СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ СИЛОСОВАННЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ MEGASPHAERA ELSDENII Российский патент 2023 года по МПК A23K10/18 A23K30/18 

фОбласть изобретения

[0001] Настоящее изобретение относится к способам получения силосованных растительных материалов с использованием анаэробной бактерии Megasphaera elsdenii. Настоящее изобретение также относится к силосованным растительным материалам, полученным этими способами.

Уровень техники

[0002] Силосование представляет собой ферментативный процесс, используемый для консервирования растительных материалов (например, фуража и/или зерна), потребляемых животными, такими как скот. Консервированный растительный материал, полученный способом силосования, обозначен как силосованный растительный материал. Примеры силосованных растительных материалов включают, но без ограничения, силосованный фураж, также известный как силос, силосованное зерно, также известное как ферментированное зерно, и комбинации силосованного фуража и зерна.

[0003] Как правило, растительный материал собирают и герметично закрывают в силосной башне, которая может представлять собой любой контейнер, способный поддерживать анаэробное окружение. Сначала количество захваченного атмосферного кислорода в силосной башне уменьшается посредством дыхательной активности растительного материала и аэробных микроорганизмов. Ферментация начинается, когда условия в силосной башне становятся анаэробными. Этому можно способствовать способами, включающими трамбовку растительных материалов и предотвращение поступления воздуха в силосную башню.

[0004] Рост нежелательных микроорганизмов в ходе процесса силосования, таких как клостридии, энтеробактерии и дрожжи, можно ингибировать посредством ферментации с образованием молочной кислоты, ассоциированной с молочнокислыми бактериями, присутствующими в растительных материалах. В благоприятных условиях силосования, молочнокислые бактерии могут окислять растительные материалы и предотвращать конкурентный рост нежелательных микроорганизмов. Однако, если pH не контролируют успешно в ходе процесса силосования, нежелательные микроорганизмы могут пролиферировать и приводить к деградации аминокислот, с получением в результате силосованного растительного материала с более низкой питательной ценностью. Кроме того, дальнейшая деградация силосованного растительного материала может происходить после воздействия воздуха, когда силосную башню открывают.

[0005] Таким образом, существует необходимость в улучшенных способах получения силосованных растительных материалов.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0006] Настоящее изобретение относится к способу получения силосованного растительного материала с улучшенной аэробной стабильностью, включающему: (a) введение эффективного количества клеток M. elsdenii в растительный материал, и (b) силосование растительного материала для получения силосованного растительного материала, где силосованный растительный материал имеет улучшенную аэробную стабильность по сравнению с контрольным силосованным растительным материалом, полученным в отсутствие клеток M. elsdenii.

[0007] В конкретных вариантах осуществления, улучшенная аэробная стабильность включает уменьшенный pH.

[0008] Настоящее изобретение относится к способу получения увеличенного количества силосованного растительного материала, включающему: (a) введение эффективного количества клеток M. elsdenii в растительный материал и (b) силосование растительного материала для получения силосованного растительного материала, где количество полученного силосованного растительного материала увеличено по сравнению с количеством контрольного силосованного растительного материала, полученного в отсутствие клеток M. elsdenii.

[0009] Настоящее изобретение относится к способу получения силосованного растительного материала, включающему: (a) введение клеток M. elsdenii в растительный материал, где клетки выбраны из группы, состоящей из: ATCC® 25940, ATCC® 17752, ATCC® 17753, NCIMB 702261, NCIMB 702262, NCIMB 702264, NCIMB 702331, NCIMB 702409, NCIMB 702410, NCIMB 41125, NCIMB 41787, NCIMB 41788, NRRL 18624, NIAH 1102 и их комбинаций, и (b) силосование растительного материала для получения силосованного растительного материала.

[0010] В конкретных вариантах осуществления, любые из способов дополнительно включают введение добавки в растительный материал.

[0011] В конкретных вариантах осуществления, введение проводят до сбора растительного материала, после сбора растительного материала, во время силосования или в их комбинации.

[0012] В конкретных вариантах осуществления, добавка выбрана из группы, состоящей из: другого микроорганизма, фермента, поддающегося ферментации субстрата, кислоты, консерванта, пищевой добавки и их комбинаций.

[0013] В конкретных вариантах осуществления, клетки M. elsdenii выбраны из группы, состоящей из: ATCC® 25940, ATCC® 17752, ATCC® 17753, NCIMB 702261, NCIMB 702262, NCIMB 702264, NCIMB 702331, NCIMB 702409, NCIMB 702410, NCIMB 41125, NCIMB 41787, NCIMB 41788, NRRL 18624, NIAH 1102 и их комбинаций.

[0014] В конкретных вариантах осуществления, клетки M. elsdenii представляют собой клетки M. elsdenii NCIMB 41125.

