По этой причине белок имеет тенденцию к гораздо большей нестабильности, чем в процессе обычной обработки белка, поскольку был случай, когда традиционно используемой технологии стабилизации белка было недостаточно. Как только возникает проблема, белки агрегируются при образовании капли, что вызывает засорение сопла и эжектирование капель становится практически невозможным.
Более того, размер капли, подходящей для легочной ингаляции, составляет от 1 до 5 мкм, что гораздо меньше, чем капля около 16 мкм, используемая в принтере, коммерчески доступном в настоящее время, и в результате приводит к приложению к капле большей поверхностной энергии и поперечной силы. По этой причине чрезвычайно трудно эжектировать белок в виде микрокапель, подходящих для легочной ингаляции.
Рассматривая описанные выше различные применения, способ эжектирования раствора белка предпочтительно основан на принципе тепловой струйной системы, поскольку он имеет низкую производственную стоимость и может увеличить плотность сопел.
С другой стороны, способ добавления водорастворимого полимера или альбумина, такого как поверхностно-активное вещество, глицерин, различные сахариды и полиэтиленгликоль, известный как способ стабилизации белка, оказывает незначительное влияние на улучшение параметров эжектирования белка с помощью тепловой струйной системы или не влияет на них.
В отношении жидкой композиции капель для вдыхания в легкие, которые получены с помощью тепловой струйной системы, раскрыт способ добавления соединения для регулирования поверхностного натяжения и/или увлажняющего агента к раствору белка (например, издание международной публикации № WO02/094342). Вышеупомянутый способ включает добавление к раствору белка водорастворимого полимера, такого как поверхностно-активное вещество и полиэтиленгликоль, поскольку описывается, что водорастворимый полимер улучшает стабильность белка в растворе образованной жидкой капли посредством уменьшения поверхностного натяжения и вязкости раствора и сохранения влажности раствора.
Однако в этом документе не описывается стабильность эжектирования, более того, добавление поверхностно-активного вещества и водорастворимого полимера демонстрирует недостаточный эффект при высокой концентрации белка и пептида, и был случай, когда добавка сама по себе ухудшала стабильность эжектирования. Кроме того, многие поверхностно-активные вещества совсем не влияют на стабильность эжектирования, и, другими словами, поверхностное натяжение, вязкость или эффект влагоудержания не регулируют стабильность эжектирования. Другими словами, вышеописанный способ не был основным способом для стабилизации эжектирования при эжектировании белка и пептида с помощью тепловой струйной системы.
Как описано выше, струйная технология хорошо известна как способ создания мелких жидких капель из жидкого образца и их эжектирования, и, в частности, особенностью способа является демонстрация возможности контролировать даже следовые количества эжектируемой жидкости после превращения в жидкие капли. Струйная система для мелкокапельного типа эжектирования включает осцилляторный тип, использующий пьезоэлектрический элемент, и тепловую струйную систему, использующую микронагревательный элемент. Осцилляторный тип, использующий пьезоэлектрический элемент, имеет ограничение в миниатюризации используемого пьезоэлектрического элемента и соответственно числа установленных отверстий для эжектирования на единицу площади. Кроме того, необходимая стоимость для производства эжектирующего устройства резко увеличивается с увеличением числа упорядоченных отверстий для эжектирования на единицу площади. В отличие от этого в тепловой струйной системе можно сравнительно легко миниатюризировать микронагревательные элементы, используемые в эжектирующем устройстве, можно увеличить число упорядоченных отверстий для эжектирования на единицу площади по сравнению с системой осцилляторного типа, использующей пьезоэлектрический элемент, и можно намного уменьшить необходимую стоимость производства эжектирующего устройства.
При применении тепловой струйной системы для образования жидких капель, необходимо скорректировать физическое свойство эжектируемой жидкости так, чтобы контролировать соответствующее состояние атомизации и жидкий объем мелкой жидкой капли, эжектируемой из каждого эжектирующего отверстия. В частности, жидкая композиция, наподобие растворителя, состав и концентрация раствора, состоящего из эжектируемого жидкого образца, тщательно регулируется таким образом, чтобы обеспечивался целевой объем жидкости мелкой жидкой капли.
Кроме того, различные технологические разработки также переходят на механизм эжектирования капель, основанный на принципе тепловой струйной системы. В то время как обычная головка струйного принтера эжектирует жидкие капли, имеющие индивидуальный жидкий объем примерно несколько пиколитров, технология эжектирования и механизм эжектирования, которые были недавно разработаны, формируют чрезвычайно мелкие жидкие капли порядка субпиколитров или фемтолитров (см., например, выложенную патентную заявку Японии № 2003-154655).
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Объектом настоящего изобретения является жидкая композиция в качестве эжектируемой жидкости, используемой для стабильного эжектирования жидких капель, содержащих по меньшей мере одну разновидность белка и пептида, посредством воздействия на жидкость тепловой энергией, и способ эжектирования и эжектирующее устройство, подходящее для выработки жидких капель белка.
Эжектируемая жидкость по настоящему изобретению характеризуется включением в нее одной разновидности, выбранной из белка и пептида, соединения, имеющего бетаиновый скелет, и жидкой среды.
Способ эжектирования по настоящему изобретению характеризуется тем, что жидкие капли получают из вышеописанной эжектируемой жидкости по принципу тепловой струйной системы, и эти жидкие капли эжектируются.
Картридж для эжектирования жидкости по настоящему изобретению характеризуется тем, что содержит резервуар для размещения описанной выше эжектируемой жидкости, и эжектирующую головку на основе теплового струйного принципа.
Устройство для ингаляции жидкости по настоящему изобретению характеризуется тем, что содержит описанный выше картридж и канал потока жидкости и отверстия для направления эжектируемой жидкости, из элемента эжектирования жидкости эжектирующей головки картриджа по тепловому струйному принципу, в место ингаляции пользователя.
Способ получения жидких капель из жидкости по настоящему изобретению характеризуется тем, что этим способом получают жидкие капли из жидкости, содержащей по меньшей мере одну разновидность белка и пептида, путем воздействия на эту жидкость тепловой энергией, где описанная выше жидкость включает соединение, имеющее бетаиновый скелет.
В соответствии с настоящим изобретением может быть предложена эжектируемая жидкость, которую можно стабильно эжектировать после воздействия на нее тепловой энергией, путем добавления соединения, имеющего бетаиновый скелет, к раствору, содержащему по меньшей мере одну разновидность белка и пептида. Кроме того, дополнительно можно эжектировать белковый раствор более высокой концентрации путем дополнительного добавления к эжектируемой жидкости поверхностно-активного вещества, поскольку такое добавление обеспечивает синергетический эффект стабилизации эжектирования. Когда по меньшей мере одна разновидность белка и пептида является фармацевтически эффективным ингредиентом, по меньшей мере одна разновидность белка и пептида фармацевтически эффективного ингредиента поступает в легкие за счет выброса эжектируемой жидкости из портативного эжектирующего устройства для преобразования ее в жидкие капли, и ингаляция этих капель, и фармацевтически эффективный ингредиент могут абсорбироваться легкими. Описанный выше способ также можно использовать для получения биочипа или биосенсора, обнаруживая и подвергая скринингу биологическое вещество, путем эжектирования по меньшей мере одной разновидности белка и пептида на подложку с помощью этого способа.
