ШТАММ MEGASPHAERA ELSDENII И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2009 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 A61P1/14 C12R1/01 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение касается нового штамма Megasphaera elsdenii и его применения. Изобретение также касается препаратов и способов со включением этого штамма. Изобретение также касается кормов для жвачных животных и препарата и способа предупреждения и лечения лактоацидоза у жвачных животных.

Предшествующий уровень техники

Лактоацидоз

Лактоацидоз - это расстройство пищеварения у жвачных животных, которое может возникнуть при внезапном чрезмерном потреблении легко ферментируемых углеводов, в частности, при переходе от грубых кормов на высококалорийные или калорийные концентраты с высоким содержанием крахмала. Заболевание характеризуется накоплением органических кислот, особенно молочной кислоты, в рубце (Dawson & Allison, 1988). Исследования показали, что основной причиной возникновения лактоацидоза является сильный дисбаланс между количеством бактерий, продуцирующих молочную кислоту, и бактерий, утилизирующих молочную кислоту, который возникает при внезапном увеличении доли легко ферментируемых углеводов в пище (Slyter, 1976).

Способы контроля над популяцией бактерий в рубце для предупреждения лактоацидоза путем введения материала, содержащего большое количество утилизирующих молочную кислоту бактерий, предлагались в течение десятилетий, но никогда не практиковались в широком масштабе. Повышение утилизации лактата в рубце осуществляли введением жидкости из рубца заранее адаптированных животных (Allison et al., 1964; Braun et al., 1992) и введением чистых или смешанных штаммов бактерий, утилизирующих лактат (1251483, Wilker et al., 1971; 3857971, Abdo & Cahilly, 1974; 4138498, Das, 1979; 5380525, Leedle et al., 1991; Hession & Kung, 1992; Robinson et al, 1992; Wiryawan & Brooker, 1995).

Некоторые из таких кормовых добавок, содержащих штаммы живых бактерий, были запатентованы (1251483, Wilker et al., 1971; 3857971, Abdo & Cahilly, 1974; 4138498, Das, 1979; 5380525, Leedle et al., 1991), но совсем или почти совсем не нашли коммерческого применения. В трех из этих патентов (1251483, Wilker et al., 1971; 3857971, Abdo & Cahilly, 1974; 4138498, Das, 1979) культуры получали в ферментерах для непрерывного культивирования при исходной инокуляции их рубцовой жидкостью. Однако животные-доноры не обязательно были адаптированы к рациону с высоким содержанием концентратов. К тому же нет сведений о pH-толерантности этих культур. В другом патенте (5 380 525, Leedle et al., 1991) культуры были выделены при pH 5,3 прямо или косвенно после обогащения из жвачных животных, адаптированных к рациону с высоким содержанием концентратов.

Встречаемость подострого и острого ацидоза у молочного скота

Подострый ацидоз рубца является распространенной и серьезной проблемой здравоохранения и производства в молочной промышленности, так как молочных коров обычно кормят кормами, содержащими большую долю зерновых. Подострый и острый ацидоз рубца представляют собой просто разные степени одной и той же проблемы. Острый ацидоз рубца протекает в более тяжелой форме, и могут быть серьезно нарушены физиологические функции. Заболевшее животное депрессивно, обычно атаксично, не принимает корм, зрачки расширены и сердцебиение учащено. Может возникнуть понос, животное может упасть и умереть в течение 2-5 дней после поражения (Nordlund, 1995). Острый ацидоз характеризуется резким уменьшением pH в рубце (≤5,0), сильным повышением концентрации молочной кислоты и сильным уменьшением количества протозойных организмов (Nocek, 1997).

Симптомы подострого ацидоза рубца весьма отличаются от симптомов острого ацидоза. Современные хозяйственные системы группового содержания и группового кормления молочного скота затрудняют выявление этих симптомов, так как отдельные коровы с такими проблемами обычно не заметны внутри группы. В стадах с подострым ацидозом рубца проявляются некоторые или все из следующих симптомов: ламинит, перемежающийся понос, плохой аппетит или циклический прием корма, высокие показатели отбраковки в стаде по нечетко определяемым проблемам здоровья, плохое состояние организма, несмотря на адекватное потребление энергии, абсцессы без видимых причин и гемоптизис (кашель кровью) или эпистаксиз (кровотечение из носа). Большинство из этих симптомов являются вторичными вследствие ацидоза и большинство из них не проявляются в течение недель или месяцев после начала ацидоза. В отличие от мясного (откармливаемого) скота, молочные коровы содержатся в течение ряда лет, поэтому контроль над ацидозом представляется важным для увеличения прибыли.

Хронический ламинит, по-видимому, является самым устойчивым клиническим признаком в стаде с подострым ацидозом рубца. Несмотря на то, что взаимосвязь между ацидозом и ламинитом не совсем понятна, она общепризнанна клинически и продемонстрирована в исследовательских опытах (Kelly & Leaver, 1990; Manson & Leaver, 1988; Nocek, 1997). Кроме того, большинство хозяйственников, ветеринаров и специалистов по питанию имеют склонность недооценивать и даже терпимо относиться к аномальной встречаемости ламинита и хромоты в стадах молочных коров. Обследование в Миннесоте показало, что средняя частота хромоты составляет 15% с диапазоном 0-33% (Nordlund, Garret & Oetzel, 1995). Исследования в Европе показали, что хромота стоит на третьем месте по затратам на лечение у молочных коров после мастита и репродукции (McDaniel & Wilk, 1989). Таким образом, лечение ацидоза имеет огромную важность.

Главным симптомом подострого ацидоза является снижение потребления корма и снижение эффективности выработки молока. Подострый ацидоз, вследствие трудностей в его диагностике, обычно игнорируют, поскольку другие проблемы, такие как плохое ведение хозяйства, плохое качество корма и т.д. вызывают большие убытки у многих фермеров, поэтому он вездесущ, особенно в высокопродуктивных молочных стадах.

Вследствие высокой частоты алиментарных и метаболических нарушений среди высокопродуктивных молочных коров, алиментарные подходы к улучшению производительности с помощью кормов на основе зерновых сосредоточены на предупреждении дисфункции рубца путем контролирования продукции кислоты или стимулирования более эффективного роста микроорганизмов. В настоящее время важную роль в этом отношении играют кормовые добавки (Hutjens, 1999). Применение культуральных штаммов дрожжей, специфически стимулирующих рост бактерий, утилизирующих молочную кислоту, вызывает большой интерес, и недавнее обследование показало, что дрожжевые культуры применяются в 33% высокопродуктивных стад Висконсина. Результаты различных исследований свидетельствуют, что штамм Yea Sacc 84170 особенно хорошо подходит для изменения ферментации в рубце и продуктивности животных, когда он применяется в силосе с высоким уровнем лактата и в кормах с высоким содержанием питательных веществ (Dawson, 1995). Результаты по продуктивности, однако, не очень устойчивы. В США стоимость добавления дрожжевых культур составляет 4-6 центов на корову в день (Hutjens, 1999). Ионофоры, вследствие их способности к предотвращению роста важных продуцентов молочной кислоты, также могут играть роль в борьбе с подострым ацидозом. Хотя их стоимость сравнительно низкая (1-2 цента на корову в день, Hutjens, 1999), существует определенное сопротивление применению ионофоров из-за нескольких недавних случаев токсичности ионофоров. Кроме того, ионофоры не зарегистрированы в США для применения в кормах для молочного скота.

Экспериментальным путем установлено, что некоторые бактерии перспективны в качестве непосредственно скармливаемых микроорганизмов (DFM) для жвачных животных, но они не нашли коммерческого применения по нескольким причинам. Например, Megasphaera elsdenii (ME) является основным утилизирующим лактат организмом в рубце адаптированного скота, потребляющего корма с высоким содержанием зерна. При переходе от фуража на рацион с высоким содержанием концентратов количество ME зачастую недостаточно для предотвращения лактоацидоза. Kung and Hessian (1995) показали, что добавление ME штамма В 159 предотвращает накопление молочной кислоты при скармливании хорошо сбраживаемых углеводов. Robinson et al. (1992) показали, что добавление другого штамма ME (407А) предотвращает лактоацидоз у кастрированных бычков.

Несмотря на то, что затраты, связанные с субклиническим ацидозом рубца, трудно определить, возможные затраты в молочной промышленности огромны (Hall, 1999). По консервативной оценке Donovan (1997), затраты при субклиническом ацидозе в молочной промышленности США составляют от 500 млн. до 1 трлн. долларов в год.

Elsden and Lewis (1953) впервые описали большого, строго анаэробного, грам-отрицательного, продуцирующего жирные кислоты неподвижного кокка, выделенного из рубца овец. Однако первоначальный изолят был утерян и не был подробно охарактеризован фенотипически. Через несколько лет Элсден и сотр. (Elsden et al., 1956) выделили организм, напоминающий первоначальный штамм, из содержимого рубца овец. Характеристики этого организма не совпадали с описанием ни одного известного в то время вида, но ввиду небольшого изученного числа изолятов авторы воздержались от отнесения его к новому виду и роду, а называли его LC. Gutierrez et al. (1959) встретили похожий организм в рубцах вздувшегося скота и сделали вывод, что он соответствует определению рода Peptostreptococcus, предложив учредить новый вид P.elsdenii. Впоследствии Rogosa (1971) показал, что изоляты типа LC грам-отрицательны и поэтому не должны включаться в род Peptostreptococcus. Он предложил перенести P.elsdenii в новый род Megasphaera и новую комбинацию M.elsdenii, с изолятом LC1 согласно Elsden et al. (1956) в качестве типового штамма. M.elsdenii является строгим анаэробом, который встречается главным образом в рубце молодых животных и животных, получающих корма с высоким содержанием концентратов, у которых сбраживание лактата сильно выражено. Этот организм также иногда выделяли из кала человека (Sugihara et al., 1974), причем он сбраживает лактат в основном до бутирата, пропионата, изобутирата, валерата, CO₂, H₂ и иногда следовых количеств капроата (Stewart and Bryant, 1988). Поскольку микроорганизм M.elsdenii не подвержен катаболитной репрессии глюкозой или мальтозой, как Selenomonas, который тоже утилизирует лактат и встречается в рубце, то его вклад в катаболизм лактата особенно повышается при скармливании растворимых углеводов (Stewart and Bryant, 1988).

В патенте США 3956482 (Hahn et al., 1976) описан способ повышения продукции молока у жвачных животных, включающий введение в рубец дойных коров микроорганизмов, продуцирующих ацетат, состоящих из смеси 0-4% M.elsdenii, 30-42% Streptococcus bovis, 3-10% Lactobacillus acidophilus, 12-20% Bifidobacterium adolescentis, 18-44% Bacteroides ruminicola и 3-12% Butyrivibrio fibrisolvens, культивируемых и адаптированных к питательной среде.

Основным недостатком изобретения, раскрытого в вышеуказанном патенте, является сравнительно высокое содержание (30-42%) Streptococcus bovis, который вместе с Lactobacillus является главной причиной лактоацидоза у жвачных. Кроме того, эта смесь содержит сравнительно мало M.elsdenii (0-4%), и введение этой смеси скорее будет усиливать или вызывать лактоацидоз рубца, а не предотвращать или излечивать его. Более того, смесь подвергается воздействию атмосферы, так что большая часть M.elsdenii погибает. Кроме того, смесь микроорганизмов значительно труднее контролировать, чем чистую культуру.

В патенте США 4138498 (Das, 1979) описана кормовая добавка для введения жвачным животным для предупреждения или минимизации лактоацидоза при переводе их с грубого корма на крахмал, которая включает штамм бактерий M.elsdenii в смеси с поедаемой кормовой добавкой. M.elsdenii - строгий анаэроб, поэтому недостатком кормовой добавки, раскрытой в этом патенте, в добавление к недостаткам, изложенным ниже, является то, что M.elsdenii подвергается воздействию атмосферы, что ведет к быстрому снижению числа жизнеспособных клеток в добавке.