[0015] В конкретных вариантах осуществления, растительный материал выбран из группы, состоящей из: фуража, сельскохозяйственной культуры, травы, бобовых, зерна, фруктов, овощей или их комбинаций.

[0016] В конкретных вариантах осуществления, растительный материал представляет собой кукурузу, люцерну, пшеницу, рожь, ячмень, овес, тритикале, просо, клевер, сорго или их комбинации.

[0017] В конкретных вариантах осуществления, любой из способов дополнительно включает введение клеток M. elsdenii в жидкости.

[0018] В конкретных вариантах осуществления, любой из способов дополнительно включает смешивание сублимированных клеток M. elsdenii с жидкостью до введения клеток.

[0019] В конкретных вариантах осуществления, любой из способов дополнительно включает введение клеток M. elsdenii в форме сублимированных клеток.

[0020] В конкретных вариантах осуществления, сухой носитель содержит сублимированные клетки.

[0021] В конкретных вариантах осуществления, любой из способов дополнительно включает введение по меньшей мере от приблизительно 10⁶ до приблизительно 10¹⁴ КОЕ клеток M. elsdenii на тонну растительного материала.

[0022] Настоящее изобретение относится к силосованному растительному материалу, полученному любым из способов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ/ФИГУР

[0023] На ФИГ. 1 показана температура (°C) растительного материала, измеренная один раз в час в течение 120 суток силосования. Группы «Megasphaera» и «Контроль» на ФИГ. 1-14 представляли собой, соответственно, растительный материал из свежей кукурузы, который обрабатывали с использованием 2×10⁸ КОЕ/мл клеток Megasphaera elsdenii (Megasphaera elsdenii штамма NCIMB 41125, MSBiotec®, Wamego, Kansas) в соотношении 50 миллилитров на тонну растительного материала («Megasphaera»), и растительный материал из свежей кукурузы, который не обрабатывали («Контроль»).

[0024] На ФИГ. 2 показана суммарная потеря массы (%) в группах «Megasphaera» и «Контроль» на сутки 7, 14, 21, 28, 39, 90 и 120 силосования, как определено посредством взвешивания силосных башень, содержащих растительные материалы, на эти сутки и сравнения с их соответствующими начальными массами на сутки 0 силосования. Эффект обработки, P < 0,01; эффект на сутки, P > 0,10; Зависимость от суток обработки, P > 0,10; Стандартная ошибка среднего=3,16.

[0025] На ФИГ. 3 показан средний pH образцов, отобранных из групп «Megasphaera» и «Контроль». Образцы отбирали из силосных башень на трое суток открытия (т.е. суток, на которые открывали силосные башни), включая сутки 0 («D0»), сутки 14 («D14») и сутки 120 («D120») силосования. Отсутствие эффекта обработки, P > 0,6; Стандартная ошибка среднего=0,02.

[0026] На ФИГ. 4 показаны средние концентрации летучих жирных кислот (VFA) (миллимолярные) в образцах, отобранных из групп «Megasphaera» и «Контроль», как описано в ФИГ. 3. «SEM» представляет собой стандартную ошибку среднего. «D» = эффект суток открытия, с P < 0,05.

[0027] На ФИГ. 5 показана температура (°C), измеренная в течение 14 суток воздействия окружающего воздуха на образцы «Megasphaera» и «Контроль», собранные на сутки открытия 14 как описано на ФИГ. 3. Температура для «Megasphaera» была выше, чем для «Контроля» через 72-110 часов, P < 0,05. Зависимость обработки от времени, P < 0,01; Эффект времени, P < 0,01; Эффект обработки, P < 0,01; Стандартная ошибка среднего=0,023.

[0028] На ФИГ. 6 показан средний pH образцов «Megasphaera» и «Контроль», измеренный на сутки 0 («D0») и сутки 14 («D14») воздействия окружающего воздуха после сбора на сутки открытия 14, как описано на ФИГ. 3. Зависимость от суток обработки, P < 0,05; Эффект времени, P < 0,01; Эффект обработки, P < 0,05; Обработки, обозначенные звездочкой («*»), отличаются друг от друга на сутки 14, P < 0,05; Стандартная ошибка среднего=0,07.

[0029] На ФИГ. 7 показана средняя миллимолярная («мМ») общая концентрация летучих жирных кислот в образцах «Megasphaera» и «Контроль», измеренная на сутки 0 («D0») и сутки 14 («D14») воздействия окружающего воздуха после сбора на сутки открытия 14, как описано на ФИГ. 3. На ФИГ. 7 показана также средняя концентрация летучих жирных кислот в образце до силосования. Зависимость обработки от суток открытия, P > 0,5; Эффект инокулянта, P > 0,1; Эффект суток открытия, P < 0,6; Стандартная ошибка среднего=6,65.