Другие особенности и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего описания в сопровождении чертежей, на которых одинаковые номера позиций обозначают одинаковые или схожие части на всех фигурах.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На Фиг.1 представлено схематическое изображение для пояснения способа эжектирования белка на подложку;
На Фиг.2 представлено изображение, показывающее один пример системы полос белка, расположенных в определенном порядке на подложке;
На Фиг.3 представлен схематический пояснительный чертеж элемента головки картриджа для ингалятора;
На Фиг.4 представлено перспективное изображение ингалятора;
На Фиг.5 представлено перспективное изображение вида, в котором крышка, показанная на Фиг.4, открыта;
На Фиг.6 представлен график, демонстрирующий скорость эжектирования раствора альбумина с помощью тепловой струйной системы; и
На Фиг.7 представлена иллюстрация модели экспериментальной процедуры Примера 20.
НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения теперь будут описаны более подробно в соответствии с прилагаемыми чертежами.
Объектом настоящего изобретения является жидкая композиция для эжектируемой жидкости, используемой для стабильного эжектирования жидких капель, содержащих по меньшей мере одну разновидность белка и пептида, посредством воздействия на жидкость тепловой энергией, способ эжектирования, подходящий для использования жидких капель, содержащих белок, и предназначенное для этого эжектирующее устройство.
Настоящее изобретение теперь будет подробно описано ниже.
Белок, используемый в настоящем изобретении, означает произвольный полипептид, который состоит из аминокислот, связанных друг с другом пептидной связью, и может растворяться или диспергироваться в водном растворе. Кроме того, полипептид, используемый в настоящем изобретении, означает соединение, состоящее из двух или более и 100 или менее аминокислот, соединенных друг с другом посредством пептидной связи. Белок и пептид могут быть синтезированы химическим путем или выделены из природного источника, но обычно они представляют собой природный белок и рекомбинантный полипептид. Белок и пептид также можно химически преобразовать путем ковалентного связывания полиэтиленгликоля с аминокислотным остатком в молекуле белка и пептида или подобного, для усиления эффекта пролонгирования терапевтического действия белка и пептида, и подобного.
При осуществлении настоящего изобретения используемая жидкость может содержать разнообразные белки и пептиды, из которых желательно, чтобы образовывалась жидкая капля. Наиболее характерно, целью получения жидкой капли из жидкости, содержащей белок и пептид по настоящему изобретению, является доставка подходящего белка и пептида в легкие для лечения. Эти примеры включают различные гематопоэтические факторы, такие как кальцитонин, факторы свертывания крови, циклоспорин, G-CSF, GM-CSF, SCF, EPO, GM-MSF и CSF-1; интерлейкины, такие как IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 и IL-12; IGF; и цитокининдуцирующий M-CSF, тимозин, TNF и LIF. Подходящие белки, имеющие другой терапевтический эффект, включают вазоактивный пептид; интерферон (альфа, бета, гамма или общий интерферон); фактор роста или гормон, такой как гормон роста человека или другой гормон роста животного (подобный факторам роста быка, свиньи или цыпленка); инсулин; окситоцин; ангиотензин; метионин энкефалин; вещество P; ET-1; FGF; KGF; EGF; IGF; PDGF; LHRH; GHRH; FSH; DDAVP; PTH; вазопрессин; глюкагон; и соматостатин. Также используют ингибитор протеазы, такой как лейпептин и пепстатин, и ингибитор металлопротеиназы (такой как TIMP-1, TIMP-2 и другие ингибиторы протеиназы). Также используют фактор роста нервов, такой как BDNF и NT3. Также используют активатор плазминогена, такой как tPA, урокиназу и стрептокиназу. Также используют пептидную часть белка, имеющую основную структуру или одну часть родительского белка и по меньшей мере одну часть различных биологических свойств родительского белка. Также используют аналог, например аналог с заменами или делециями, модифицированной аминокислотой, например пептидный аналог, или соединение, содержащее вышеописанное вещество, модифицированное водорастворимым полимером, таким как PEG и PVA. В Critical Reviews в Therapeutic Drug Carrier Systems, 12 (2&3) (1995) пояснялось, что вышеописанные белки могут быть доставлены в легкие.
Более того, в области получения биочипов и биосенсеров также можно использовать скрининг белков и пептидов и подобного, в дополнение к описанным выше белкам и пептидам также могут быть использованы следующие многочисленные вещества: различные ферменты, такие как оксидаза, редуктаза, трасфераза, гидраза, лиаза, изомераза, синтетаза, эпимераза, мутаза и рацемаза; различные антитела и рецепторы, такие как IgG и IgE; белки и пептиды, используемые для диагностики, такие как их антигены, аллергены, шаперонины, авидин и биотин; и описанные выше вещества, модифицированные реактивом для иммобилизации.
Подходящий белок и пептид, содержащийся в описанной выше эжектируемой жидкости, имеет молекулярную массу, например, в диапазоне от 0,5 кДа до 150 кДа. Кроме того, содержание по меньшей мере одной разновидности, выбранной из белков и пептидов, определяют в соответствии с его назначением и применением, и предпочтительно оно определено в диапазоне от 1 нг/мл до 200 нг/мл.
Предпочтительно, чтобы жидкая среда содержала в основном воду, и соотношение воды к среде составляло 50% или более. Помимо воды, которая является основным компонентом среды, в качестве среды можно добавить водорастворимый органический растворитель и вспомогательный ингредиент, такой как спирт.
В основном известно добавление поверхностно-активного вещества и растворителя, такого как этиленгликоль, для улучшения свойств эжектирования краски, на которую воздействует тепловая энергия. Однако при эжектировании раствора белка и пептида свойства эжектирования заметно не улучшались при добавлении только этих веществ, так что были необходимы новые добавки.
В результате проведения обширных исследований авторы настоящего изобретения обнаружили, что раствор, содержащий соединение, имеющее бетаиновый скелет, в белке и пептиде, подходит для формирования стабильных жидких капель даже при воздействии тепловой энергии.
В качестве способа воздействия вышеописанной тепловой энергией на жидкие капли и их эжектирования существуют, например, способ нагревания трубки и эжектирования жидкости внутрь нее через отверстие, описанный в патенте США № 6234167, и способ, основанный на принципе теплового струйного метода. Тепловая струйная система представляет собой способ воздействия тепловой энергией на жидкость с помощью нагревателя, нагревание и барботирование жидкости с помощью энергии и эжектирование жидких капель через отверстие на конце полости с жидкостью; и имеет особенность равномерного эжектирования очень точного числа жидких капель по сравнению с вышеописанным способом нагревания трубки путем разделения нагревателей на множество мелких частей.