В патенте США 5380525 (Leedle et al., 1991) описана биологически чистая культура M.elsdenii NRRL-18624 и ее применение в облегчении адаптации жвачных животных от грубого корма или подножного корма к высококалорийному корму, обогащенному крахмалом. Эта культура страдает недостатками, изложенными ниже.

В патенте США 5529793 (Garner et al., 1996) описана смесь из бактерий, продуцирующих молочную кислоту, и бактерий, утилизирующих лактат, типа M.elsdenii в составе сухой смеси или в рационе откорма животных для улучшения утилизации корма жвачными животными. Недостатком этого изобретения является то, что M.elsdenii -весьма строгий анаэроб, поэтому ее применение в сухом корме приводит к гибели большинства клеток.

Заявители провели оценку вышеуказанных штаммов M.elsdenii и пришли к выводу, что они, в общем-то, не подходят для коммерческого применения и широкомасштабной профилактики лактоацидоза у жвачных животных вследствие следующих недостатков этих штаммов, а именно того, что они:

- не высокоактивны и не адаптированы к пролиферации в рубце животных на рационе с высоким содержанием концентратов;

- не способны к пролиферации при относительно низких значениях pH менее 5,0 и даже 4,5, что определяется как острый ацидоз;

- не устойчивы к антибиотикам-ионофорам, обычно добавляемым в рацион откорма;

- не способны к предпочтительному использованию лактата в качестве источника углерода даже в присутствии растворимых углеводов, таких как глюкоза и мальтоза.

Другие недостатки этих штаммов состоят в том, что они, в общем:

- имеют сравнительно низкую скорость роста, т.е. менее 0,938 ч^-1;

- не обладают способностью к росту на восстанавливающих сахарах, а также на лактате;

- имеют сравнительно низкую скорость накопления биомассы, т.е. менее 0,39 г(л×час)^-1;

- не устойчивы к ионофорам;

- преимущественно продуцируют пропионат и бутират, а не ацетат.

Цель изобретения

Таким образом, целью настоящего изобретения является получение новых штаммов M.elsdenii и их применение, а также препараты и способы на основе выделенных штаммов, с помощью которых вышеуказанные недостатки могут быть преодолены или по крайней мере минимизированы.

Сущность изобретения

В соответствии с первым аспектом изобретения предоставляется штамм M.elsdenii (изолят CH4), депонированного в NCIMB, Aberdeen, Scotland, UK под номером NCIMB 41125.

В соответствии со вторым аспектом изобретения предоставляется штамм M.elsdenii, имеющих практически такую же последовательность рибосомальной 16S РНК, как у штамма M.elsdenii, депонированного в NCIMB, Aberdeen, Scotland, UK под номером NCIMB 41125.

Штамм M.elsdenii по первому и второму аспектам изобретения дополнительно характеризуется:

- способностью к утилизации лактата весьма эффективно даже в присутствии сахаров;

- устойчивостью к ионофорам;

- относительно высокой скоростью роста;

- способностью к преимущественной продукции ацетата и

- способностью к пролиферации при сравнительно низких значениях pH менее 5,0 и даже 4,5.

В соответствии с третьим аспектом изобретения предоставляется композиция для облегчения адаптации жвачных животных от рациона на основе грубого корма к высококалорийному рациону на основе концентратов, причем композиция в основном состоит из штамма бактерий по первому или второму аспекту изобретения.

В соответствии с четвертым аспектом изобретения предоставляется способ облегчения адаптации жвачных животных от рациона на основе грубого корма к высококалорийному рациону на основе концентратов, который включает стадию введения в рубец указанных жвачных животных эффективного количества штамма бактерий по первому или второму аспекту изобретения.

В соответствии с пятым аспектом изобретения предоставляется кормовая добавка для жвачных животных, включающая носитель и эффективное количество штамма бактерий по первому или второму аспекту изобретения.

Предпочтительно культура размещается в анаэробном контейнере.

В соответствии с шестым аспектом изобретения предоставляется способ лечения лактоацидоза рубца и предупреждения одного или нескольких из следующего, а именно: лактоацидоза рубца, руменита, ламинита, вызванного лактоацидозом рубца, вздутия живота и абсцессов печени, вызванных лактоацидозом рубца, который включает стадию анаэробного введения в рубец жвачного животного эффективного количества штамма бактерий по первому или второму аспекту изобретения.

В соответствии с седьмым аспектом изобретения предоставляется ветеринарное средство для лечения лактоацидоза рубца и предупреждения одного или нескольких из следующего, а именно: лактоацидоза рубца, руменита, ламинита, вызванного лактоацидозом рубца, вздутия живота и абсцессов печени, вызванных лактоацидозом рубца, которое включает эффективное количество штамма бактерий по первому или второму аспекту изобретения.

В соответствии с восьмым аспектом изобретения предоставляется препарат для лечения лактоацидоза рубца и предупреждения одного или нескольких из следующего, а именно: лактоацидоза рубца, руменита, ламинита, вызванного лактоацидозом рубца, вздутия живота и абсцессов печени, вызванных лактоацидозом рубца, у жвачных животных, который включает:

- инокулят штамма бактерий по первому или второму аспекту изобретения и

- отдельную среду для анаэробного культивирования;

причем компоненты препарата размещаются в отдельных отсеках анаэробного контейнера, которые анаэробно соединяются друг с другом таким образом, чтобы можно было анаэробно инокулировать среду этой культурой.

В соответствии со следующим аспектом изобретения предоставляется способ достижения одного или нескольких из следующих улучшений у жвачных животных, а именно:

- повышения продукции молока;

- повышения эффективности откорма;

- увеличения скорости роста;

- сокращения времени откорма;

- снижения заболеваемости и смертности от нарушений пищеварения;

- уменьшения числа случаев лактоацидоза и связанных с этим заболеваний;

- улучшения эффективности переработки корма и

- способности к питанию на рационе со сравнительно высоким содержанием концентратов;

который включает стадию введения в рубец жвачного животного эффективного количества штамма бактерий по первому или второму аспекту изобретения. Предпочтительно культура вводится анаэробно.

В соответствии со следующим аспектом изобретения предоставляется способ выделения биологически чистой культуры более ценного микроорганизма рубца за сравнительно более короткий промежуток времени, чем у стандартных способов, который включает стадии:

- получения образца рубцовой жидкости и

- культивирования образца на заданной питательной среде;

причем способ отличается тем, что предварительно выбирают несколько параметров, выбранных из группы, включающей состав питательной среды, степень разбавления, pH, температуру, противомикробные средства, газовую среду, окислительно-восстановительный потенциал, нехватку питательных веществ и провоцирующие организмы, таким образом, чтобы они благоприятствовали более ценному микроорганизму рубца в ущерб менее ценным микроорганизмам рубца.

Далее изобретение будет описано более подробно на нижеследующих примерах и прилагаемых чертежах.

Краткое описание фигур

Фиг.1. График скорости роста утилизирующих лактат организмов при различных значениях pH.

Фиг.2. График скорости роста (ч^-1) утилизирующих лактат изолятов на глюкозной среде при различных значениях pH.

Фиг.3. Филогенетическое древо M.elsdenii по настоящему изобретению.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

В соответствии с настоящим изобретением организмы, способные к утилизации молочной кислоты, выделяли непосредственно из жвачных животных, адаптированных к рациону с высоким содержанием концентратов. Цель заключалась в отборе культур, обладающих наилучшей комбинацией характеристик для применения в качестве инокулята, поддающегося массовому культивированию и хранению, для профилактического и/или терапевтического лечения лактоацидоза.

Для того чтобы утилизирующие лактат бактерии были эффективными, они должны быть высокоактивными и адаптированными к размножению в рубце животных на рационе с высоким содержанием концентратов. Организмы должны быть способны к размножению при значениях pH ниже 5,0. Отобранные изоляты также должны быть устойчивыми к антибиотикам-ионофорам, которые обычно добавляют в рацион откорма. Лактат должен использоваться преимущественно в качестве источника углерода даже в присутствии растворимых углеводов, таких как глюкоза и мальтоза, которые обычно находятся в большом количестве в кормах с высоким содержанием концентратов.

Методы

1. Животные, использовавшиеся при выделении

Брали образцы содержимого из рубца животных, прошедших предварительный отбор на утилизирующие лактат бактерии, а именно: дойных коров с фистулами в Отделе питания дойных коров Совета по сельскохозяйственным исследованиям (Irene, Южная Африка), а также мясного скота Chalmar Beef (Претория, Южная Африка), которых забивали по окончании периода откорма. Все животные были адаптированы к рациону с высоким содержанием концентратов, что повышает количество встречающихся естественным образом бактерий, утилизирующих лактат.

2. Отбор и подготовка образцов

Образцы содержимого рубца из дойных коров отбирали примерно в 9:00, после того, как коров покормили и подоили. Образцы содержимого рубца мясных животных получали через 15-30 мин после забоя животных. Пластиковые флаконы с винтовыми крышками заполняли до отказа рубцовой жидкостью, профильтрованной через два слоя марли. Рубцовую жидкость переносили прямо в ферментер.

3. pH-ауксостат

Система для проточного культивирования Bioflo 1 фирмы New Brunswick Scientific была модифицирована в pH-ауксостат путем превращения поддерживающего pH насоса в насос для подачи среды. Величину pH измеряли с помощью pH-электрода Schott S23158, подсоединенного к pH-метру и титратору модели 302 фирмы Digital Data Systems. Когда pH повышался выше заданного значения, добавляли слабо забуференную среду до достижения требуемого значения. Рабочий объем сосуда для культивирования составлял 270 мл. Максимальная степень разбавления для данного организма при культивировании в ауксостате является мерой максимальной скорости роста этого организма при этих условиях.

4. Выделение утилизирующих лактат бактерий рубца при помощи ауксостата

4.1 Условия культивирования и среда

Профильтрованную рубцовую жидкость использовали для начального заполнения ферментера (270 мл) и активировали титратор для добавления стерильной среды (среда 1) в культуру пропорционально повышению pH культуры. Среда 1 представляла собой среду частично определенного состава без рубцовой жидкости, содержащую: Na-лактат (70%), 10 г/л; пептон, 2 г/л; KH₂PO₄, 1 г/л; (NH₄)₂SO₄, 3 г/л; MgSO₄·7H₂O, 0,2 г/л; CaCl₂·2H₂O, 0,06 г/л; витамины (пиридоксогидрохлорид, 4 мг/л; пиридоксамин, 4 мг/л, рибофлавин, 4 мг/л, тиаминохлорид, 4 мг/л, никотинамид, 4 мг/л; D-пантотенат кальция, 4 мг/л; 4-аминобензойная кислота, 0,2 мг/л; биотин, 0,2 мг/л; фолиевая кислота, 0,1 мг/л; цианокобаламин, 0,02 мг/л); Na₂S·9H₂O, 0,25 г/л; цистеин, 0,25 г/л; противопенная добавка, 0,07 мл/л и монензин, 10 мг/л. Na-лактат и раствор минералов вносили в бачок титратора и автоклавировали в течение 60 мин. Пептон растворяли в 300 мл дист. H₂O и автоклавировали отдельно в колбе на 1,0 л фирмы Schott с отводом на дне, снабженным стеклянным патрубком Quick-fit. Раствор витаминов стерилизовали фильтрованием перед употреблением, как и оба восстановителя. После автоклавирования через бачок титратора пропускали анаэробный газ в течение ночи и добавляли остальные компоненты по отдельности после охлаждения. Величину pH доводили до требуемого значения с помощью 5N HCl.