[0030] ФИГ. 8 показаны средние миллимолярные концентрации летучих жирных кислот («VFA») в образцах «Megasphaera» и «Контроль», измеренные на сутки 0 («D0») и сутки 14 («D14») воздействия окружающего воздуха после сбора на сутки открытия 14, как описано на ФИГ. 3. «D» = Эффект суток открытия, с P < 0,05.

[0031] На ФИГ. 9 показана средняя масса в фунтах («ф») на сутки 0, сутки 7 и сутки 14 воздействия окружающего воздуха для каждого образца «Megasphaera» и «Контроль», собранного на сутки открытия 14, как описано на ФИГ. 3. Зависимость от суток обработки, P > 0,9; Эффект суток, P > 0,1; Эффект обработки, P > 0,6; Стандартная ошибка среднего=0,16.

[0032] На ФИГ. 10 показана температура (°C), измеренная после воздействия окружающего воздуха на сутки 14 в образцах «Megasphaera» и «Контроль», собранных на сутки открытия 120, как описано на ФИГ. 3. Температура для «Megasphaera» была больше, чем для «Контроля», через 259-294 часов, P < 0,10. Зависимость обработки от времени, P > 0,10; Эффект времени, P < 0,01; Эффект обработки, P < 0,01; Стандартная ошибка среднего=1,23.

[0033] На ФИГ. 11 показан средний pH образцов «Megasphaera» и «Контроль», измеренный на сутки 0 («D0») и сутки 14 («D14») воздействия окружающего воздуха после сбора на сутки открытия 120, как описано на ФИГ. 3. Зависимость от суток обработки, P > 0,1; Эффект времени, P > 0,1; Эффект обработки, P > 0,1; Стандартная ошибка среднего=0,23.

[0034] На ФИГ. 12 показана средняя миллимолярная («мМ») общая концентрация летучих жирных кислот в образцах «Megasphaera» и «Контроль», измеренная на сутки 0 («D0») и сутки 14 («D14») воздействия окружающего воздуха после сбора на сутки открытия 120, как описано на ФИГ. 3. На ФИГ. 12 показана также средняя концентрация летучих жирных кислот в образце до силосования. Зависимость обработки от воздействия кислорода, P > 0,5; Эффект инокулянта, P > 0,15; Эффект суток воздействия кислорода, P < 0,01; Стандартная ошибка среднего=18,4.

[0035] На ФИГ. 13 показаны средние миллимолярные концентрации летучих жирных кислот («VFA») в образцах «Megasphaera» и «Контроль», измеренные на сутки 0 («D0») и сутки 14 («D14») воздействия окружающего воздуха после сбора на сутки открытия 120, как описано на ФИГ. 3. «D» = Эффект суток воздействия кислорода; «I» = Эффект взаимодействия; «T» = Эффект обработки; Буквами обозначено P < 0,05.

[0036] На ФИГ. 14 показана средняя масса в фунтах («ф») на сутки 0, сутки 7 и сутки 14 воздействия окружающего воздуха для каждого образца «Megasphaera» и «Контроль», собранного на сутки открытия 120, как описано на ФИГ. 3. Зависимость от суток обработки, P > 0,90; Эффект суток, P > 0,6; Эффект обработки, P < 0,01; Стандартная ошибка среднего=0,10.

[0037] На ФИГ. 15 показан эффект температуры хранения на жизнеспособность жидких культур Megasphaera elsdenii NCIMB 41125 в течение 28-суточного периода, применительно к выходу клеток M. elsdenii в колониеобразующих единицах на миллилитр («КОЕ/мл») в логарифмической («Log10») шкале.

[0038] На ФИГ. 16 показана жизнеспособность жидких культур M. elsdenii NCIMB 41125 через 0, 7, 14, 21 и 28 суток хранения при комнатной температуре, применительно к выходу клеток M. elsdenii в КОЕ/мл в Log10 шкале.

[0039] На ФИГ. 17 показана схема системы проточной фильтрации вдоль потока («TFF»).

[0040] На ФИГ. 18 показан выход клеток M. elsdenii в КОЕ/мл ретентата на y-оси в Log10 шкале после пропускания через систему TFF. На x-оси указано 70%, 80% или 90% уменьшение объема посредством системы. «Целевое» относится к теоретическому выделению клеток M. elsdenii после переработки посредством TFF. «Конц». относится к фактическому выделению клеток M. elsdenii в ретентате, представляющем собой объем концентрированных клеток, оставшихся после отмеченного уменьшения объема.