Далее в основном описывается конструкция, основанная на принципе теплового струйного способа, поскольку тепловой струйный способ наиболее заметно демонстрирует улучшенный эффект в отношении свойств эжектирования, но в настоящем изобретении можно использовать пьезоэлектрический струйный способ эжектирования жидкости в сопле путем использования вибрирующего давления благодаря пьезоэлектрическому элементу. Тепловая струйная система может повышать: точность диаметра отверстия для эжектирования и количество теплоты теплового импульса, используемого для эжектирования в отдельном выталкивателе для жидкой композиции, и точность размера микронагревателя или используемого для этого подобного устройства; и воспроизводимость. Соответственно тепловым струйным способом для жидкой композиции можно достичь узкого распределения диаметров мелких жидких капель по всему множеству выталкивателей, которые плотно расположены на эжектирующей головке. Кроме того, в ситуации, в которой настоящее изобретение часто используется, требуется, чтобы это устройство удовлетворяло требованию низкой стоимости производства, головка должна часто меняться и чтобы это устройство было небольшого размера, а затем, кроме этого, предпочтительно использовать тепловую струйную систему.
Авторы настоящего изобретения рассматривают причину, по которой соединение, имеющее бетаиновый скелет, вносит такой большой вклад в стабильность эжектирования, следующим образом. Бетаиновый скелет имеет как четвертичный аммонийный катион, так и анион органической кислоты в близком положении друг к другу в одной молекуле, и он имеет особенности: тенденцию к легкой гидратации; легко модифицируется другими молекулами и может иметь в молекуле длинноцепочечную алкильную группу или ацильную группу; и, следовательно, демонстрирует высокие гидратационные свойства, даже когда соединение, имеющее бетаиновый скелет, также имеет длинноцепочечную алкильную группу. С другой стороны, белок и пептид являются очень гидрофобными и плохо стабилизируются гидратацией. Когда соединение, имеющее бетаиновый скелет, имеет гидрофобную группу, такую как описанная выше алкильная группа и ацильная группа с длинной цепью, эти функциональные группы действуют на гидрофобный участок белка или пептида, и в то же время катион и анион бетаинового скелета гидратируют белок и пептид под действием гидратационной силы катиона и аниона, имеющих высокие гидратационные свойства, для их стабилизации и ингибирования взаимодействия белков между собой и пептидов между собой. Посредством этого действия соединение, имеющее бетаиновый скелет, может препятствовать денатурации и агрегации белка и пептида благодаря энергетической нагрузке при эжектировании жидкости по принципу теплового струйного способа и может стабилизировать эжектирование.
Соединение, имеющее бетаиновый скелет, используемое в настоящем изобретении, предпочтительно имеет химическую структуру, представленную следующей формулой (1).
Здесь R1 в формуле (1) представляет собой замещенную или незамещенную алкильную группу, имеющую от 6 до 18 атомов углерода, и более предпочтительно насыщенный алкил, имеющий от 8 до 16 атомов углерода. В формуле (1) R2 и R5 каждый независимо представляет собой замещенную или незамещенную алкиленовую цепь, имеющую от 1 до 6 атомов углерода, и более предпочтительно и в особенности алкиленовую цепь, имеющую от 1 до 4 атомов углерода. В формуле (1), R3 и R4 каждый независимо представляет собой алкильную группу или алкиленовую цепь, каждая имеет от 1 до 6 атомов углерода и R3 и R4 могут быть связаны вместе с образованием гетероциклического кольца.
Пример описанного выше соединения включает диметилдиалкилбетаин, диэтилдиалкилбетаин и метилэтилдиалкилбетаин; и бетаин имидазолия, имеющий гетероциклическое кольцо, также представлен следующей формулой (2).
В формуле 1 и формуле 2 A представляет собой анион органической кислоты, и более предпочтительно карбоксильную группу или сульфоновую группу. В тех случаях, когда A представляет собой сульфоновую группу, R5 предпочтительно имеет гидроксильную группу.
В формуле (1) и формуле (2) X1 и X2 являются противоионами, и X1 должен быть только анионного типа и должен иметь по меньшей мере тип, выбранный из неорганических и/или органических анионов. Пример противоиона X1 предпочтительно включает ион галида, ион хлорида, ион фторида, ион гидроксида, ион карбоновой кислоты, ион азотной кислоты, ион фосфорной кислоты и ион серной кислоты; и противоионы могут быть такими же или отличаться от X2. X2 должен быть только катионного типа и представляет по меньшей мере тип, выбранный из иона одновалентного металла, иона оксида металла и органического катиона. Противоион X2 может быть таким же, как Х1, или отличаться от него.
В формуле (1) n представляет повторяющееся число структур и равно 0 или 1. Когда n равно 0, соединение представляет собой алкилбетаин, показанный в формуле (3); а когда n равно 1, соединение представляет собой алкиламид-алкилбетаин, показанный в формуле (4) или формуле (5).
Соединение, имеющее бетаиновый скелет, используемое в настоящем изобретении, может включать алкиламид-алкилбетаин, его соль и его производное, в таком диапазоне, чтобы не ухудшался результат настоящего изобретения, и предпочтительно используется алкиламид-алкилбетаин.
Эжектируемую жидкость по настоящему изобретению получают, не ограничиваясь следующим способом, путем перемешивания соединения, имеющего бетаиновый скелет, обладающего свойствами поверхностно-активного вещества, и по меньшей мере одной разновидности белка и пептида с жидкостью, состоящей из жидкой среды, в основном содержащей воду и другие дополнительные компоненты, которые представляют собой описанные выше компоненты эжектируемой жидкости. Вид жидкой смеси особым образом не ограничивается и может представлять собой какой-либо тип раствора, тип суспензии, тип эмульсии и тип дисперсии. В тех случаях, когда жидкая смесь не является раствором, пригодный к использованию размер суспендируемого вещества, эмульгируемого вещества или вещества, диспергированого в среде, находится в диапазоне величин от субнанометра до микрометра.
В настоящем изобретении авторы далее обнаружили, что можно сохранять стабильность эжектирования даже при значительном уменьшении концентрации вспомогательного вещества путем добавления поверхностно-активного вещества вместе с соединением, имеющим бетаиновый скелет. Добавление от 0,2 до 1 части по массе поверхностно-активного вещества к 1 части по массе соединения, имеющего бетаиновый скелет, может уменьшать количество добавляемого соединения с бетаиновым скелетом, относительно раствора с той же концентрацией белка, на 1/10 - 1/2 сохраняя стабильность эжектирования.