Запускали проточное культивирование до тех пор, пока не наблюдалась чистая культура под микроскопом. Отбирали образец из ферментера стерильным шприцом, который герметично закрывали и переносили в анаэробный кабинет (Forma Scientific, модель 1024). Одну каплю культуры штриховали на чашке Петри, содержащей 2% агар на среде 1. Затем инкубировали при 39°С в течение ночи и переносили одиночную колонию с помощью стерильной иглы и шприца в свежую среду 1, находящуюся во флаконе на 30 мл. После инкубации при 39°С в течение 24 ч культуру переносили на несколько косячков, содержащих среду 1, и инкубировали в течение ночи. Эти косячки хранили в жидком азоте для долговременного хранения.

4.2 Скорость роста изолятов в замкнутом объеме ферментера

Скорость роста изолятов проверяли методом культивирования в замкнутом объеме и измерения повышения оптической плотности по времени. Наносили на график значения натурального логарифма оптической плотности (OD) в зависимости от времени и использовали линейную часть графика для определения наклона, который представляет максимальную скорость роста организма. Определение скорости роста в замкнутом объеме проводили в хемостате на культуре, которую разводили стерильной средой до получения сильно разведенной суспензии культуры, и прекращали подачу среды, запуская культивирование в замкнутом объеме. Преимущество культивирования в хемостате для данной работы заключается в отсутствии лаг-фазы, поскольку все клетки жизнеспособны и адаптированы к этой среде.

4.3 Аналитические методы

Летучие жирные кислоты определяли методом газовой хроматографии на газовом хроматографе Carlo Erba GC4200 с пламенным детектором и колонкой Tupelo 1-1825 (Supelco Inc., Bellefonte PA, США). Рабочие условия: газ-носитель - азот, газы пламени - водород и воздух, температура колонки - 175°С, температура инжектора - 200°С. Для интегрирования пиков использовали систему обработки данных Barspec (Barspec Systems Inc., Rehovot, Israel). В качестве внутреннего стандарта служила пивалиновая кислота. Утилизация D- и L-изомеров лактата определяли энзиматически (набор Test combination 1112 821, Boehringer Mannheim Gmbh, Mannheim).

5. Выделение бактерий методом рассева на чашках

5.1 Культуральная среда

Лактатная среда с инкубированной рубцовой жидкостью (IRFL) для выделения методом рассева на чашках состояла из 400 мл инкубированной осветленной рубцовой жидкости (Olumeyan et al., 1986) из питавшихся люцерной овец, 371 мл дистиллированной воды, 2 г пептона (Merck), 15 г агара, 100 мл 10% раствора D,L-лактата натрия, 100 мл 0,04% раствора бромокрезола пурпурного и 25 мл раствора минералов, содержащего 40 г/л KH₂PO₄, 120 г/л (NH₄)₂SO₄, 8 г/л MgSO₄·7H₂O и 2,4 г/л CaCl₂·2H₂O. Молочную кислоту (90% мас./объем) использовали для доведения pH до 5,5 перед автоклавированием при 121°С в течение 25 мин. После стерилизации среду охлаждали в водяной бане на 50°С с пропусканием анаэробной газовой смеси. Асептически добавляли по 2 мл каждого из восстановителей: Na₂S·9H₂O (12,5% мас./объем) и цистеина·HCl·H₂O (12,5% мас./объем). Поскольку среда IRFL не вполне селективна для утилизирующих лактат бактерий, включали бромокрезол пурпурный для лучшего их выявления. При утилизации лактата происходит изменение ионного баланса в непосредственной близости от колонии, что вызывает повышение pH. Повышение pH свыше 6,3 проявляется как изменение окраски из желтой в пурпурную в концентрической зоне культуры.

Кислотоустойчивость определяли на чашках с IRFL-агаром при исходных значениях pH 4,4, 5,0 и 5,5.

Устойчивость к ионофорам тестировали на чашках с IRFL-агаром, содержащим 10 ppm ионофоров, обычно применяемых в кормах с высоким содержанием концентратов, а именно: монензина (Sigma) и лазалоцида (Sigma). Репрессию утилизации лактата растворимыми сахарами тестировали на чашках с IRFL-агаром, содержащим мальтозу или глюкозу в конечной концентрации 10 г/л. Положительный результат, т.е. пурпурная концентрическая зона вокруг колонии указывает на то, что скорость выделения оснований вследствие утилизации лактата превосходит скорость образования кислот из добавленного сахара. Изоляты также скринировали на агаризованной среде IRFL без лактата, но с добавлением мальтозы или глюкозы в концентрации 10 г/л для определения утилизации этих двух сахаров.

Скорость роста на мальтозе и глюкозе определяли на средах, аналогичных среде SDL, но в которых лактат был заменен глюкозой или мальтозой в концентрации 10 г/л.

5.2 Выделение и скринирование методом рассева на чашках

Образцы для выделения методом рассева на чашках разводили (Mackie & Heath, 1979) в анаэробном кабинете. Готовили чашки для рассева со средой IRFL с разведениями от 10^-4 до 10^-6 и инкубировали анаэробно при 39°С. Через 24 часа отдельные колонии с пурпурной зоной переносили в жидкую среду IRFL в микропробирках на 1,5 мл. Инокулированные микропробирки, проявлявшие изменение окраски на пурпурную в пределах 16 часов, скринировали на кислотостойкость, устойчивость к ионофорам, репрессию катаболитами и утилизацию глюкозы и/или мальтозы. Скринирование проводили методом перепечатывания (Lederberger & Lederberger, 1952) с помощью многоточечной иглы для посева, инокулируя 20 изолятов на комплект из 9 агаровых чашек различного состава, описанного выше.

5.3 Определение скорости роста

Рост измеряли, в тройном повторе, в среде SDL, SDG или SDM по повышению мутности при 578 нм. Между измерениями флаконы инкубировали на водяной бане при 39°С. Измерения продолжали до тех пор, пока мутность не достигала предела при удовлетворительном соотношении с биомассой. Наносили на график натуральные логарифмы оптической плотности (OD) в зависимости от времени инкубации. Наклон в экспоненциальной фазе роста, представляющий удельную скорость роста, рассчитывали методом линейной регрессии с помощью пакета программ для табличных вычислений.

После этого культуры, культивируемые на среде SDL при pH 5,7, инкубировали еще 24 часа, а затем отбирали 9 мл на хранение добавлением 1 мл 10% (мас./объем) NaOH для анализа образовавшихся конечных продуктов и утилизации изомеров лактата.

5.4 Физиологическое исследование роста изолятов из чашек

Описание ферментера. Запускали проточную систему культивирования с тремя ферментерами емкостью примерно по 250 мл каждый. Использовали один и тот же перистальтический насос для подачи среды с различной скоростью в три ферментера. Температуру культур поддерживали при 39°С. Через среду и ферментеры пропускали 100% CO₂ для поддержания анаэробных условий. Значение pH культур поддерживали при pH 5,5 добавлением 20% ортофосфорной кислоты по мере необходимости. Степень разбавления устанавливали на 70%, 80% и 90% от максимальной скорости роста. Из каждого ферментера в стационарном состоянии отбирали асептически образец в 80 мл. По этому образцу определяли сухую массу клеток и остаточную молочную кислоту в среде. Скорость накопления биомассы как произведение степени разбавления и биомассы в стационарном состоянии рассчитывали по действительным значениям степени разбавления и сухой массы. Коэффициент выхода биомассы, являющийся функцией концентрации биомассы в стационарном состоянии от количества утилизированного субстрата, рассчитывали по значениям остаточной молочной кислоты и сухой массы.

6. Опыты на овцах для оценки способности изолята CH4 к предотвращению накопления молочной кислоты в рубце

6.1 Методы

В первом опыте 12 кастрированных баранов с катетером в рубце (средний живой вес около 40 кг) разбивали по случайной схеме на опытную и контрольную группы, каждая из которых состояла из 6 животных. Всех животных кормили неограниченно грубыми кормами 21 день. На 21-й день они голодали 11 часов, после чего им давали по 1000 г кукурузного корма и в то же время вводили непосредственно в рубец по 300 г мальтозного сиропа. Через 1 час всю не потребленную животным кукурузу вводили непосредственно в рубец. Сразу после этого животным опытной группы вводили в рубец 1×10¹¹ к.о.е. CH4, тогда как животным контрольной группы вводили такое же количество бесклеточного фильтрата из препарата CH4, т.е. без CH4. Для определения концентрации молочной кислоты в рубце через каждые 2 часа отбирали пробы жидкости из рубца на протяжении 12 часов после введения дозы.

Во втором опыте исследовали другую группу из 12 кастрированных ягнят с катетером в рубце (средний живой вес 29 кг) без предварительного кормления концентратом. Они имели свободный доступ к измельченному сену из Eragrostis teff и белково-минеральной смеси. Ягнят разбивали по случайной схеме на две группы по 6 животных, то есть опытную и контрольную группы. В первый день эксперимента (день 1) все животные получали в неограниченном количестве следующий рацион: кукуруза, 888; меласса, 69; мочевина, 17; известняк, 11; дикальцийфосфат, 6; соль, 4; сульфат аммония, 4; минерально-витаминный премикс с монензином, 1 (г/кг с.в.). В первый день перехода на концентрат каждому животному опытной группы вводили в рубец дозу СН4 в 12:00, т.е. через 3 часа после кормления. Животным контрольной группы вводили такое же количество воды. Для определения концентрации молочной кислоты пробы из рубца отбирали в различное время накануне перехода на концентрат (день -1) и на 1-й, 2-й, 3-й и 7-й день после перехода на концентрат.

7. Оценка изолята СН4 на высокопродуктивных молочных коровах

7.1 Культивирование утилизирующих лактат организмов для опыта на животных

Ферментер Braun Biostat В с рабочим объемом в 10 л был переоборудован в хемостат с помощью дозирующего насоса Watson-Marlow 505S, снабженного приводом на 55 об/мин, для подачи стерильной среды из 50-ти литровых бочек из нержавеющей стали. Рабочий объем поддерживали на постоянном уровне путем непрерывной подачи избытка культуры из ферментера при превышении уровня в 10 л через погруженную трубку с помощью перистальтического насоса (Watson-Marlow 505S) в полипропиленовую 50-ти литровую бутыль, стоящую в холодильной камере. Производительность этого собирающего насоса составляла приблизительно 120% относительно подающего среду насоса. Избыточный объем, выводимый из ферментера, состоял из анаэробного газа, поступающего из свободного пространства над средой.

Для концентрирования культуры использовали тангенциальную систему фильтрации (Millipore Pellicon), снабженную фильтром Millipore HVMP на 0,45 мкм (15 кв. футов) и перистальтическим насосом Millipore Masterflex Easy-Load.

Для культивирования использовали среду CSL4. Растворы витаминов, восстановителей, минералов и микроэлементов стерилизовали фильтрованием перед добавлением в емкость со средой. После автоклавирования емкость заполняли анаэробным газом.

Производственный процесс был организован по скользящему графику. Были осуществлены два цикла продукции, каждый из которых давал достаточно клеток для введения группе животных на 1 день. Количество стадий концентрирования было ограничено одной, поскольку ежедневно получаемый продукт собирали в 50-литровую емкость. Коэффициент разбавления составлял 0,4 час^-1, а "простой" между партиями составлял 50 мин. Перед первым днем производства запускали резервный цикл на 45 литров, который также способствовал переходу культуры в хемостате в стационарное состояние.

7.2 Экспериментальные животные

Шестьдесят высокопродуктивных молочных коров разбивали на группы в соответствии с продукцией молока во время предыдущей лактации и весом тела, после чего внутри каждой группы по случайной схеме проводили один из следующих экспериментов: 1) контрольный рацион, содержащий 60% концентратов; 2) контрольный рацион, содержащий 60% концентратов +СН4; 3) контрольный рацион, содержащий 70% концентратов; 4) контрольный рацион, содержащий 70% концентратов +СН4. Коровам вводили дозу организма СН4 при отеле, через 10 дней и через 20 дней после отела.