[0041] На ФИГ. 19 показана потеря клеток после замораживания клеток при -80°C или в жидком азоте (LiqN) и сушки сублимацией клеток с использованием медленного (38 часов при 135 мТорр (18 Па)) или быстрого (18,5 часов при 250 мТорр (33 Па)) цикла. Клетки происходили из ретентатов после 70%, 80% или 90% уменьшения объема с использованием культур после TFF, содержащих либо 8% мальтодекстрина/15% обезжиренного молока (M/SM) или 8% трегалозы/15% обезжиренного молока (T/SM) в качестве криопротекторов.

[0042] На ФИГ. 20 показан выход клеток M. elsdenii NCIMB 41125 после начального быстрого (в жидком азоте) или медленного (-20°C) замораживания посредством сушки сублимацией (в присутствии 15% мальтодекстрина и 0% или 7,5% трегалозы).

[0043] На ФИГ. 21 показана потеря клеток, наблюдаемая для клеток M. elsdenii NCIMB 41125, замороженных в присутствии или в отсутствие 4% трегалозы или 7,5% обезжиренного молока либо при -80°C, либо или в жидком азоте (LiqN).

[0044] На ФИГ. 22 показана потеря клеток, наблюдаемая в сублимированных образцах, полученных из ретентата с 90% уменьшением объема, смешанного с 8% трегалозы/15% обезжиренного молока (T/SM) или 8% мальтодекстрина/15% обезжиренного молока (M/SM), замороженных при -80°C или в жидком азоте (LiqN) и высушенных сублимацией с использованием быстрого цикла, и сохраняемых при комнатной температуре или 4°C в анаэробных условиях в течение вплоть до 24 недель.

[0045] На ФИГ. 23 показана потеря клеток, наблюдаемая в сублимированных образцах, полученных из ретентата с 90% уменьшением объема, смешанного с 8% трегалозы/15% обезжиренного молока (T/SM) или 8% мальтодекстрина/15% обезжиренного молока (M/SM), замороженных при -80°C или в жидком азоте (LiqN) и высушенных сублимацией с использованием быстрого цикла, и сохраняемых при комнатной температуре или 4°C в анаэробных условиях в течение 24 недель. Столбцы без общего верхнего индекса являются статистически различными, P < 0,02.

[0046] На ФИГ. 24 показаны кривые роста, полученные для несублимированного или регидратированного сублимированного продукта, полученного из ретентата с 90% уменьшением объема, смешанного с 8% трегалозы/15% обезжиренного молока (T/SM) или 8% мальтодекстрина/15% обезжиренного молока (M/SM), замороженного в жидком азоте (LiqN) и сублимированного с использованием после 12, 16, 20 или 24 недель хранения в анаэробных условиях при 4 или 25°C. Оптическая плотность (OD) показана при 600 нанометрах (нм), как измерено от 0 часов до 20 часов. Желтые линии=несублимированный, Красные линии=T/SM, Синие линии=M/SM, Точечные линии=сохраняемый при 4°C, и сплошные линии=сохраняемый при 25°C.

[0047] На ФИГ. 25 показаны средние миллимолярные концентрации ацетата в жидком экстракте кукурузного силоса без обработки (контрольного/необработанного) и обработанного с использованием Megasphaera elsdenii кукурузного силоса после 120 суток силосования.

[0048] На ФИГ. 26 показан эффект обработки восстановленной кукурузы с высокой влажностью в присутствии или в отсутствие Megasphaera elsdenii на уровень pH в ходе процесса силосования.

[0049] На ФИГ. 27 показан эффект на содержание сухого вещества содержащей культуры in vitro смешанных рубцовых микроорганизмов восстановленной кукурузы с высокой влажностью в присутствии или в отсутствие обработки Megasphaera elsdenii.

[0050] На ФИГ. 28 показан эффект на стоимость туши при кормлении скота силосом, обработанным Megasphaera elsdenii, по сравнению с необработанным силосом, во время фазы подготовки к откорму (до завершающего откорма). Стоимость каждой туши рассчитывали с использованием стандартизованной сетки, сконструированной посредством усреднения еженедельных ценовых данных USDA по премиям и скидкам, опубликованных в течение 10-летнего периода между январем 2008 г. и январем 2018 г.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0051] Настоящее изобретение относится к способам использования клеток Megasphaera elsdenii для получения силосованных растительных материалов. Настоящее изобретение также относится к силосованным растительным материалам, полученным этими способами.

[0052] Полное содержание всех публикаций, патентов и других ссылок, упомянутых в настоящем описании, приведено в качестве ссылки для всех целей, как если было конкретно и индивидуально указано, что содержание каждой индивидуальной публикации или патентной заявки приведено в качестве ссылки. Кроме того, цитирование или идентификацию любой ссылки в этой заявке не следует рассматривать как допущение того, что такая ссылка является доступной в качестве предшествующего уровня техники для настоящего изобретения.