Считается, что действие поверхностно-активного вещества отличается от действия соединения, имеющего бетаиновый скелет, и для стабилизации эжектирования препятствуя денатурации белка и за счет повторного растворения белка, который уже агрегирован. Считается, что сочетание этих двух различных эффектов дает синергетический эффект значительного улучшения стабилизации эжектирования. Считается, что только добавление поверхностно-активного вещества не могло полностью ингибировать агрегацию белка, поскольку отдельно взятое поверхностно-активное вещество не оказывает значительного эффекта, посредством чего не могла быть обеспечена стабильность эжектирования.
Поверхностно-активное вещество по настоящему изобретению означает соединение, имеющее в одной молекуле как полярную часть, так и неполярную часть, имеющее каждую из вышеописанных частей в молекуле в отдалении друг от друга и обладающее способностью уменьшать поверхностное натяжение на границе раздела фаз между двумя несмешивающимися фазами путем выравнивания поверхностной активности молекул между двумя несмешивающимися фазами и способное к образованию мицелл.
Примеры поверхностно-активного вещества, которое может быть использовано, обычно включают себя, но не только, сорбитановые эфиры жирных кислот, такие как сорбитан-монокаприлат, сорбитан-монолаурат и сорбитан-монопальмитат; глицериновые эфиры жирных кислот, такие как глицерин-монокаприлат, глицерин-мономиристат и глицерин-моностеарат; полиглицериловые эфиры жирных кислот, такие как декаглицерил-моностеарат, декаглицерил-дистеарат и декаглицерил-монолинолеат; полиоксиэтиленовые сорбитановые эфиры жирных кислот, такие как полиоксиэтиленсорбитан-монолаурат, полиоксиэтиленсорбитан-моноолеат, полиоксиэтиленсорбитан-моностеарат, полиоксиэтиленсорбитан-монопальмитат, полиоксиэтиленсорбитан-триолеат и полиоксиэтиленсорбитан-тристеарат; полиоксиэтилен-сорбитановые эфиры жирных кислот, такие как полиоксиэтиленсорбит-тетрастеарат и полиоксиэтиленсорбит-тетраолеат; полиоксиэтиленглицериновые эфиры жирных кислот, такие как полиоксиэтиленглицерил моностеарат; полиэтиленгликолевые эфиры жирных кислот, такие как полиэтиленгликоль дистеарат; алкиловые эфиры полиоксиэтилена, такие как лауриловые эфиры полиоксиэтилена; алкиловые эфиры полиоксиэтилен-полиоксипропилена, такие как эфир полиоксиэтилен-полиоксипропиленгликоля, пропиловый эфир полиоксиэтилен-полиоксипропилена и цетиловый эфир полиоксиэтилен-полиоксипропилена; алкилфениловые эфиры полиоксиэтилена, такие как нонилфениловый эфир полиоксиэтилена, полиоксиэтилен-гидрогенизированное касторовое масло, такое как полиоксиэтиленовое касторовое масло и полиоксиэтиленовое гидрогенизированное касторовое масло (полиоксиэтилен-водородное касторовое масло); полиоксиэтиленовые производные пчелиного воска, такие как полиэтиленсорбит пчелиного воска; полиоксиэтиленланолиновые производные, такие как полиоксиэтиленланолин; амиды полиоксиэтилена стеариновой кислоты, имеющие HLB (гидрофильно-липофильный баланс) от 6 до 18 из общего числа амидов полиоксиэтилена жирных кислот; анионные поверхностно-активные вещества, в том числе, алкилсульфат, имеющий от 8 до 18 атомов углерода, такой как цетилсульфат натрия, лаурилсульфат натрия и олеилсульфат натрия, и сульфаты алкилового эфира полиоксиэтилена, содержащие от 2 до 4 молей в среднем на добавленный этиленоксид, и алкильную группу, имеющую от 8 до 18 атомов углерода, такие как полиоксиэтилен лаурилсульфат натрия; сульфонаты алкилбензола, содержащие алкильную группу, имеющую от 8 до 18 атомов углерода, такие как лаурилбензолсульфонат натрия; алкилсульфосукцинаты, содержащие алкильную группу, имеющую от 8 до 18 атомов углерода, такие как лаурилсульфосукцинат натрия; природные поверхностно-активные вещества, такие как лецитин и глицерофосфолипид; сфингофосфолипиды, такие как сфингомиелин; и эфиры сахарозы и жирной кислоты, имеющей от 8 до 18 атомов углерода. Эжектируемая жидкость (жидкая композиция) по настоящему изобретению может содержать одно или несколько из этих поверхностно-активных веществ в комбинации.
Поверхностно-активное вещество предпочтительно представляет собой полиоксиэтилен-сорбитановый эфир жирной кислоты, особенно предпочтительным является полиоксиэтилен 20 сорбитан монолаурат, полиоксиэтилен (4) сорбитан моноолеат, полиоксиэтилен 20 сорбитан монопальмитат, полиоксиэтилен 20 сорбитан моностеарат, полиоксиэтилен 20 сорбитан тристеарат, полиоксиэтилен 20 сорбитан монолаурат, полиоксиэтилен (5) сорбитан моноолеат и полиоксиэтилен 20 сорбитан триолеат, и наиболее предпочтительным является полиоксиэтилен 20 сорбитан монолаурат и полиоксиэтилен 20 сорбитан моноолеат. Кроме того, поверхностно-активным веществом, особенно предпочтительным для легочной ингаляции, является полиоксиэтилен 20 сорбитан монолаурат и полиоксиэтилен 20 сорбитан моноолеат.
Концентрация добавляемого поверхностно-активного вещества, например, может составлять от 0,001 до 20% по массе в случае инсулина, хотя зависит от сосуществующего белка или подобного. Содержание добавляемого поверхностно-активного вещества предпочтительно составляет от 0,2 до 10 частей по массе к 1 части по массе соединения, имеющего бетаиновый скелет.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения можно добавлять антибактериальное средство, дезинфицирующее средство и антисептическое средство для устранения влияния микроорганизмов. Используемое в настоящем изобретении соединение, имеющее бетаиновый скелет, обладает вышеописанным эффектом, но средство, обладающее таким эффектом, дополнительно включает, например, четвертичную аммонийную соль, такую как хлорид бензалкония и хлорид бензатония; производное фенола, такое как фенол, крезол и анизол; бензойные кислоты, такие как бензойная кислота и сложный эфир п-гидроксибензоата; и сорбиновую кислоту.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения эжектируемая жидкость может включать масло, глицерин, этанол, мочевину, целлюлозу, полиэтиленгликоль и альгинат, так, чтобы повышалась физическая стабильность при когезии и осаждении, происходящих при консервации; и может включать аскорбиновую кислоту, лимонную кислоту, циклодекстрин, токоферол и другие антиоксиданты, так, чтобы повышалась химическая стабильность при разрушении и окислении.