Регистрировали следующие параметры:

1) суточное потребление сухих веществ;

2) суточную продукцию молока;

3) содержание жира, белка и лактозы в молоке еженедельно и

4) вес тела и общее состояние в баллах ежемесячно.

8. Статистический анализ

Данные анализировали при помощи дисперсионного анализа для полностью случайной разбивки на группы, используя программу Genstat 5. Данные по продукции молока при последней лактации использовали в качестве ковариантного контроля, а продукцию молока выражали по сравнению с этим контролем. Для определения значимых отличий при различных воздействиях сравнивали результаты следующих парных опытов:

- +CH4 или -CH4 (введение дозы или отсутствие дозы)

- Контрольный рацион, состоящий из 70% концентратов, против контрольного рациона, состоящего из 70% концентратов +CH4.

- Контрольный рацион, состоящий из 60% концентратов, против контрольного рациона, состоящего из 60% концентратов +CH4.

Различия считали значимыми при p<0,10, а значения p<0,15 принимали за тенденции, если не указано иначе.

9. Влияние добавления Megasphaera elsdenii на здоровье и показатели откорма животных

Гомогенную группу из 448 отлученных кастрированных бычков породы Bonsmara (исходный средний живой вес 215 кг) разбивали по случайной схеме на 8 опытных групп по плану факторного эксперимента 2×2×2 со следующими факторами: (1) добавление CH4 (да или нет); (2) добавление ионофора (да или нет) и (3) содержание грубых кормов (высокое или низкое). Использовали следующие рационы и режимы откорма.

Состав ингредиентов экспериментального рациона по окончании периода адаптации (с 14-го дня и до конца) Ингредиенты Включения (% в конечном корме) Высокое содержание грубых кормов Низкое содержание грубых кормов Сено Eragrostis 8,0 2,0 Кукурузная мука 27,0 30,0 Кукурузная сечка 32,0 35,0 Кормовая меласса 12,0 12,0 Пивная дробина 6,0 6,0 Пшеничные отруби 10,0 10,0 Хлопковый жмых 2,0 2,0 Мочевина 1,0 1,0 Известняк 1,5 1,5 Соль 0,5 0,5   Адаптационный режим питания после начала эксперимента, когда животным давали в неограниченном количестве грубые корма до перехода на конечный рацион откорма Дни Добавление сена Количество грубых кормов (%) в рационе     Высокое содержание Низкое содержание 1-2 Не ограниченно 18 12 3-4 нет 18 12 5-7 нет 14 8 8-10 нет 12 6 11-13 нет 10 4 14 и до конца нет 8 2   Состав питательных веществ заключительного рациона откорма (% в конечном корме) Питательные вещества Высокое содержание грубых кормов Низкое содержание грубых кормов Сухое вещество 89,6 89,8 Сырой белок 14,4 13,4 Крахмал 33,5 35,9 NDF-волокна (нейтрально-очищающие волокна) 26,9 23,9 ADF-волокна (кислотно-очищающие волокна) 9,5 8,7 Жиры 4,6 4,8

Животных содержали в небольших экспериментальных загонах для откорма. В каждом опыте было 7 загонов по 8 животных в каждом. Животных кормили один раз в день утром в неограниченном количестве. Все бычки проходили стандартную обработку при поступлении в загон и им давали только длинноволокнистый корм в течение нескольких дней до того, как им вводили CH4 (опыт), или такое же количество воды (контроль). При этом каждому экспериментальному животному одноразово вливали в ротовую полость 200 мл суспензии CH4 в среде.

Культуру СН4 получали, инокулируя в объем 17,5 л стерильной среды CSL6 (начальный pH 5,20) 1000 мл свежего инокулята CH4, который закачивали прямо из ферментера в бутыль и инкубировали в течение ночи при 39°С. После культивирования значение pH культуры составило 6,63 и оставалось на том же уровне через 48 часов. Подсчет клеток в культуре CH4 проводили после инкубации. Использовали перистальтический насос для подачи дозы в 200 мл в ротовую полость животного за 10 сек из бутыли на 20 л.

Среда CSL6 для культивирования СН4 в бутыли на 20 л Среда CSL6 (стерилизация 55 мин) на 17,5 л Лактат натрия 971,25 г Индигокармин 17,5 мл Раствор микроэлементов 8,75 мл Раствор минералов 5 87,5 мл Пептон 17,5 г Дрожжевой экстракт 17,5 г Кукурузный экстракт CSL 598,5 г Дистиллированная вода 10688,2 г 10N KOH (растворен в 5 л воды) 58,3 мл   Компоненты, стерилизуемые фильтрованием и добавляемые перед инокуляцией Раствор витаминов 35 мл L-цистеин 35 мл

По каждому загону определяли потребление корма (ежедневно/еженедельно), а по каждому животному - вес (еженедельно или раз в две недели). Данные использовались для подсчета коэффициента конверсии корма (на загон). Животных осматривали ежедневно, и если у какого-то животного проявлялись признаки ацидоза (понос, вздутие, депрессия), его выводили из загона и подвергали лечению, а затем сразу же возвращали в соответствующий загон.

Статистический анализ

Данные анализировали при помощи программы GenStat 5. Животных разбивали на группы по весу. Проверяли влияние СН4, ионофора и уровня грубых кормов в формате факторного эксперимента 2×2×2 методом дисперсионного анализа (ANOVA). Данные имели приемлемое нормальное распределение с гомогенной дисперсией по группам. Средние значения в группах сравнивали при помощи защищенного критерия Фишера, принимая наименьшее значимое отличие (LSD) на уровне 5% при условии, что F-критерий в соответствии с ANOVA был значимым на уровне 5%.

10. Идентификация изолятов филогенетическими методами на основе последовательности генов 16S pPHK

10.1 Изоляты бактерий и условия культивирования

Изоляты M.elsdenii СН4 и СН7, первоначально выделенные из молочных коров (Wiederhold, 1994), были предоставлены авторами. Типовой штамм M.elsdenii АТСС 25040 был получен из Американской Коллекции Типовых Культур. Штаммы выращивали на среде SDL, как описано ранее, и предположительно идентифицировали как Megasphaera elsdenii (Wiederhold, 1994).

10.2 Амплификация и секвенирование генов рибосомального 16S РНК

Геномную ДНК выделяли из бактериальных клеток, используя стандартные методы (Ausubel et al., 1988). Праймеры для амплификации генов 16S pPHK были отобраны из универсальных консервативных для всех эубактерий участков (табл.1). ПЦР проводили с использованием праймеров FD1 (охватывает положения 8-26) и R11 (положения 1384-1400). Все положения мишеней праймеров, использовавшихся для амплификации и секвенирования, приводятся по системе нумерации для E.coli (Brosius et al., 1978). Реакционная смесь для ПЦР содержала в 100 мкл приблизительно 200 нг ДНК, по 1 мкМ каждого праймера, по 200 мкМ каждого нуклеотида (дАТФ, дЦТФ, дГТФ и дТТФ), 50 мМ KCl, 10 мМ трис-HCl (pH 8,4), 2,5 мМ MgCl2 и 2,5 ед. полимеразы Taq (Boehringer Mannheim, Германия). Смесь покрывали вазелиновым маслом для предотвращения испарения. Температурный профиль состоял из 30 циклов: денатурация 1 мин при 94°С, отжиг 2 мин при 45°С и последующая элонгация 3 мин при 72°С в амплификаторе (Hybaid, UK). Заключительную элонгацию проводили 6 мин при 72°С. Однородность ампликонов анализировали методом электрофореза в агарозном геле (Sambrook et al., 1989). Продукт ПЦР вырезали из геля и очищали с помощью набора Wizard PCR Preps (Promega, USA) в соответствии с инструкцией производителя. Прямое секвенирование двухцепочечных ПЦР-ампликонов и последующее разделение продуктов реакции секвенирования в полиакриламидном геле в основном проводили по методике Dorsch and Stackebrandt (1992). Праймеры для секвенирования перечислены в табл.1.

Таблица 1 Праймеры, использовавшиеся для амплификации и секвенирования гена 16S pPHK. Последовательности праймеров были опубликованы ранее (Dorsch and Stackebrandt, 1992; Lane et al, 1985; Stackebrandt and Charfreitag, 1990; Hutson et al., 1993). Сочетание этих праймеров в целом охватывает 1419 нуклеотидов гена 16S pPHK. Праймер Положение мишени праймера^а Последовательность праймера (5'-3') Обратное направление (антисмысловое) R11 (ПЦР) 1384-1400 CGGTGTGTACAAGGCCC R1193 1174-1192 CGTCATCCCCGCCTTCCTC R1353 1336-1352 CGATTACTAGCGATTCC R961/R7 949-963 TCGAATTAAACCACA R5 786-802 CTACCAGGGTATCTAAT R361/R1 340-355 CTGCTGCCTCCCGTAGG Прямое направление (смысловое) FD1/F1 (ПЦР) 8-26 AGAGTTTGATCCTGGCTCA F1353 1336-1352 GGAATCGCTAGTAATCG F361 340-355 CCTACGGGAGGCAGCAG F961 949-963 TGTGGTTTAATTCGA ^а Все положения мишеней праймеров соответствуют системе нумерации для E.coli (Brosius et al., 1978)

10.3 Анализ данных

Полученные последовательности 16S pДНК подвергали автоматическому сопоставлению с последовательностями, полученными из Проекта по рибосомальной базе данных (RDP; Maidak et al., 1996), используя программу совмещения CLUSTALW (Genetics Computer Group, 1991). Последовательности в профиле урезали с тем, чтобы стандартизировать по размеру последовательности каждого организма, включенного в профиль сопоставления. Общее число положений нуклеотидов в последовательностях, включенных в профиль, равно 1388. В профиль сопоставления были включены опубликованные последовательности ряда организмов, встречающихся в рубце (табл.2). Сомнительные последовательности в профиле сопоставления совмещали вручную с помощью редактора сопоставления Genetics Data Enviroment (GDE) (Smith et al., 1992). Для проверки филогенетического родства использовали программу fastDNAml (Olsen et al., 1994), которая основана на алгоритме максимального правдоподобия (Felsenstein, 1981). При помощи программы Treetool (GDE) было построено филогенетическое древо. В качестве внешних групп при построении древа служили Escherichia coli и Acinetobacter calcoaceticus.

Таблица 2
Организмы, включенные в профиль сопоставления с помощью программы CLUSTALW. Все последовательности были получены из баз данных RDP и Genbank Lactobacillus ruminis АТСС 27780 Streptococcus bovis ATCC 33317 Fibrobacter succinogenes S85 АТСС 1916 Methanobrevibacter ruminantium ATCC 35063 Megasphaera elsdenii АТСС 17752 Methanobacterium formicicum DSM 1312 M.elsdenii АТСС 25940 Methanosarcina barkeri DSM 1538 M.elsdenii СН4 Methanomicrobium mobile ATCC 35094 M.elsdenii СН7 Prevotella ruminicola ATCC 19189 M.cerevisiae Wolinella succinogenes ATCC 33913 Synergistes jonesii Escherichia coli Clostridium acetobutylicum ATCC 824 Acinetobacter calcoaceticus ATCC 33604 Eubacterium cellulosolvens ATCC 43171 Quinella ovalis Eubacterium uniformis ATCC 35992 Selenomonas ruminantium GA192 Clostridium polysaccharolyticum ATCC 33142 Eubacterium limosum ATCC 8486

Результаты

Выделение в условиях ауксостата

Выделение утилизирующих лактат бактерий в условиях ауксостата

Выделение 1. Содержимое рубца коровы 8710, заполняющее сосуд для культивирования ферментера, немедленно подвергалось воздействию свежей стерильной селективной среды при запуске режима ауксостата при повышении pH. Вначале степень разбавления составляла около 0,53 час^-1 на протяжении первых двух часов при pH 5,30. В течение следующих двух часов степень разбавления увеличилась до 0,65 час^-1. Для того чтобы повысить специфичность выделения, pH понижали до 5,0, что привело к уменьшению степени разбавления до 0,37 час-1. Культивирование продолжали еще 24 часа, после чего в обогатительной культуре обнаруживались только два морфологических типа. Степень разбавления несколько снижалась по мере возрастания продолжительности культивирования после начального 24-часового периода и под конец выделения она составила только 0,33 час^-1.