Терминология

[0053] Если не определено иное, все технические и научные термины, в рамках изобретения, имеют такое же значение, которое является общепринятым для специалиста в области, к которой относится это изобретение. В случае противоречий, настоящая заявка, включая определения, имеет преимущество. Если контекст не требует иного, термины единственного числа должны включать множественное число, и термины множественного числа должны включать единственное число.

[0054] В той степени, в которой используют заголовки разделов, их не следует рассматривать как обязательно ограничивающие.

[0055] В рамках изобретения и в прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают объекты ссылки множественного числа, если контекст явно не требует иного. Например, термин «соединение» или «по меньшей мере одно соединение» может включать множество соединений, включая их смеси. Термины «один», «один или несколько» и «по меньшей мере один», например, могут быть использованы взаимозаменяемо в настоящем описании.

[0056] В рамках изобретения, термин «приблизительно», при использовании для модификации количества, относящегося к изобретению, относится к варианту числового количества, который может возникать, например, в ходе общепринятых тестирования и манипуляции; посредством неизбежной ошибки при таких тестировании и манипуляции; посредством различий в изготовлении, источнике или чистоте ингредиентов, используемых по изобретению; и т.п. Модифицированные или нет термином «приблизительно», пункты формулы изобретения включают эквиваленты перечисленных количеств. В некоторых вариантах осуществления, термин «приблизительно» обозначает плюс или минус 10% от указанного числового значения.

[0057] На протяжении этой заявки, различные варианты осуществления этого изобретения могут быть представлены в формате диапазона. Следует понимать, что описание в формате диапазона присутствует просто для удобства и краткости, и его не следует рассматривать как жесткое ограничения объема изобретения. Соответственно, описание диапазона следует рассматривать как конкретно описывающее все возможные поддиапазоны, так же как индивидуальные числовые значения внутри этого диапазона. Например, описание диапазона, например, от 1 до 6, следует рассматривать как включающее конкретно описанные поддиапазоны, такие как от 1 до 2, от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 3, от 2 до 4, от 2 до 5, от 2 до 6, от 3 до 4, от 3 до 5, от 3 до 6 и т.д., так же как индивидуальные числовые значения внутри этого диапазона, например, 1, 2, 3, 4, 5 и 6. Это применимо независимо от ширины диапазона.

[0058] Термины «содержит», «содержащий», «включает», «включающий», «имеющий» и их спряжения являются взаимозаменяемыми и обозначают «включающий, но без ограничения». Понятно, что во всех случаях, когда аспекты описаны в настоящем описании с использованием выражения «содержащий», в ином отношении аналогичные аспекты, описанные в терминах «состоящий из» и/или «в основном состоящий из», также предусмотрены.

[0059] Термин «состоящий из» означает «включающий и ограниченный этим».

[0060] Термин «в основном состоящий из» обозначает указанный материал композиции или указанные стадии способа, и те дополнительные материалы или способы, которые существенно не влияют на основные характеристики материала или способа.

[0061] Термин «и/или» в рамках изобретения следует принимать как конкретное описание каждого из двух указанных признаков или компонентов в присутствие или в отсутствие другого. Таким образом, термин «и/или», как используют в такой фразе, как «A и/или B» в настоящем описании, предназначен для включения «A и B», «A или B», «A» (отдельно) и «B» (отдельно). Подобным образом, термин «и/или», как используют в такой фразе, как «A, B и/или C», предназначен для включения каждого из следующих аспектов: A, B и C; A, B или C; A или C; A или B; B или C; A и C; A и B; B и C; A (отдельно); B (отдельно); и C (отдельно).

[0062] Термин «растительный материал», в рамках изобретения, обозначает любой растительный материал, который можно использовать в качестве корма для животных, и который может являться силосованным, включая, но без ограничения, фураж, сельскохозяйственную культуру, траву, бобовые, зерно, фрукт, овощ или их комбинации. Ссылка на «растительный материал» или конкретный тип растительного материала, описанный в настоящем описании (например, фураж, сельскохозяйственную культуру, траву, бобовые, зерно, злаковое зерно, фрукт, овощ или их комбинации), включает переработанный растительный материал (включая, но без ограничения, резанный, рубленный, шинкованный или скошенный растительный материал или их комбинации), так же, как части растительного материала, включая, но без ограничения, стебли, черешки, листья, кожица, оболочки, початки, колосья, зерно, отходы сельскохозяйственных культур или их комбинации.