Эжектируемая жидкость может включать буферный агент для регулирования рН. Подходящий буферный раствор включает, например, аскорбиновую кислоту, лимонную кислоту, разбавленную соляную кислоту, разбавленный гидроксид натрия, дополнительно гидрофосфат натрия, дигидрофосфат натрия, гидрофосфат калия, дигидрофосфат калия, PBS, Hepes и Tris.
Эжектируемая жидкость может включать изотонический агент, такой как аминоэтилсульфоновая кислота, хлорид калия, хлорид натрия, глицерин и гидрокарбонат натрия.
Эжектируемая жидкость может включать вещество для коррекции вкуса и запаха, такое как сахарид, подобный глюкозе и сорбиту, подсластитель, подобный astel palm, ментол и различные ароматизаторы. Кроме того, подходящим корригирующим веществом может быть не только гидрофильное соединение, а также гидрофобное соединение или маслянистое вещество.
В тех случаях, когда эжектируемую жидкость по настоящему изобретению используют для получения биочипа и биосенсора или для скрининга белка, может быть использована система, примерно похожая на коммерчески доступный в настоящее время струйный принтер.
Способ эжектирования белка с использованием эжектируемой жидкости по настоящему изобретению сейчас будет описан подробно с ссылкой на Фиг.1. Модель получали стадиями: наполнения эжектируемой жидкости в сопло струйной головки 3 из резервуара 1; и осуществления струйной головкой выброса эжектируемой жидкости на подложку 5, подходящей для любой цели, направляя струйную головку при сохранении фиксированного расстояния между субстратом и торцом сопла струйной головки. На фиг.1 номер позиции 2 обозначает канал потока жидкости, номер позиции 4 обозначает мелкие жидкие капли и номер позиции 6 обозначает регулятор движения. Рекомендуется использовать регулятор движения при эжектировании эжектируемой жидкости для получения модели в соответствии со стандартным изображением на субстрате, и предпочтительно сформировать такую модель, чтобы пятна не соединялись друг с другом, как показано на фиг.2.
Эжектируемая жидкость по настоящему изобретению может включать различные вспомогательные вещества, пригодные для распыления жидкости, например, соответствующее количество регулятора поверхности, модификатора вязкости, растворителя и увлажняющего агента, по мере необходимости.
В частности, смешиваемые вспомогательные компоненты включают, например, гидрофильное связующее вещество, гидрофобное связующее вещество, гидрофильный загуститель, гидрофобный загуститель, производные гликолей, спирты, вещества, корригирующие вкус, вещества, корригирующие запах, и электролиты, которые могут представлять собой отдельное вещество или смесь, выбранную из них.
Здесь, различные вещества, используемые для приведенных выше в качестве примера вспомогательных компонентов, более предпочтительно представляют собой вещества, разрешенные для медицинского применения, описанные в фармакопее каждой страны как вторичные компоненты, которые могут быть добавлены при получении жидкой композиции для лечения или в пищевом продукте и косметическом продукте.
Различные вещества, смешиваемые в качестве описанных выше вспомогательных компонентов, предпочтительно добавляют каждый в диапазоне от 0,01 до 40% в массовом соотношении, и более предпочтительно в интервале от 0,1 до 20%, хотя значение зависит от типа конкретного белка и пептида. Кроме того, количество добавляемого вспомогательного компонента, описанного выше, предпочтительно составляет от 0,5 до 200 массовых частей к 1 массовой части вышеописанного белка и пептида с точки зрения должного эжектирования, хотя количества изменяются в зависимости от типа, количества и сочетания вспомогательных компонентов.
Распылитель по настоящему изобретению предпочтительно имеет конструкцию, содержащую элемент эжектирующей головки, которая может выбрасывать мелкие жидкие капли жидкой композиции при воздействии на жидкую композицию тепловой энергией, и работает по тепловому струйному принципу, и множество выталкивателей для жидкой композиции, которые составляют элемент головки и ими можно управлять независимо. Кроме того, распылитель предпочтительно имеет форму, снабженную: элементом электрической схемы, используемой для соединения множества контрольных сигналов, необходимых для независимого управления каждого выталкивателя жидкой композиции, объединенным проводом для соединения выталкивателей жидкой композиции друг с другом; кроме того, резервуар для размещения вышеописанной жидкой композиции; и полностью скомпонованный картридж для распыления жидкости при включении пути потока жидкости, который предназначен для подачи жидкой композиции от резервуара к эжектирующей головке, на основе теплового струйного принципа.
На Фиг.3 схематично показан пример полной конфигурации такого картриджа для распыления жидкости. Картридж, показанный на фиг.3, получают расположением элемента головки 9 для распыления жидкой композиции, резервуара 7 для наполнения его жидкой композицией и пути потока жидкости 8 для введения жидкой композиции из резервуара 7 к элементу головки 9, в целом на той же подложке. Блок управления движением каждого выталкивателя жидкой композиции в элементе головки 9 преобразует управляющий сигнал, контрольный сигнал и подобные с элемента головки 9 через элемент электрической схемы 11, к которому присоединен внутренний провод 10.
В вышеупомянутой схеме в элементе головки 9 предпочтительно используют головку для эжектирования сверхмелкой жидкой капли, которая выбрасывает жидкие капли с индивидуальным количеством жидкости порядка субпиколитров или фемтолитров, имеет превосходную возможность регулирования количества жидкости и описана в выложенной патентной заявке Японии № 2003-154655.
В примерах, приведенных на Фиг.1 и Фиг.3, распыляют одну разновидность жидкой композиции так, чтобы в конструкции находился один резервуар для наполнения его жидкой композицией. При распылении двух или более типов жидких композиций ситуацию можно разрешить путем размещения множества резервуаров для наполнения жидкими композициями, должным образом в соответствии жидкостям, и вынуждая тепловую струйную головку принимать конфигурацию интегрированного множества выталкивателей для жидких композиций.
При эжектировании эжектируемой жидкости настоящего изобретения на подложку с использованием струйной системы также возможно, чтобы подложка эффективно взаимодействовала с определяемым веществом путем эжектирования раствора, содержащего определяемое вещество, на подложку в той же модели, и изменять концентрацию белка, только изменяя эжектируемое количество. Соответственно распылитель может быть использован для изготовления биочипа, биосенсора и устройства для определения и скрининга биологического вещества. Кроме того, распылитель эффективно используют, применяя головку, способную эжектировать вышеописанные мелкие жидкие капли, когда требуется использовать вышеописанную чрезвычайно мелкую микрокаплю в качестве индивидуально эжектируемой жидкой капли, например, когда соматическая клетка, размером несколько микрометров, должна применяться в качестве лекарственного средства.