Образец содержимого ферментера наносили штрихом на агаризованную среду в анаэробном боксе, и отдельные колонии, содержащие чистую культуру, переносили на косячки с агаром и хранили в жидком азоте; эта культура получила обозначение изолят CH1.

Выделение 2. При этом выделении из содержимого рубца коровы 8812 наблюдалась степень разбавления 0,25 час^-1 в первые 24 часа, а в последующие 24 часа степень разбавления составляла от 0,34 до 0,41 час^-1. После 48 часов культивирования было неясно, получена ли чистая культура, и культивирование продлили еще на 24 часа. Степень разбавления в этот период составила 0,41 час^-1 и была выделена чистая культура из ферментера в виде колонии из чашки Петри. Этот изолят обозначили как изолят CH2.

Выделение 3. Степень разбавления за время этого выделения снижалась с 0,28 до 0,21 час^-1 в течение 48 часов. Изолят, полученный из рубца коровы 8708, обозначили как изолят CH3.

Выделение 4. Поначалу степень разбавления составляла порядка 0,38 час^-1, но в течение 4 часов она снизилась до 0,276 час^-1, а под конец 48-часового периода степень разбавления составила 0,197 час^-1. Изолят, полученный при этом выделении из содержимого рубца коровы 8826, обозначили как CH4.

Выделение 5. В конце периода выделения преобладали спорообразующие микроорганизмы и эксперимент был прекращен.

Выделение 6. При этом выделении степень разбавления снижалась таким же образом, как и при других выделениях, и конечная степень разбавления составила только 0,116 час^-1. Изолят был получен из содержимого рубца откармливаемого скота и получил обозначение как CH6.

Выделение 7. Содержимое рубца, использованное при этом выделении, было получено из откармливаемого скота. Степень разбавления снижалась с 0,142 до 0,106 час^-1 за первые 7 часов выделения. Полученный изолят был обозначен как CH7.

Подбор сред для исследований в условиях хемостата

При выделении утилизирующих лактат культур наблюдалось постоянное снижение степени разбавления, что указывало на то, что состав среды не был оптимальным. За первые 24 часа при выделении 7 степень разбавления снизилась с 0,142 до 0,106 час^-1. Прямо в ферментер добавили одноразовую дозу в 5 мл стерильной жидкости из рубца и через 4 часа степень разбавления достигла пика в 0,408 час^-1. После этого степень разбавления медленно снизилась до 0,15 час^-1. Такой "импульсный" метод показал, что в среде недостает питательных веществ.

Другой "импульсный" эксперимент с добавлением 1 мл раствора витаминов привел к увеличению степени разбавления лишь до 0,28 час^-1. Однако внесение большей дозы витаминов привело к достижению пика степени разбавления в 0,497 час^-1, что было выше, чем при добавлении содержимого рубца. Утилизация лактата отражала аналогичные результаты, а именно: без добавления витаминов утилизация D- и L-изомеров лактата составила 22% и 86%, соответственно, а с добавлением витаминов - 68 и 91%, соответственно. Среда 1, представленная в Методах, отражает модифицированный вариант с повышенной концентрацией витаминов. Во время другого "импульсного" эксперимента было установлено, что дрожжевой экстракт увеличивает выход клеток изолятов.

Скорость роста Megasphaera elsdenii АТСС 25940 и изолятов из ауксостата в зависимости от pH

Скорость роста бактерий определяли с помощью pH-ауксостата при различных значениях pH в диапазоне от 4,5 до 6,5, используя модифицированную лактатную среду. Эти скорости роста сравнивали с величинами, полученными при культивировании в замкнутом объеме при определенных значениях pH, и использовали средние значения.

Типовой штамм Megasphaera elsdenii АТСС 25940 проявлял увеличение скорости роста при pH от 4,5 до 6,0, после чего следовало резкое снижение скорости роста при pH 6,5 (фиг.1). Максимальная скорость роста, достигнутая АТСС 25940, составила 0,66 час^-1, что соответствует скорости роста в 0,6 час^-1 в работе Therion et al. (1981).

Все изоляты превосходили АТСС 25940 по максимальной скорости роста, особенно при значениях pH 5,5 и ниже (фиг.1). Максимальная скорость роста у всех изолятов наблюдалась при pH 5,5, при этом скорости роста составили 0,66, 0,93, 0,938 и 0,864 час^-1 у изолятов СН7, СН6, СН4 и СН3, соответственно. Из всех изолятов СН4 оказался наиболее кислотостойким, достигая скорости роста в 0,389 час^-1 при pH 4,5, тогда как второй по кислотостойкости организм СН6 проявлял скорость роста только в 0,19 час^-1 при pH 4,5. Наблюдалось резкое снижение скорости роста при pH между 5,5 и 6,0 у трех изолятов, а именно СН6, СН4 и СН3. Изолят СН7 проявлял только небольшие отклонения в скорости роста при pH между 5,5 и 6,0, что напоминает поведение АТСС 25940 при pH между 5,5 и 6,5.

Скорости роста изолятов из ауксостата на глюкозе

Скорости роста трех изолятов определяли при pH 5,0, 5,5 и 6,0 в условиях подпитываемой культуры (фиг.2). Скорости роста у всех трех изолятов были значительно ниже на глюкозе, чем на лактате. Наиболее перспективный изолят на лактате, а именно СН4, достигал максимальной скорости роста только в 0,24 час^-1 на глюкозе при pH 5,5 по сравнению с 0,938 час^-1 на лактате. Изолят СН7 обладал самой высокой среди изолятов скоростью роста (0,33 час^-1) на глюкозе при pH 6,0.

Превращение лактата изолятом СН4

Изолят СН4 культивировали в условиях хемостата при трех степенях разбавления в 0,94, 0,83 и 0,75 час^-1 на лактатной среде. В стационарной фазе отбирали пробы и анализировали на содержание летучих жирных кислот (ЛЖК) и определяли утилизацию лактата. Также проводили культивирование в замкнутом объеме, отбирая пробы в стационарной фазе. Образцы стерильной среды также анализировали на содержание ЛЖК и лактата. С увеличением степени разбавления относительное образование жирных кислот изменялось, а именно, при низких степенях разбавления образовывалось больше бутирата и валерата и меньше пропионата и ацетата (табл.3). При наибольшей степени разбавления образовывались очень малые количества бутирата при полном отсутствии валерата и лишь немного больше ацетата и пропионата. Утилизация лактата, как и ожидалось, снижалась с возрастанием степени разбавления. При культивировании в условиях D=0,75 более 40% лактата превращалось в ЛЖК и, хотя утилизация лактата была интенсивной, большая часть доступной энергии пропадала. Когда СН4 культивировали в замкнутом объеме, он образовывал главным образом ацетат и пропионат. Концентрация образующихся ЛЖК при культивировании в замкнутом объеме была гораздо ниже, чем ожидалось, и единственным объяснением этому может быть то, что СН4 утилизирует ЛЖК при нехватке лактата.

Таблица 3
Летучие жирные кислоты, образованные изолятом СН4 из лактата при культивировании в хемостате при различных степенях разбавления и при культивировании в замкнутом объеме Степень разбавления
(час^-1) Летучие жирные кислоты (мМ) Утилизация лактата (%)   уксусная пропионовая n-масляная n-валериановая   0,75 7,221 5,779 11,347 6,383 92,66 0,83 10,048 12,293 0,423 0,012 53,54 0,94 8,529 10,517 0,271 0 39,65 Замкнутый объем 10,659 7,737 0,266 0 97,62

Выделение и скринирование методом рассева на чашках

Более 800 колоний из девяти образцов из рубцов четырех особей молочного скота и двух особей откармливаемого скота инокулировали в микропробирки с жидкой средой IRFL. Из них 610 изменяли окраску среды на пурпурную за 16 часов инкубации. Для дальнейших исследований были выбраны девятнадцать из проскринированных изолятов, поскольку они соответствовали требованиям.

Четыре из выбранных изолятов - AW09, AW10, AW11 и AW12 обладали способностью к росту при начальном pH 4,5. Все остальные пятнадцать изолятов росли при начальном pH 5,0, и проводилась дальнейшая селекция для отбора культур с подходящими свойствами, причем отбирались самые быстрорастущие при pH 5,0.

Все девятнадцать изолятов были устойчивы к ионофорам монензину и лазалоциду в концентрациях 10 ppm, утилизировали лактат в присутствии мальтозы и глюкозы и были способны расти как на глюкозе, так и на мальтозе. Все эти девятнадцать изолятов представляли собой грамотрицательные кокки (±1,8 мкм), встречающиеся парами или в виде цепочек.

Физиологическая характеристика изолятов

Все изоляты AW утилизировали как L-, так и D-изомер лактата, поскольку оба изомера были практически полностью утилизированы после инкубации в среде SDL в течение 24 часов. Результаты показывают, что изоляты составляют довольно однородную группу, поэтому для дальнейших исследований были выбраны только определенные изоляты. У пяти изолятов AW скорость роста на глюкозе при pH 5,8 варьировала от 0,38 до 1,05 час^-1, со средним значением 0,66 час^-1 (±0,298). При проверке изолятов AW на образование ЛЖК из DL-лактата оказалось, что они образуют уксусную, пропионовую, n-масляную и n-валериановую кислоты в следующем соотношении: 2:1,5:1:1,3. Некоторые изоляты AW образовывали следовые количества метилмасляной кислоты. Максимальная скорость накопления биомассы у девяти изолятов варьировала от 0,31 до 0,43 г (л×час)^-1. Самая высокая скорость накопления биомассы была у AW15, а за ним следовали СН4 и AW01 на уровне 0,39 г (л×час)^-1. Выход сухой массы клеток на 1 г утилизированной молочной кислоты варьировал от 0,1 до 0,17 у этих девяти изолятов.

Предположительная идентификация изолятов

Полученные изоляты были подвергнуты предположительной идентификации и те, которые соответствовали морфологическому типированию как штаммы Megasphaera elsdenii, использовались для дальнейшей характеристики.

Испытания на овцах для оценки способности изолята СН4 к предотвращению накопления молочной кислоты в рубце

Результаты первого испытания на овцах представлены в табл.4.

Таблица 4
Концентрация молочной кислоты в рубцовой жидкости овец, получавших грубые корма, при внезапном переходе на концентраты и при введении в рубец СН4 (опыт) или плацебо (контроль) в одно и то же время Время после введения СН4 (час) Концентрация молочной кислоты (г/л)   опыт с СН4 Контроль 0 <0,1 <0,1 2 0,3 1,4 6 0,8 3,6 8 0,5 5,2 10 0,4 6,1 12 0,2 5,9

Результаты второго испытания на овцах представлены в табл.5.

Таблица 5
Концентрация молочной кислоты в рубцовой жидкости овец, получавших грубые корма, при внезапном переходе на рацион из концентратов (неограниченно) и при введении в рубец СН4 (опыт) или плацебо (контроль) через 3 часа после первого получения концентратов День опыта Время суток Концентрация молочной кислоты в рубце (ммоль/л) 08:00 12:00 15:00 19:00 -1 СН4 1,4 0,7 0,6 0,7 контроль 1,5 0,9 0,5 0,7 1 СН4 0,7 0,5 2,1 2,4 контроль 0,5 0,2 1,5 1,8 2 СН4 2,4 1,0 1,5 1,2 контроль 5,0 13,6 15,2 17,4 3 СН4 1,6 1,0 0,7 1,0 контроль 7,8 4,5 3,5 2,5 7 СН4 1,8 1,6 1,0 1,2 контроль 2,0 1,5 2,0 1,5 14 СН4 1,5 1,5 1,2 1,0 контроль 1,8 2,0 1,2 2,0

В обоих испытаниях введение СН4 вызывало заметное и значимое (p<0,01 для обоих испытаний) уменьшение концентрации молочной кислоты в рубце по сравнению с контролем. В обоих испытаниях у контрольных животных после внезапного добавления легко сбраживаемого субстрата в рубец проявлялось ожидаемое резкое возрастание концентрации молочной кислоты в рубце. В отличие от этого, уровни молочной кислоты в рубцах у получавших СН4 животных оставались более или менее на том же уровне, что и перед добавлением субстрата. Это четко свидетельствует о том, что большая часть образующейся молочной кислоты утилизируется СН4.