[0063] Термины «культура», «культивировать» и «культивирование», в рамках изобретения, обозначает инкубацию клеток в условиях in vitro, позволяющих рост или деление клеток, или поддержание клеток в живом состоянии. Термин «культура» может также, в рамках изобретения, обозначать клетки, инкубированные в условиях in vitro (например, клетки, инкубированные в жидкой среде для роста). Термины «среда для роста» и «культуральная среда», в рамках изобретения, относятся к твердой (например, агару), полутвердой (например, агару) или жидкой (например, бульону) композиции, которая содержит компоненты для поддержания роста клеток.

[0064] Термин «добавка», в рамках изобретения, относится к одному или нескольким ингредиентам, продуктам или веществам (например, клеткам), используемым отдельно или вместе (например, для улучшения качества силосованного растительного материала, для улучшения функционирования и состояния здоровья животного, и/или для увеличения перевариваемость силосованного растительного материала).

[0065] Термины «собирать» и «сбор», в рамках изобретения, применительно к клеткам, относятся к сбору клеток из культуры, например, к сбору клеток в среде для роста из культуры, к сбору клеток посредством удаления некоторого количества среды для роста из клеток (например, посредством концентрирования клеток в жидкой культуре или отделения клеток от среды для роста), или прекращения культивирования клеток. Термины включают сбор или удаление некоторого объема жидкости, содержащей клетки, из жидкой культуры, включая объем, в котором клетки были концентрированы. Термины «жать», «жатва» и «сбор», в рамках изобретения, применительно к растительному материалу, относятся к сбору растительных материалов посредством ручных или механических способов.

[0066] Термин «выделенный», в рамках изобретения, не обязательно отражает степень, до которой изолят очищен, но указывает на выделение или отделения от природной формы или природного окружения. Изолят может включать, но без ограничения, выделенный микроорганизм, выделенную биомассу или выделенную культуру.

[0067] Термин «эффективное количество», в рамках изобретения, относится к количеству, которое приводит к достижению желательного результата.

[0068] В рамках изобретения, «наполнитель» относится к компоненту, или к смеси компонентов, которые используют для придания желательных характеристик силосованному растительному материалу, как описано в настоящем описании. Наполнитель по настоящему изобретению может быть описан как «фармацевтически приемлемый» наполнитель, означая, что наполнитель представляет собой соединение, материал, композицию, соль и/или лекарственную форму, которые, согласно обоснованному врачебному решению, являются пригодными для контакта с тканями животных (т.е. человека и не относящихся к человеку животных) без избыточной токсичности, раздражения, аллергического ответа или других проблематических осложнений на протяжении желательной длительности контакта, в соответствии с разумным соотношением пользы/риска.

[0069] В рамках изобретения, термин «выход» относится к количеству живых, или жизнеспособных, клеток, включая количество в конкретном объеме (например, колониеобразующих единиц на миллилитр («КОЕ/мл»)) или в конкретной массе (например, КОЕ на грамм («КОЕ/г»)).

[0070] В рамках изобретения, термин «жизнеспособный» относится к живому организму или организмам (например, клетке микроорганизма, которая является живой, или клеткам микроорганизмов, которые являются живыми). «Жизнеспособность» относится к способности жить, особенно в определенных условиях.

[0071] В рамках изобретения, «очищать», «очищенный» и «очистка» означает сделать в основном чистым или свободным от нежелательных компонентов, загрязнения, примеси или несовершенства материала.

[0072] Термины «изобретение» и «описание» могут быть использованы взаимозаменяемо при описании или использовании, например, в фразах «настоящее изобретение» или «настоящее описание».

[0073] Понятно, что конкретные признаки изобретения, которые, для ясности, описаны в контексте отдельных вариантов осуществления, могут быть также представлены в комбинации в одном варианте осуществления. И наоборот, различные признаки изобретения, которые, для краткости, описаны в контексте одного варианта осуществления, могут быть также представлены отдельно или в любой подходящей подкомбинации, или как является подходящим в любом другом описанном варианте осуществления изобретения. Конкретные признаки, описанные в контексте различных вариантов осуществления, не следует рассматривать как необходимые признаки этих вариантов осуществления, если вариант осуществления не является неработоспособным без этих элементов.

[0074] Хотя способы и материалы, сходные или эквивалентные описанным в настоящем описании, можно использовать в практике или тестировании настоящего изобретения, подходящие способы и материалы описаны ниже. Материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не являются ограничивающими. Другие признаки и преимущества изобретения станут очевидными из подробного описания и из формулы изобретения.

Способы получения силосованных растительных материалов

[0075] В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения силосованного растительного материала с улучшенной аэробной стабильностью, включающему: (a) введение эффективного количества клеток M. elsdenii в растительный материал и (b) силосование растительного материала для получения силосованного растительного материала, где силосованный растительный материал имеет улучшенную аэробную стабильность по сравнению с контрольным силосованным растительным материалом, полученным в отсутствие клеток M. elsdenii. В некоторых вариантах осуществления, улучшенная аэробная стабильность включает уменьшенный pH, уменьшенную потерю массы или оба.