В ингаляционном устройстве по настоящему изобретению используется преимущество особой формы ингаляционного устройства, которое отделяет процесс преобразования жидкой композиции в мелкую жидкую каплю от процесса смешивания атомизированной мелкой жидкой капли в потоке воздуха для транспортировки мелкой жидкой капли, что является особенностью способа распыления по настоящему изобретению. При распылении жидкого состава, содержащего эжектируемую жидкость (жидкую композицию) в заранее определенной концентрации, которая указана в настоящем изобретении и может быть использована для терапевтической цели, в потоке воздуха, и при введении человеку ингаляционным путем атомизированной жидкой композиции в ингаляционном устройстве можно произвольно установить количество лекарственного соединения (для однократной дозы) в жидкой композиции, содержащейся во вдыхаемом газе, который может быть использован с терапевтической целью. Ингаляционное устройство, используемое с вышеупомянутой целью, может быть миниатюризировано так, чтобы пользователь мог его носить и держать, используя эжектирующую головку, основанную на тепловом струйном принципе, которая располагает отверстиями для эжектирования из него мелких жидких капель с высокой плотностью на единицу площади в качестве механизма распыления для распыления вышеописанной жидкой композиции.
В ингаляционном устройстве, в котором используется вышеописанная эжектируемая жидкость для легочной ингаляции, неотъемлемой частью является устройство, которое может эжектировать вещество в композиции по настоящему изобретению в виде мелких жидких капель с размерами частиц от 1 до 5 мкм и с узким интервалом распределения. Элемент головки для эжектирования жидкой капли является сменным элементом картриджа, который был описан выше с ссылкой на Фиг.3.
Ингаляционное устройство в виде регулятора эжектирования собрано таким образом, чтобы пользователь мог его носить и держать, и ингалятор дает пользователю возможность вдыхать лекарственное средство в виде жидких капель, которые эжектированы таким образом, что имеют однородный размер частиц и постоянное количество.
Краткое описание примера ингалятора, подходящего для использования в настоящем изобретении, сейчас будет дано со ссылкой на Фиг.4 и Фиг.5.
На Фиг.4 показан вид в перспективе, представляющий внешний вид ингалятора, позиция номер 15 обозначает корпус ингалятора, а позиция номер 12 обозначает крышку, они оба образуют кожух. Позиция номер 14 обозначает кнопку включения. На Фиг.5 показан вид, при котором крышка 12 открыта. Когда крышка 12 открыта, виден элемент головки картриджа 16 и загубник 13. Когда пользователь начинает ингаляцию, воздух идет в загубник 13 из воздухозаборника, смешивается с лекарственным средством, эжектируемым из отверстия для эжектирования, которым снабжен элемент головки 9 головки картриджа 16, для образования жидкой смеси, и идет к выходному отверстию загубника, имеющему определенную форму, для введения в рот пациента. Пользователь может эффективно вдыхать раствор лекарственного средства, эжектируемого в виде жидких капель из части головки картриджа, эжектирующей жидкость, вставляя наконечник загубника в рот, удерживая его зубами и вдыхая воздух.
Другими словами, конфигурация части входного отверстия соответствует механизму ингаляции, при котором человек, нуждающийся во введении, вдыхает газ, в котором жидкие мелкие капли жидкой композиции, полученные путем распыления, распространяются в виде тумана.
На Фиг.4 и Фиг.5 показан пример конфигурации ингалятора, используемого с медицинской целью, который миниатюризирован таким образом, чтобы пользователь мог его носить и держать. Корпус 15 ингалятора состоит из кожуха для размещения картриджа для распыления жидкости, его регулятора и источника питания (батарея); и установленного на нем загубника 13, закрывающего рот при вдыхании воздуха. Картридж для распыления жидкости объединен с резервуаром для жидкой композиции, как показано на фиг.3, и имеет такое расположение, что ее можно заменить после открытия крышки 12. На Фиг.5 показан вид с открытой крышкой 12. Головка элемента картриджа 16 установлена приблизительно на середине цилиндрического канала потока воздуха для введения воздуха, который идет таким образом от отверстия воздухозаборника к загубнику 8. Часть, относящаяся к головке элемента картриджа 16, преобразует жидкую композицию в мелкие жидкие капли, по принципу тепловой струйной системы, и в цилиндрическом канале потока воздуха они смешиваются и дробятся. В ингаляторе используется система введения в него воздуха через отверстие воздухозаборника, когда пользователь берет в рот загубник 13 и через загубник вдыхает воздух.
Принимая конфигурацию, показанную на Фиг.5, ингалятор достигает формы, которая позволяет раздробленным мелким жидким каплям жидкой композиции свободно попадать в глотку и трахею человека, которому проводят такое введение, вместе с вдыхаемым воздухом. Соответственно количество (доза) жидкой композиции, подлежащее дроблению, не зависит от изменяющихся объемов вдыхаемого воздуха и независимо контролируется. В частности, в относящейся к головке части элемента картриджа 16 используется головка для эжектирования сверхмелких жидких капель, описанная в выложенной патентной заявке Японии № 2003-154655 и имеющая конфигурацию контроля диаметра капель приблизительно в среднем до 3 мкм.
Примеры
Прежде всего, для дальнейшего облегчения понимания трудности эжектирования раствора белка, будет показано эжектированное количество белка, когда тепловой струйной системой эжектировался только белок. Раствор белка готовили растворением альбумина в PBS, и раствор каждой концентрации эжектировали с использованием теплового струйного принтера (торговое наименование: PIXUS950i, производимый фирмой Canon Inc.), который был переоборудован таким образом, что эжектируемый раствор мог быть извлечен. Количество каждого эжектируемого раствора альбумина выражалось значением относительно 100% эжектированного количества чистой воды, эжектируемой таким же способом. Результаты показаны на Фиг.6.
Понятно, что раствор, содержащий альбумин, даже в низкой концентрации 1 мкг/мл стабильно полностью не эжектируется, а поскольку раствор содержит большее количество белка, он эжектируется медленно и с трудом. В тех случаях, когда проведение такой операции необходимо в настоящем изобретении, должны эжектироваться мелкие жидкие капли меньшего диаметра, можно допустить, что раствор белка эжектируется с трудом.
Настоящее изобретение далее будет описано более подробно со ссылкой на приведенные ниже Примеры, но Примеры представляют собой конкретные примеры, представленные для более глубокого понимания, и настоящее изобретение вовсе не ограничивается этими конкретными примерами. Здесь и далее «%» означает % по массе.
Примеры 1-12 и Сравнительные Примеры 1-13
Подтверждение диаметра атомизированной частицы
Водный раствор, содержащий 30% этанола, наполняли в головку картриджа с диаметром сопла 3 мкм, используемым в экспериментальном эжектировании, и размер и распределение по размеру эжектированных частиц подтверждали измерением с использованием измерительного прибора распределения размера частиц лазерно-диффракционного типа (Spraytec, производимого фирмой Malvern Instruments Ltd.). В результате было определено, что эжектированные частицы, вне всякого сомнения, представляют собой мелкие жидкие капли с точным распределением размера частиц 3 мкм.