Оценка изолята СН4 на высокопродуктивных молочных коровах

Наиболее важные данные по продуктивности представлены в табл.6 и 7. Данные анализировали по отдельности для всех коров (15/опыт) и высокопродуктивных коров (10/опыт), соответственно.

Таблица 6
Влияние изолята СН4 на продуктивность дойных коров в течение 80 дней после отела (все коровы) Параметры Опыт¹ Значение p для попарного сравнения 1 2 3 4 +СН4 и -СН4 1 и 2 3 и 4 Число коров в опыте 15 15 15 15 - - - Потребление сухого вещества (кг/сутки) 24,6 24,1 23,1 22,2 0,28 0,59 0,32 Молоко (кг/сутки) 36,4 34,0 33,8 32,2 0,10 0,16 0,34 Жир (%) 3,27 3,29 3,57 3,23 0,17 0,85 0,03 Белок(%) 3,10 3,10 3,14 3,07 0,43 0,93 0,23 Вес тела 662 608 618 612 0,02 0,004 0,73 Состояние в баллах 2,80 2,48 2,45 2,28 0,06 0,08 0,36

Опыт 1: контрольный рацион, содержащий 70% концентратов +СН4

Опыт 2: контрольный рацион, содержащий 70% концентратов -СН4

Опыт 3: контрольный рацион, содержащий 60% концентратов +СН4

Опыт 4: контрольный рацион, содержащий 60% концентратов -СН4

Таблица 7
Влияние изолята СН4 на продуктивность дойных коров в течение 80 дней после отела (высокопродуктивные животные) Параметры Опыт¹ Значение p для попарного сравнения 1 2 3 4 +СН4 и -СН4 1 и 2 3 и 4 Число коров в опыте 10 10 10 10 - - - Потребление сухого вещества (кг/сутки) 24,6 25,4 24,3 22,6 0,44 0,43 0,06 Молоко (кг/сутки) 39,3 35,9 35,2 34,8 0,13 0,06 0,82 Жир (%) 3,23 3,24 3,56 3,21 0,20 0,91 0,06 Белок(%) 3,10 3,10 3,15 3,02 0,28 0,93 0,11 Вес тела 644 597 623 625 0,11 0,02 0,90 Состояние в баллах 2,71 2,26 2,34 2,44 0,20 0,02 0,61

Влияние добавления Megasphaera elsdenii на здоровье животных и эффективность откорма

Количество живых бактерий СН4, вводимых одному животному, составляло 2×10¹¹ колониеобразующих единиц на дозу на одно животное во всех опытах по откорму. Наиболее важные результаты представлены в табл.8-11. Период с третьей по пятую неделю при откорме обычно считается самым критическим в смысле пищевой адаптации. В течение первой и второй недели рацион все еще содержит большую долю грубых кормов, которая постепенно понижается. Потребление концентратов начинается на сравнительно низком уровне и постепенно возрастает. Только начиная с третьей недели рацион содержит самый низкий уровень грубых кормов (и самый высокий уровень концентратов) и потребление корма быстро возрастает. К началу шестой недели обычно считается, что животные адаптировались к рациону. Недели с третьей по пятую действительно являются критическим периодом адаптации животных к высокому содержанию концентратов.

Таблица 8
Среднесуточное потребление корма (кг съеденного корма на одно животное на сутки) при введении СН4 против контроля (без добавления СН4) в различные периоды откорма Период откорма Условия опыта Значение p SE Опыт (с СН4) Контроль (без СН4) 1-2 недели 7,30 7,15 0,35 0,109 3-5 недели 10,18 10,02 0,30 0,103 1-13 недели 9,64 9,50 0,29 0,092

Общее потребление корма было немного (но не значительно) выше у получавших СН4 животных, чем у контрольных. В течение 3-5 недели кастрированные бычки, не получавшие ионофор, но получавшие СН4, потребляли значительно (p<0,05) больше корма, чем контрольные (10,56 против 10,12), тогда как у животных, получавших ионофор, не наблюдалось эффекта от СН4. Также за этот период бычки, получавшие рацион с низким содержанием грубых кормов и получавшие СН4, проявляли тенденцию (p<0,15) к большему потреблению корма, чем контрольные (10,14 против 9,80), тогда как у животных, получавших рацион с высоким содержанием грубых кормов, не наблюдалось эффекта от СН4.

Таблица 9
Среднесуточный привес (кг на одно животное в сутки) при введении СН4 против контроля (без добавления СН4) в различные периоды откорма Период откорма Условия опыта Значение p SE Опыт (с СН4) Контроль (без СН4) 1-2 недели 1,76 1,81 0,51 0,053 3-5 недели 2,09 1,97 0,04 0,040 1-13 недели 2,19 2,20 0,67 0,019

В целом среднесуточный привес (ССП) в критический период 3-5 недели был значительно (р=0,04) выше у животных, получавших СН4, чем в контрольных опытах. В течение 1-2 недели у всех животных, не получавших СН4, рацион с низким содержанием грубых кормов давал значительно (р<0,05) меньший ССП, чем рацион с высоким содержанием грубых кормов (1,61 против 2,02). Однако у животных, получавших СН4, ССП снижался незначительно на рационе с низким содержанием грубых кормов по сравнению с рационом с высоким содержанием (1,70 против 1,83). В течение 3-5 недели у животных, не получавших ионофор, но получавших СН4, ССП был значительно (р<0,05) выше, чем у контрольных животных (2,15 против 1,96).

Таблица 10
Коэффициент конверсии корма (кг корма на кг привеса) при введении СН4 против контроля (без добавления СН4) в различные периоды откорма Период откорма Условия опыта Значение p SE Опыт (с СН4) Контроль (без СН4) 1-2 недели 4,25 4,12 0,43 0,111 3-5 недели 4,89 5,14 0,04 0,081 1-13 недели 5,06 5,02 0,35 0,027

В целом животные, получавшие СН4, проявляли значительное (р=0,04) улучшение коэффициента конверсии корма (ККК) примерно на 5% по сравнению с контрольными животными в течение 3-5 недели. В течение 1-2 недели у всех животных, не получавших СН4, при рационе с низким содержанием грубых кормов ККК был значительно (р=0,06) выше (менее желательно), чем при рационе с высоким содержанием (4,42 против 3,83). Однако у животных, получавших СН4, ККК не был значительно выше при рационе с низким содержанием грубых кормов по сравнению с высоким содержанием (4,24 против 4,25).

Таблица 11
Число случаев (включая многократные выведения одного и того же животного) и число животных (многократные выведения одного и того же животного принимали за одно), когда животных выводили из загона и лечили от ацидоза и вздутия     Условия опыта ВСЕГО Опыт (с СН4) Контроль (без СН4) Общее число выведений (случаев) Низкое содерж. грубых кормов 6 21 27 Высокое содерж. грубых кормов 6 4 10 ВСЕГО: 12 25 37 Общее число выведенных животных Низкое содерж. грубых кормов 4 15 19 Высокое содерж. грубых кормов 5 2 7 ВСЕГО: 9 17 26

Только половина от общего числа животных, получавших СН4, страдала симптомами ацидоза (один или несколько раз) по сравнению с контролем. Такая же картина наблюдалась при учете общего числа случаев ацидоза. Также ясно, что ацидоз гораздо чаще возникал при рационе с низким содержанием грубых кормов, а введение СН4 снимало эту проблему при рационе с низким содержанием грубых кормов.

Идентификация изолятов филогенетическими методами в соответствии с последовательностями генов 16S pHK

Результаты сравнительного секвенирования показали, что изоляты авторов настоящего изобретения, являющиеся представителями еще большей фенотипически гомогенной группы, идентичны на 97-99% (табл.12). В таблице 13 приведены положения характерных нуклеотидов, подходящих для того, чтобы отличить друг от друга два новых изолята Megasphaera elsdenii и штаммы АТСС. 22% отличий по нуклеотидам у этих четырех штаммов обусловлены вставками и делециями. Основные различия в нуклеотидных последовательностях у этих штаммов наблюдаются в положениях нуклеотидов 529-536 и 1105-1120 (табл.13). Большое сходство между последовательностями различных штаммов M.elsdenii согласуется также с общностью их фенотипических характеристик (Wiederhold, 1994), что далее отражается в их тесном филогенетическом родстве. У штаммов вида M.elsdenii сходство последовательности с M.cerevisiae составляет только 91-92%, и эти два вида образуют различные кластеры на филогенетическом древе. Кластер M.elsdenii разветвляется на две монофилетические группы, происходящие из одной предковой таксономической единицы - общего предка. Общий предок, из которого эволюционировали M.cerevisiae, однако, появился раньше, чем тот предок, из которого эволюционировал кластер M.elsdenii. Небольшая длина ветвей между штаммами M.elsdenii и соответствующим предком также указывает на то, что они возникли позже, чем более сильно разветвленный кластер M.cerevisiae.

Таблица 12
Матрица подобия последовательностей 16S pДНК M.elsdenii и M.cerevisiae. Оценка подобия последовательностей основана на сравнении всех 1388 однозначно совмещенных положений нуклеотидов. % G+С относится только к соответствующим совмещенным последовательностям 16S рДНК   АТСС 17752 АТСС 25940 СН7 СН4 %G+C M.cerevisiae 92,0 92,0 91,5 91,5 54,3 АТСС 25940 99,0   98,5 98,1 54,4 СН4 98,2 98,1 99,0   54,9 СН7 97,7       54,8 АТСС 17752         53,1   Таблица 13 Характерные положения, определяющие различные изоляты и штаммы M.elsdenii   Нуклеотиды Положение^a АТСС 25940^b СН4 СН7 АТСС 17752 87 G G А G 105 С Т С Т 170 Т С С Т 221 Т C С Т 241 G А А G 283 А G G А 418 А * * * 529-530 CG * * CG 533-536 CG** CGAC CGAC GC** 539 Т С С Т 550-552 ТАС CGT CGT ТАТ 556 G А А G 711 G G G С 718 * * * G 850 А А G А 1084 А G А А 1105-1108 TGGA AGGG AGGG TGGA 1117-1120 ТССА СССТ СССТ ТССА 1290 А * А * 1297-1300 AAGT CGGC AAGT CGGC 1396 А С А А 1425 А А G А 1437 G А G G 1492 Т С С Т а Система нумерации по E.coli (Brosius et al., 1978). b Типовой штамм. Звездочкой показано, куда при совмещении был введен разрыв вследствие появления делеции или вставки нуклеотидов в каком-либо положении последовательности соответствующих изолятов и штаммов.