[0076] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения увеличенного количества силосованного растительного материала, включающему: (a) введение эффективного количества клеток M. elsdenii в растительный материал, и (b) силосование растительного материала для получения силосованного растительного материала, где количество полученного силосованного растительного материала увеличено, по сравнению с количеством контрольного силосованного растительного материала, полученного в отсутствие клеток M. elsdenii. Количество силосованного растительного материала можно определять, например, посредством взвешивания силосованного растительного материала или взвешивания контейнера, содержащего силосованный растительный материал, и вычитания массы контейнера.

[0077] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения силосованного растительного материала, включающему: (a) введение клеток M. elsdenii в растительный материал, где клетки выбраны из группы, состоящей из: ATCC® 25940, ATCC® 17752, ATCC® 17753, NCIMB 702261, NCIMB 702262, NCIMB 702264, NCIMB 702331, NCIMB 702409, NCIMB 702410, NCIMB 41125, NCIMB 41787, NCIMB 41788, NRRL 18624, NIAH 1102 и их комбинаций, и (b) силосование растительного материала для получения силосованного растительного материала.

[0078] Растительный материал в способах по настоящему изобретению включает любой растительный материал, который можно подвергать силосованию для получения силосованного растительного материала.

[0079] В некоторых вариантах осуществления, растительный материал в способах по настоящему изобретению представляет собой любой растительный материал, потребляемый жвачным животным. В некоторых вариантах осуществления, жвачное животное может представлять собой, но без ограничения, скот, буйвола, овцу, козу, оленя, северного оленя, американского лося, жирафа, яка и европейского лося. В некоторых вариантах осуществления, жвачное животное выбрано из группы, состоящей из: скота, буйвола, овцы, козы, оленя и северного оленя. В некоторых вариантах осуществления, растительный материал в способах по настоящему изобретению представляет собой любой растительный материал, потребляемый верблюдовыми. В некоторых вариантах осуществления, верблюдовые могут представлять собой, но без ограничения, альпак, лам, гуанако, викуний и верблюдов.

[0080] В некоторых вариантах осуществления, растительный материал выбран из группы, состоящей из: фуража, сельскохозяйственной культуры, травы, бобовых, зерна, фруктов, овощей или их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления, растительный материал представляет собой кукурузу (т.е., маис), люцерну, пшеницу, рожь, ячмень, овес, тритикале, просо, клевер, сорго или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления, растительный материал представляет собой отходы сельскохозяйственных культур, такие как, но без ограничения, солома сорго, кукурузы или солома сои. В некоторых вариантах осуществления, растительный материал представляет собой сорняк. В некоторых вариантах осуществления, растительный материал представляет собой смесь травы и бобовых, включающую одну или несколько трав и одно или несколько бобовых.

[0081] Травы включают, но без ограничения: виды Agrostis - полевицы (например, Agrostis capillaris - полевицу обыкновенную и Agrostis stolonifera - полевицу болотную); Andropogon hallii - песчаный бородач; Arrhenatherum elatius - райграс высокий; Bothriochloa bladhii - австралийский бородач; Bothriochloa pertusa - ураганную траву; Brachiaria decumbens - суринамскую траву; Brachiaria humidicola - коронивию; виды Bromus - коротконожки; Cenchrus ciliaris - буйволиную траву; Chloris gayana - родсову траву; Cynodon dactylon - бермудскую траву; Dactylis glomerata - ежу скученную; Echinochloa pyramidalis - антилопову траву; Entolasia imbricata - травы бунгома; виды Festuca - овсяницы (например, Festuca arundinacea - овсяницу тростниковую, Festuca pratensis - овсяницу луговую, и Festuca rubra - овсяницу красную); Heteropogon contortus - гетеропогон суженный; Hymenachne amplexicaulis - вестиндскую спартину; Hyparrhenia rufa - гипаррению красную; Leersia hexandra - леерсию шеститычинковую; виды Lolium - райграссы (например, Lolium multiflorum - итальянский райграс и Lolium perenne - пастбищный райграс); Megathyrsus maximus - просо гвинейское; Melinis minutiflora - паточную траву; Paspalum dilatatum - паспалум расширенный; Phalaris arundinacea - канареечник красный; Phleum pratense - тимофеевку; виды Poa - пыреи, мятлики луговые (например, Poa arachnifera - мятлик веретенообразный, Poa pratensis - мятлик луговой и Poa trivialis - мятлик обыкновенный); Setaria sphacelata - щетинник африканский; Themeda triandra - темеду трехтычиночную; и Thinopyrum intermedium - пырей средний.