Образование мелких жидких капель из раствора белка по принципу тепловой струйной системы
Эжектируемую жидкость получали стадиями: предварительного растворения соответствующей концентрации альбумина в очищенной воде; затем добавления соединения, имеющего бетаиновый скелет при перемешивании раствора; и затем количественного определения объема с очищенной водой, так, чтобы концентрация каждого вещества имела желаемую концентрацию.
Полученную эжектируемую жидкость эжектировали стадиями: наполнения эжектируемой жидкости в описанную выше головку картриджа с диаметром сопла 3 мкм; соединения головки картрижда с регулятором эжектирования; установления частоты на 20 кГц и напряжения на 12 В; эжектирования эжектируемой жидкости в течение одной секунды; и повторное эжектирование ее через интервал 3 секунды. Эжектируемая жидкость выбрасывалась по принципу тепловой струйной системы. Процесс эжектирования повторяли 50 раз, и выброс эжектируемой жидкости контролировали визуально. Эжектируемая жидкость, которая была выпущена за 50 операций, оценивалась как «o», эжектируемая жидкость за 15-49 операций - как «Δ», а эжектируемая жидкость, выпущенная менее чем за 15 операций, как «×». Кроме того, атомизированную эжектируемую жидкость возвращали и устанавливали наличие изменений композиции, анализируя эжектируемые жидкости до и после эжектирования, с помощью ВЭЖХ-анализа (условия измерения для прибора: JASCO Corporation; колонка: YMC-Pack Diol-200, 500×8,0 мм ID; элюент: жидкость, содержащая 0,1 M KH2PО4-K2HPО4 (pH 7,0) 0,2 M NaCl; скорость потока: 0,7 мл/минуту; температура: 25°C; измерение: УФ 215 нм). Приведенный ниже тест эжектирования проводили в вышеописанных условиях, с использованием головки картриджа с описанным выше соплом диаметром 3 мкм и регулятора эжектирования.
В качестве сравнительного примера получали эжектируемую жидкость, содержащую чистую воду, различные растворы белков и веществ, не имеющих отношения к настоящему изобретению, и проводили эксперимент по эжектированию, как в настоящих примерах. Композиции и результаты исследования Примеров и Сравнительных Примеров представлены в следующей Таблице 1.
Чистая вода в Сравнительном Примере 1 стабильно эжектировалась, поскольку не содержала белка, тогда как эжектирование жидкостей Сравнительных Примеров 2-13, не содержащих соединения, имеющего бетаиновый скелет, было незначительным или не было вовсе, несмотря на тип белка и наличие или отсутствие вспомогательных веществ. Жидкости Сравнительных Примеров 11-13, содержащие поверхностно-активное вещество TWEEN, эжектировались в некоторой степени, но не эжектировались достаточно стабильно. Понятно, что в отличие от этого, в Примерах 1-12 эжектрирование было нормальным и стабильным. В результате ВЭЖХ анализа в Примерах 1-12 не было показано изменений в положении пика и площади пика до и после эжектирования, а также изменения жидкой композиции.
Примеры 13 и 14
Воздействие на каждый белок и концентрацию вспомогательного вещества
В дальнейшем лаурамидпропил-бетаин или кокамидпропил-бетаин был выбран в качестве соединения, имеющего бетаиновый скелет, и его добавляли к каждому белку, чтобы была получена заданная концентрация. Эти эжектируемые жидкости оценивали с помощью такого же экспериментального эжектирования, как в Примере 1. Композиции и результаты исследования настоящих примеров приведены в следующей Таблице 2.
Хотя необходимая концентрация добавляемого алкиламидпропил-бетаина варьирует в зависимости от концентрации и типа белка, добавление алкиламидпропил-бетаина приводит к нормальному эжектированию каждого белка по принципу тепловой струйной системы, и было подтверждено, что алкиламидпропил-бетаин проявляет эффект в широком диапазоне белков при небольшом количестве. В результате ВЭЖХ анализа в Примерах 13 и 14 не было показано изменений в диаграмме пиков до и после эжектирования, и изменения жидкой композиции.
Примеры 15-19
Синергетический эффект соединения, имеющего бетаиновый скелет, и поверхностно-активного вещества
Раствор готовили добавлением соединения, имеющего бетаиновый скелет, к белку, и эжектируемую жидкость готовили путем дополнительного добавления в раствор поверхностно-активного вещества. Эти эжектируемые жидкости оценивали с помощью того же экспериментального эжектирования, как в Примере 1. Композиции и результаты исследования настоящих примеров приведены в следующей Таблице 3.
Раствор белка, одновременно содержащий алкиламидпропил-бетаин и TWEEN в качестве вспомогательного вещества, можно было эжектировать даже при чрезвычайно низкой концентрации соединения, имеющего бетаиновый скелет, по сравнению с тем случаем, когда добавляли только соединение, имеющее бетаиновый скелет. Кроме того, раствор белка можно было эжектировать даже при содержании соединения, имеющего бетаиновый скелет, в такой концентрации, при которой раствор белка не мог быть эжектирован при отдельном содержании его в том же количестве. В результате общее количество вспомогательного вещества может быть значительно снижено. В результате ВЭЖХ анализа в Примерах 15-19 не показано изменений в диаграмме пиков до и после эжектирования, и изменения жидкой композиции.
Пример 20
Получение антительного чипа с использованием струйного принтера, и обнаружение
Моноклональное антитело к IL2 человека, моноклональное антитело к IL4 человека и моноклональное антитело к IL6 человека получали в виде жидкости с концентрацией от 0,1 до 500 мкг/мл соответственно. Каждую эжектируемую жидкость готовили путем добавления в жидкость лаурамидпропил-бетаина, так, чтобы концентрация бетаина составляла 1% (мас./мас.). Эжектируемой жидкостью заполняли головку струйного принтера (торговое наименование: PIXUS950i, произведенного фирмой Canon Inc.), и жидкость эжектировали на предметное стекло, покрытое поли-L-лизином. На Фиг.7 представлена иллюстрация модели настоящего примера. На этой фигуре позиция номер 17 обозначает подложку, позиция номер 18 обозначает маскирующий реагент, позиция номер 19 обозначает вещество (такое как белок и пептид), специфически взаимодействующее с определяемым веществом, номер позиции 20 обозначает определяемое вещество, номер позиции 21 обозначает вещество, специфически взаимодействующее с определяемым веществом, и номер позиции 22 обозначает индикатор.