Метод наибольшего правдоподобия, включающий нахождение древа, дающего наибольшую вероятность соответствия полученным данным по секвенированию (Felsenstein, 1981), использовали для выведения филогенетического древа из последовательностей, включенных в профиль совмещения (фиг.3). Этот метод имеет преимущество перед традиционными методами достаточности, которые могут привести к получению ошибочных древ, если различные потомки будут возникать с неравными скоростями, в том, что он учитывает возможность эволюции с различной скоростью в различных линиях (Felsenstein, 1981). Поскольку на топологию древа также влияет количество используемых организмов и выбор заведомо неродственных организмов для сравнения (Stackebrandt and Ludwig, 1994; Stackebrandt and Rainey, 1995), в профиль совмещения был включен целый ряд явно родственных и явно неродственных организмов, встречающихся в рубце. Впоследствии их использовали для создания древа. Хотя филогенетическое древо было выведено только на основании неполных (92%) последовательностей генов 16S pPHK, что могло бы уменьшить разрешение между близкородственными организмами (Utaker et al., 1995; Li and Graur, 1991), было показано, что общая топология древ, полученных как из полных, так из неполных последовательностей, в целом совпадает друг с другом (Van Camp et al., 1993; Vandamme et al., 1996).

Vandamme et al. (1996) предположили, что различные изоляты можно рассматривать как представителей одного и того же вида, если их последовательности pPHK гомологичны более чем на 97%, они обладают фенотипическим сходством и проявляют значительную степень гибридизации ДНК:ДНК. Несмотря на то, что соотношение между сходством ДНК и гомологией 16S pPHK между разными организмами далеко не линейно, Fox et al. (1992) предположили, что действительная идентичность последовательностей 16S pPHK должна означать, что два организма являются представителями одного и того же вида, поскольку это почти всегда подтверждается гибридизацией ДНК:ДНК. Хотя одни только данные последовательностей 16S pPHK не могут быть достаточными во всех случаях определения видов, они чрезвычайно полезны для определения того, к какому виду предположительно принадлежит штамм, если только соответствующий вид представлен в базе данных последовательностей 16S pPHK. Штаммы с почти идентичными последовательностями 16S pPHK следует относить к одному и тому же "супервиду по pPHK" или "комплексу видов по pPHK". Следовательно, описываемые изоляты СН4 и СН7, фенотипически предположительно идентифицированные как штаммы М. elsdenii, следует отнести к одному комплексу видов по pPHK, который будет включать эталонные штаммы этого вида - типовой штамм АТСС 25940 и штамм АТСС 17752. Поскольку филогенетические взаимоотношения соответствующих изолятов также совпадают с их фенотипическими характеристиками, эти изоляты можно рассматривать как штаммы вида Megasphaera elsdenii. То, что последовательности 16S pДНК M.cerevisiae и M.elsdenii гомологичны только на 92%, вместе с генетическими и фенотипическими данными, подтверждает деление рода на два хорошо отделенных вида.

Среди бактерий рубца, включенных в данное исследование, наиболее близкими к кластеру Megasphaera, по-видимому, являются Selenomonas ruminantium и Quinella ovalis. Очевидное филогенетическое родство между Megasphaera elsdenii и Selenomonas ruminantium находится в соответствии с фенотипическими и генетическими свойствами, общими для этих двух организмов, такими как близкое содержание G+C в ДНК (53-54%), анаэробность, хемоорганотрофический метаболизм и утилизация одних и тех же субстратов (Stackebrandt et al., 1985; Stewart and Bryant, 1988; Haikara, 1992). Работа Stackebrandt et al. (1985), применивших метод олигонуклеотидной каталогизации для выявления филогенетических взаимоотношений между видами, подтверждает это филогенетическое родство. С другой стороны, Selenomonas ruminantium также близкородственна сравнительно неизвестному организму Quinella ovalis, который размножается в рубце, когда животное получает корм, богатый сахарами. Эти организмы, хотя они еще не введены в культуру, обладают некоторыми физиологическими свойствами, общими с таковыми у крупных селеномонад, обнаруженных у овец (Stewart and Bryant, 1988). Как и ожидалось, наиболее отдаленными родственниками Megasphaera, встречающимися в рубце, являются бактерии, входящие в кластер архебактерий-метаногенов, представители которого, как полагают, появились около 600-800 млн. лет тому назад (van Soest, 1994; Woese, 1987). Скорость эволюции у этих организмов также медленнее, чем у Bacteria, и примитивность этой группы четко отражается в сильно разветвленном кластере метаногенов.

Недавнее расхождение различных штаммов M.elsdenii, возможно, объясняется совершенствованием их фенотипа с целью адаптации к очень селективным условиям в рубце. Согласно Woese (1987), эволюция фенотипа любого организма является процессом, при котором появляются новые или более эффективные признаки для выживания в определенной нише. Совершенствование должно приводить к появлению организмов с универсальным метаболизмом, как в случае Megasphaera. С другой стороны, медленнее эволюционирующие метаногены по сравнению с ними метаболически однообразны.

Данное исследование показывает пригодность секвенирования 16S pДНК для различения близкородственных штаммов вида M.elsdenii. Кроме того, оно обеспечивает филогенетические рамки для идентификации свежевыделенных штаммов, уже охарактеризованных фенотипически. Эти рамки имеют особенную ценность, когда они служат основой для разработки видо- и штаммоспецифичных зондов, предназначенных для исследований по экологии рубца.

Выводы

Выделение

Введение бромкрезола пурпурного в среду IRFL для облегчения определения бактерий, утилизирующих лактат, оказалось успешным в случае быстрорастущих бактерий, утилизирующих лактат, которые представляли основной интерес в данном исследовании. На ранних стадиях инкубации они образуют пурпурные зоны вокруг колоний, которые четко контрастируют с желтоватым фоном агаризованной среды. Однако при продолжительной инкубации градиент pH вокруг колоний диссипирует вследствие диффузии ионов и весь фон становится пурпурным. Тогда становится трудно отличить медленно растущие колонии, утилизирующие лактат, от тех организмов, которые растут на других источниках углерода, попадающих в жидкость рубца.

M.elsdenii не является доминирующим видом, утилизирующим лактат, у животных на рационе с высоким содержанием концентратов (Mackie et al., 1978; Mackie & Gilchrist, 1979; Mackie et al, 1984; van Gylswyk, 1990), но существует множество причин, почему он может преобладать при проведении процедур отбора и скринирования.

Некоторые из подвергавшихся скринированию колоний состояли из селеномонад и других морфологических типов. Большая часть этих колоний не была отобрана, поскольку не было положительного признака того, что они могут утилизировать лактат в присутствии растворимых сахаров. Russel & Baldwin (1978) показали, что в мультисубстратной среде M.elsdenii В159 одновременно использует глюкозу, мальтозу и лактат, но не сахарозу. Marounek et al. (1989) показали, что четыре штамма M.elsdenii утилизировали лактат быстрее, чем глюкозу в средах с обоими источниками углерода.

Некоторые другие лаборатории, исследовавшие возможность заселения жвачных животных, потребляющих корма с высоким содержанием концентратов, утилизирующими лактат организмами для предотвращения накопления лактата, также работали со штаммами М. elsdenii (Das, 1979; Leedle et al., 1991; Robinson et al., 1992; Kung & Hession, 1995; Wiryawan & Brooker, 1995). Но было невозможно сравнить скорости роста изолятов AW и СН со штаммами из литературы, чтобы определить, имеют ли они более высокие скорости роста и являются более кислотостойкими, поскольку таких данных нет в литературе. Однако изоляты AW и СН можно сравнить с типовым штаммом M.elsdenii АТСС 25940.

У изолятов AW область значений pH, при которых определяли рост, не была достаточной для определения диапазона pH для выделенных штаммов или оптимального pH для роста. Однако можно полагать, что оптимум будет свыше pH 5,7 и самое низкое значение pH находится между pH 4,5 и pH 4,9 для всех, кроме четырех изолятов, поскольку не было роста на чашках со средой IRFL при pH 4,5. Это соответствует данным работы, проведенной на типовом штамме М. elsdenii АТСС 25940. Диапазон pH для типового штамма M.elsdenii АТСС 25940 составляет от 4,6 до 7,8 при оптимуме для роста при pH 6,05 (Therion et al., 1982).

У изолятов СН оптимум pH для роста находится между pH 5 и 6. В области исследованных значений pH самые высокие скорости роста были при pH 5,5. Обе группы изолятов на среде SDL обладали большей скоростью роста, чем типовой штамм. Скорости роста штамма M.elsdenii АТСС 25940 в среде SDL сравнимы с теми, что были получены предшествующими исследователями на лактатной среде (Therion et al., 1982).

Скорости роста изолятов на лактате были выше, чем на глюкозе и мальтозе. Это согласуется с предыдущим исследованием на M.elsdenii АТСС 25940, в котором оказалось, что скорость роста на лактатной среде при pH между 5,0 и 6,5 была выше, чем на глюкозной среде (Therion et al., 1982). Вне этого интервала pH скорость роста на глюкозе была выше. Изучение субстратного предпочтения бактерий рубца показало, что рост M.elsdenii (В 159 на лактате был медленнее, чем на глюкозе и мальтозе, хотя pH среды в этом исследовании был выше 6,5 (между 6,75 и 6,9) (Russel & Baldwin, 1978).

Состав конечных продуктов сбраживания на лактатной среде был установлен у четырех штаммов М. elsdenii, включая типовой штамм LC1 или АТСС 25940 (Marounek et al., 1989). Эти результаты показали вариабильность соотношения образовавшихся жирных кислот в зависимости от штамма. Три штамма образовывали мало валериановой кислоты либо вовсе ее не образовывали, тогда как 22 мол.% конечных продуктов у M.elsdenii L8 составляла валериановая кислота (Marounek et al., 1989). Девять изолятов AW, протестированных в настоящем исследовании, не проявляли такого разброса от штамма к штамму по продукции валериановой кислоты, как это было у штаммов, проверенных Marounek et al. (1989), но они были близки к M.elsdenii L8, который был выделен из рубца теленка, получавшего молочный рацион. Однако СН4 вырабатывал такие же конечные продукты сбраживания, как и типовой штамм.

С точки зрения максимальной скорости накопления биомассы на среде SDL штамм AW15 был бы наилучшим для получения большого количества клеток для опытов на животных, а штаммы СН4 и AW01 следуют сразу после него. Время для наработки 100 г сухой массы клеток на среде SDL в хемостате с рабочим объемом в 5 л будет составлять 1,9 дней у AW15 и 2,1 дня у СН4 и AW01.

Скорости роста отобранных изолятов на лактате выше по сравнению с типовым штаммом M.elsdenii. Выделенные штаммы кислотоустойчивы и могут расти при значениях pH ниже 5,0. Они устойчивы к ионофорам, обычно добавляемым при откорме, и могут утилизировать оба изомера молочной кислоты даже в присутствии глюкозы и мальтозы. Конечным продуктом сбраживания лактата являются летучие жирные кислоты (ЛЖК), которые является важным источником энергии у жвачных животных. Образование пропионата особенно важно при промышленном откорме, поскольку пропионат является основным источником глюкозы для тканей жвачных животных. Таким образом, изоляты обладают свойствами, необходимыми для эффективной борьбы с лактоацидозом у жвачных.

Выращивание утилизирующих лактат организмов было успешным при применении среды, не содержащей жидкости из рубца. Единственным изменением исходной среды было повышение содержания витаминов и добавление дрожжевого экстракта в среду. Бактерии отлично выживали на этой среде при 4°С вплоть до 20 дней при использовании их в качестве рабочей культуры.

Метод с применением pH-ауксостата для обогащения утилизирующих лактат бактерий рубца с заданным сочетанием биохимических/физиологических свойств, которые делают эти бактерии потенциально более пригодными для предупреждения и борьбы с лактоацидозом при откорме животных, оказался очень успешным. В большинстве случаев в ферментере устанавливалась быстро растущая морфологически гомогенная популяция через два дня после запуска цикла. Последующие проверки культур, полученных из содержимого ферментера путем посева на чашки, подтвердили, что эти культуры обладают требуемым набором характеристик.

Предположительная идентификация изолятов из обогащенных культур показала, что все они, кроме одного, принадлежат к виду Megasphaera elsdenii.

Таблица 14
Сравнение метода выделения с применением pH-ауксостата и стандартного метода рассева и скринирования на чашках Параметр Традиционный метод на чашках Ауксостат Продолжительность (дни) 90 9 Время (ч), потраченное человеком 180 7 Образец: количество бактерий (к.о.е.) 12×10¹⁰ 14×10¹² Максимальная удельная скорость роста (ч^-1) 0,91 0,90 Выход биомассы (г/л) 0,60 0,59 Скорость накопления биомассы г (л×ч)^-1 0,39 0,39

Поскольку выделенные штаммы проявили себя лучше, чем АТСС 25940 при pH ниже 6,0, то они больше подойдут для значений pH, встречающихся в рубце откармливаемых животных, которые обычно меньше pH 6,0. Более того, изолят СН4 оказался наиболее подходящим для экспериментов на откармливаемых животных.

Культивирование утилизирующих лактат изолятов на глюкозе оказалось неприемлемым вследствие низкой скорости роста по сравнению со скоростью роста на лактате.

Тридцать коров, которым вводили изолят СН4, давали значительно больше молока (р=0,10), имели в среднем больший вес тела (p=0,02) и общее состояние организма (р=0,06). Жирность молока у коров, получавших рацион с 60% концентратов +СН4, также значительно повышалась (3,57%) против 3,23%).

Испытания на молочных животных

Потребление сухого вещества не изменялось, но продукция молока значительно возрастала на 3,4 кг/день с 35,9 кг/день до 39,3 кг/день (Р=0,06), когда коровам давали корм с 70% концентратов и вводили изолят СН4. Продукция молока имела тенденцию к возрастанию (р=0,13), если сравнивать всех коров, получавших СН4, с коровами, не получавшими его. Вес тела и показатели состояния организма повышались (р=0,02), когда высокопродуктивным коровам, получавшим корм с высоким содержанием концентратов, вводили изолят СН4. Введение СН4 коровам, получавшим корм с 60% концентратов, вело к значительному повышению жирности молока (р=0,06) с тенденцией к повышению содержания молочного белка (р=0,11). Компоненты молока играют важную роль в действующих схемах оплаты за молоко.

Введение коровам изолята СН4 значительно повышало выработку молока и положительно влияло на состав молока, вес тела и состояние организма. Потребление сухого вещества не изменялось; таким образом, результаты свидетельствуют, что введение коровам организма СН4 создает более благоприятную среду в рубце, что ведет к улучшению утилизации питательных веществ.

Эксперименты на откармливаемых животных

Значительное улучшение среднесуточного привеса (ССП) и коэффициента конверсии корма (ККК) в критический период откорма (3-5 недели), а также общее снижение расстройств пищеварения у получавших СН4 животных по сравнению с контрольными животными показало, что введение СН4 откармливаемым животным может давать следующие эффекты:

- оно способствует адаптации при переходе от грубых кормов на концентраты, как было в этих экспериментах. СН4 также смягчает ухудшение эффективности рациона с низким содержанием грубых кормов по сравнению с рационом с высоким содержанием грубых кормов на ранних стадиях адаптации;

- данный способ применения СН4 эффективен тем, что позволяет его экспрессию в соответствии с назначением;

- применение СН4 эффективно предупреждает ацидоз, о чем прямо свидетельствует снижение числа наблюдавшихся случаев ацидоза и косвенно - улучшение состояния в критической фазе откорма, когда вероятнее всего возникновение ацидоза. Все это наблюдалось при тех рационах и режимах кормления, которые дают особенно высокий риск ацидоза (особенно на ранних стадиях откорма), и было более выражено, когда не применялись инофоры;

- СН4 может применяться в качестве ветеринарного средства, способствующего предупреждению и/или лечению ацидоза, о чем свидетельствует резкое падение случаев ацидоза при применении СН4 по сравнению с контролем;

- СН4 может применяться для улучшения эффективности откорма, включая скорость роста (тем самым уменьшая время, необходимое для откорма) и эффективность конверсии корма;

- СН4 может применяться для того, чтобы можно было проводить откорм на рационе с высоким содержанием концентратов, т.е. использовать меньшее количество грубых кормов, и для увеличения скорости перехода от рациона с высоким содержанием грубых кормов на рационы с высоким содержанием концентратов, т.е. опять же меньше использовать грубые корма. Это дополнительно подтверждается наблюдением на ранних стадиях откорма, когда отрицательный эффект низкого содержания грубых кормов по сравнению с высоким содержанием значительно смягчался при введении СН4.

Авторы настоящего изобретения, также нашли, что по сравнению с известными штаммами M.elsdenii штамм M.elsdenii СН4:

- высокоактивен и адаптирован к размножению в рубце животных на рационе с высоким содержанием концентратов;

- способен к размножению при относительно низких значениях pH ниже 5,0 и даже при pH 4,5, что определяется как острый ацидоз;

- устойчив к антибиотикам-ионофорам, обычно добавляемым в рацион откорма;

- способен к преимущественному использованию лактата в качестве источника углерода, даже в присутствии растворимых углеводов, таких как глюкоза и мальтоза.

Далее, преимущества этого штамма состоят в том, что:

- он имеет сравнительно высокую скорость роста, т.е. более 0,938 час^-1;

- обладает способностью расти на восстановительных сахарах так же, как и на лактате;

- имеет относительно высокую скорость накопления биомассы, т.е. более 0,39 г(л×час)^-1;

- устойчив к ионофорам;

- образует преимущественно ацетат, а не пропионат и бутират; и

- имеет уникальную последовательность 16S pРНК и поэтому является новым штаммом.

Авторы настоящего изобретения к тому же обнаружили, что животные, которым вводили мальтозу непосредственно в рубец, или переведенные внезапно с грубых кормов на высокое содержание концентратов, не проявляют измеримого накопления лактата в рубце при введении СН4.

Более того, высокопродуктивные молочные коровы при введении СН4 дают на 2,4-3,2 литра молока больше, чем контрольные животные, которым не вводили СН4. Показатели состояния организма, так же как и вес тела у коров, которым вводили СН4, были статистически значимо выше, чем у контрольных животных.

Следует иметь в виду, что в отношении микроорганизма по изобретению и его применения возможны изменения в деталях, не выходящие за рамки прилагаемой формулы изобретения.

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве. Новый штамм Megasphaera elsdenii характеризуется способностью к утилизации лактата со степенью от 40% до 90% даже в присутствии сахаров. Штамм с указанной способностью получают способом, предусматривающим культивирование образца жидкости рубца. Новый штамм Megasphaera elsdenii используют в способе лечения и профилактики лактоацидоза у жвачных животных, в составе ветеринарного средства для лечения и профилактики указанного заболевания, в способе повышения молочной продуктивности и в способе повышения эффективности откорма жвачных животных, в способе повышения скорости роста и сокращения времени откорма жвачных животных, в способе снижения заболеваемости, обусловленной нарушениями пищеварения, и смертности среди жвачных животных от лактоацидоза, а также в способе улучшения эффективности конверсии рациона жвачного животного на основе концентрированных кормов при переводе жвачного животного на указанный рацион. Использование изобретения позволяет проводить широкомасштабное лечение и профилактику лактоацидоза. 12 н. и 5 з.п. ф-лы, 3 ил., 18 табл.

1. Штамм M.elsdenii, депонированный в NCIMB, Aberdeen, Scotland, UK, под номером NCIMB 41125, характеризующийся способностью к утилизации лактата со степенью от 40 до 90% даже в присутствии сахаров, устойчивостью к ионофорам, высокой скоростью роста, способностью к преимущественной продукции ацетата и способностью к пролиферации при pH менее 5,0.

2. Композиция для облегчения перевода жвачных животных с рациона на основе грубых кормов на высокоэнергетический рацион на основе концентрированных кормов, состоящая в основном из штамма по п.1.

3. Способ облегчения перевода жвачных животных с рациона на основе грубых кормов на высокоэнергетический рацион на основе концентрированных кормов, включающий введение в рубец указанных жвачных животных эффективного количества штамма по п.1.

4. Кормовая добавка для жвачных животных, предназначенная для облегчения перевода жвачных животных с рациона на основе грубых кормов на высокоэнергетический рацион на основе концентрированных кормов, содержащая инокулят, состоящий из эффективного количества штамма по п.1, и носитель.

5. Кормовая добавка по п.4, в которой носителем служит стерильная анаэробная питательная среда, и в которой инокулят и питательная среда размещаются соответственно в отдельных стерильных анаэробных камерах одного и того же анаэробного контейнера, при этом указанные камеры анаэробно соединены одна с другой для инокуляции питательной среды инокулятом в анаэробных условиях.

6. Способ лечения и профилактики лактоацидоза жвачных животных и одного или более связанного с ним состояний, включающих воспаление рубца, спровоцированное лактоацидозом воспаление копыта, спровоцированные лактоацидозом абсцессы в рубце как следствия чрезмерного скопления газов в рубце и печени, включающий анаэробное введение в рубец жвачного животного эффективного количества штамма по п.1.

7. Ветеринарное средство для лечения и профилактики лактоацидоза у жвачных животных и одного или более связанных с ним состояний, включающих воспаление рубца, спровоцированное лактоацидозом воспаление копыта, спровоцированные лактоацидозом абсцессы в рубце как следствия чрезмерного скопления газов в рубце и печени, содержащее эффективное количество штамма по п.1.

8. Способ повышения молочной продуктивности жвачных животных, включающий введение в рубец указанных жвачных животных эффективного количества штамма по п.1.

9. Способ по п.8, в котором штамм по п.1 вводят в анаэробных условиях.

10. Способ повышения эффективности откорма в случае скармливания жвачным животным рациона на основе концентрированных кормов, включающий введение в рубец указанных жвачных животных эффективного количества штамма по п.1.

11. Способ по п.10, в котором штамм по п.1 вводят в анаэробных условиях.

12. Способ повышения скорости роста и сокращения времени откорма жвачных животных, включающий введение в рубец указанных жвачных животных эффективного количества штамма по п.1.

13. Способ по п.12, в котором штамм по п.1 вводят в анаэробных условиях.

14. Способ снижения заболеваемости, обусловленной нарушениями пищеварения, и смертности среди жвачных животных от лактоацидоза и связанных с ним состояний и сокращения случаев лактоацидоза и связанных с ним состояний у жвачных животных, включающий введение в рубец указанных жвачных животных эффективного количества штамма по п.1.

15. Способ по п.14, в котором штамм по п.1 вводят в анаэробных условиях.

16. Способ улучшения эффективности конверсии рациона жвачного животного на основе концентрированных кормов у жвачного животного при переводе его на указанный рацион, включающий введение в рубец указанного жвачного животного эффективного количества штамма по п.1.

17. Способ выделения штамма M.elsdenii, способного к утилизации лактата со степенью от 40 до 90% даже в присутствии сахаров, включающий стадии:
получения образца жидкости рубца жвачного животного, адаптированного к рациону на основе концентрированных кормов, и
культивирования образца в питательной среде, выбранной из одной или более таких питательных сред, как питательная среда, не содержащая жидкости рубца, лактатсодержащая среда с инкубированной жидкостью рубца (IRFL), среда SDL, среда SDG, среда SDM, среда CSL 4 и среда CSL 6,
с использованием следующих параметров культивирования:
питательная среда, содержащая dH₂O, Na-лактаты, агар, бромкрезоловый пурпурный, пептон, KH₂PO₄, (NH₄)₂SO₄, MgSO₄, CaCl₂, витамины, включая пиридоксолгидрохлорид, пиридоксамин, Ca-D-пантотенат, аминобензойную кислоту, биотин, фолиевую кислоту и цианокобаламин, микроэлементы, Na₂S, противопенное средство, мальтозу, глюкозу, индигокармин, дрожжевой экстракт, CSL, KOH и L-цистеин,
pH в диапазоне от 4,5 до 6,5,
температура от 4 до 50°С,
противомикробные агенты, выбираемые из группы, состоящей из лазалоцида и монензина,
бескислородная газовая среда, содержащая CO₂.