Антитело, эжектированное на стекло, инкубировали при 4°C, и стекло, на котором инкубировали антитело, защищали 1% BSA. После защиты стекло осторожно очищали и представляли в качестве подложки антительного чипа. После этого раствор, содержащий 1 мкг/мл каждого из рекомбинантных IL2, IL4 и IL6, которые представляли собой вещества, определяемые с помощью этого чипа, готовили совместно с 1,0% лаурамидпропил-бетаином (мас./мас.), 0,5% TWEEN 20 (мас./мас.) и 0,1% BSA (мас./мас.). Этой жидкостью наполняли головку струйного принтера (торговое наименование: PIXUS950i, производимого фирмой Canon Inc.), и жидкость эжектировали на описанную выше подложку, так, чтобы получилось такое же расположение. После эжектирования жидкости подложку накрывали покровным стеклом, и реакция протекала при 4°C. После взаимодействия подложку осторожно очищали и сушили.
После этого субстрат специфически связывался с образцом, который взаимодействовал с субстратом, и выявлялось вещество. Раствор, содержащий вещество, специфически связывающееся с образцом, получали перемешиванием по 1 мкг/мл раствора антитела, меченого биотином (биотинилированное моноклональное антитело к IL2 человека, биотинилированное моноклональное антитело к IL4 человека и биотинилированное моноклональное антитело к IL6 человека), 1,0% лаурамидпропил-бетаина (мас./мас.), 0,5% TWEEN20 (мас./мас.) и 0,1% BSA (мас./мас.), так, чтобы каждый компонент находился в своей конечной концентрации; раствором заполняли головку струйного принтера (торговое наименование: PIXUS950i, производимый фирмой Canon Inc.); и эжектировали на вышеописанную подложку, так, чтобы получилось такое же расположение. После эжектирования жидкости подложку накрывали покровным стеклом, и реакция протекала при 4°C. После взаимодействия подложку осторожно очищали и сушили.
Раствор для обнаружения готовили смешиванием 10 мкг/мл стрептавидина, меченного Cy3, 1,0% лаурамидпропил-бетаина (мас./мас.), 0,5% TWEEN20 (мас./мас.) и 0,1% BSA (мас./мас.), так, чтобы каждый компонент находился в конечной концентрации; затем им заполняли головку струйного принтера (торговое наименование: PIXUS950i, производимый фирмой Canon Inc.); и эжектировали на описанную выше подложку таким образом, чтобы получилось такое же расположение. После эжектирования жидкости подложку накрывали покровным стеклом, и реакция протекала при 4°C. После взаимодействия подложку осторожно очищали и сушили.
После этого подложку, на которой завершилась реакция, подвергали воздействию возбуждающего света, и количество флуоресцентного сигнала, испускаемого Cy3, измеряли с использованием флуоресцентного сканера с расположенным в нем фильтром, пропускающим волны длиной 532 нм. В качестве результата измерения можно было определить флуоресцентный сигнал, соответствующий типу и концентрации образца.
Настоящее изобретение не ограничивается приведенными выше вариантами осуществления и возможны различные изменения и модификации в пределах сущности и объема настоящего изобретения. Следовательно, чтобы проинформировать общество об объеме настоящего изобретения, составлена следующая формула изобретения.
По этой заявке испрашивается приоритет по патентной заявке Японии № 2005-098749, поданной 30 марта 2005, которая включена сюда путем ссылки.
Изобретение относится к медицине и касается жидкой композиции в качестве эжектируемой жидкости, используемой для стабильного эжектирования мелких жидких капель, включающей в себя по меньшей мере одну разновидность белка и пептида, и соединение, имеющее бетаиновый скелет, путем воздействия на эту жидкость тепловой энергией; способа получения капель из этой жидкости; и способа эжектирования и эжекционного устройства, подходящего для использования мелких жидких капель белка. Дополнительно к жидкой композиции, содержащей соединение, имеющее бетаиновый скелет, можно добавить поверхностно-активное вещество. Изобретение обеспечивает улучшенную стабильность жидкой композиции при эжектировании под воздействием тепловой энергии. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 табл.
1. Эжектируемая жидкость, содержащая по меньшей мере одну разновидность белка и пептида, которая эжектируется при воздействии на нее тепловой энергией, и дополнительно содержащая соединение, имеющее бетаиновый скелет, обладающее свойством поверхностно-активного вещества, и жидкую среду, в основном состоящую из воды.
2. Эжектируемая жидкость по п.1, где соединение, имеющее бетаиновый скелет, представляет собой соединение следующей формулы (I):
где R1 представляет замещенную или незамещенную алкильную группу, имеющую от 6 до 18 атомов углерода;
R2 и R5 представляют алкиленовую цепь, имеющую от 1 до 6 атомов углерода;
R3 и R4 представляют алкильную группу или алкиленовую цепь, имеющую от 1 до 6 атомов углерода;
R3 и R4 могут быть связаны друг с другом с образованием гетероциклического кольца;
A представляет карбоксильную группу, сульфоновую группу или анион;
X1 и X2 представляют противоион; и n равно 0 или 1.
3. Эжектируемая жидкость по п.1, где соединение, имеющее бетаиновый скелет, представляет собой по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из алкиламид-алкилбетаина и его соли, и его производного.
4. Эжектируемая жидкость по п.1, где белок и пептид представляют собой вещество, выбранное из группы, состоящей из кальцитонина, инсулина, глюкагона, интерферона, ингибитора протеазы, цитокина, гормона роста, белкового гематопоэтического фактора, антитела и их аналогов, и их производных.
5. Эжектируемая жидкость по п.1, дополнительно содержащая поверхностно-активное вещество.
6. Эжектируемая жидкость по п.5, где поверхностно-активное вещество представляет собой полиоксиэтилен-сорбитановый эфир жирной кислоты.
7. Способ эжектирования, включающий эжектирование эжектируемой жидкости по п.1 по принципу струйной системы.
8. Способ эжектирования, включающий эжектирование эжектируемой жидкости по п.1, по принципу тепловой струйной системы.
9. Способ получения капель из жидкости, содержащей по меньшей мере одну разновидность белка и пептида, путем воздействия на жидкость тепловой энергией, где жидкость дополнительно содержит соединение, имеющее бетаиновый скелет, со свойством поверхностно-активного вещества.
10. Способ получения капель из жидкости по п.9, где белок и пептид представляют собой вещество, выбранное из группы, состоящей из кальцитонина, инсулина, глюкагона, интерферона, ингибитора протеазы, цитокина, гормона роста, белкового гематопоэтического фактора, антитела и их аналогов и производных.
11. Способ получения капель из жидкости по п.9, где жидкость дополнительно содержит поверхностно-активное вещество.
12. Способ получения капель из жидкости по п.9, где этим способом получают мелкие жидкие капли из жидкости, путем воздействия на эту жидкость тепловой энергией по принципу тепловой струйной системы.
| JP 2004532861 T, 28.10.2004 | |||
| JP 5065203, 19.03.1993. |