[0082] Бобовые включают, но без ограничения, травянистые бобовые и древовидные бобовые. Травянистые бобовые включают, но без ограничения,: Arachis pintoi - арахис пинто; Chamaecrista rotundifolia - круглолистный стыдливый горошек; Clitoria ternatea - мотыльковый горошек; Lotus corniculatus - лядвенец рогатый; Macroptilium atropurpureum - фасоль кустовую пурпурную; Macroptilium bracteatum - фасоль бургундскую; виды Medicago - люцерны (например, Medicago sativa - альфальфу, люцерну и Medicago truncatula - люцерну трибулосовидную); виды Melilotus - донника; Neonotonia wightii - многолетнюю сою; Onobrychis viciifolia - эспарцет посевной; виды Stylosanthes - стилозантеса (например, Stylosanthes humilis - таунсвильскую люцерну); Stylosanthes scabra - кустарниковую люцерну; виды Trifolium - клевера (например, Trifolium hybridum - гибридный клевер, Trifolium incarnatum - малиновый клевер, Trifolium pratense - красный клевер, Trifolium repens - белый клевер); и виды Vicia - вики (например, Vicia articulata - вику одноцветковую, Vicia ervilia - вику четкообразную, Vicia narbonensis - вику нарбонскую, Vicia sativa - вику посевную, плевел опьяняющий, Vicia villosa - вику мохнатую); и Vigna parkeri - вигну стелющуюся). Древовидные бобовые включают, но без ограничения,: Acacia aneura - мульгу; виды Albizia - шелковой акации; Albizia canescens - альбицию седоватую; Albizia lebbeck - леббек; Enterolobium cyclocarpum - слоновье ухо; и Leucaena leucocephala - леуцену.

[0083] В некоторых вариантах осуществления, растительный материал в способах по настоящему изобретению представляет собой растительный материал, имеющий содержание влажности от приблизительно 30% до приблизительно 90%, от приблизительно 35% до приблизительно 85%, от приблизительно 40% до приблизительно 80%, от приблизительно 40% до приблизительно 75%, от приблизительно 40% до приблизительно 70%, от приблизительно 40% до приблизительно 65%, от приблизительно 40% до приблизительно 60%, от приблизительно 45% до приблизительно 80%, от приблизительно 45% до приблизительно 75%, от приблизительно 45% до приблизительно 70%, от приблизительно 45% до приблизительно 65%, от приблизительно 50% до приблизительно 80%, от приблизительно 50% до приблизительно 75%, от приблизительно 50% до приблизительно 70%, от приблизительно 50% до приблизительно 65% или от приблизительно 50% до приблизительно 60%.

[0084] Растительный материал можно жать или собирать в любое подходящее время, например, когда влажность находится на подходящем уровне. Если уровень влажности является слишком высоким, растительному материалу можно, например, позволить увядать, пока влажность не достигнет подходящего уровня.

[0085] В некоторых вариантах осуществления, ранее дегидратированный растительный материал (например, высушенное зерно) можно регидратировать для использования в силосовании, в соответствии с любым из способов по настоящему изобретению.

[0086] Силосование в любом из способов по настоящему изобретению можно осуществлять в соответствии с любым стандартным или известным способом силосования растительного материала. Растительный материал в способах по настоящему изобретению подвергают силосованию в герметично закрытом контейнере, также обозначенном в настоящем описании как «силосная башня», для обеспечения анаэробной ферментации растительного материала.

[0087] В некоторых вариантах осуществления, способы по настоящему изобретению дополнительно включают введение добавки в растительный материал.

[0088] В некоторых вариантах осуществления, использование любого из способов по настоящему изобретению (т.е. использование клеток Megasphaera elsdenii, использование добавки, или и того, и другого) происходит до сбора растительного материала, после сбора растительного материала, во время силосования или в их комбинации. Когда используют как клетки Megasphaera elsdenii, так и добавки, их можно использовать вместе или отдельно, в одно и то же время или в разное время.

[0089] Добавка в способах по настоящему изобретению может представлять собой любую добавку, используемую в способе силосования или добавляемую к силосованному растительному материалу.

[0090] В некоторых вариантах осуществления, добавка в способах по настоящему изобретению выбрана из группы, состоящей из: микроорганизма, фермента, поддающегося ферментации субстрата, кислоты, консерванта, пищевой добавки и их комбинаций.

[0091] В некоторых вариантах осуществления, добавка в способах по настоящему изобретению представляет собой ферментируемый углевод, включая, но без ограничения, источник сахара, такой как, но без ограничения, патока, сахароза, глюкоза, декстроза, молочная сыворотка, зерно хлебных злаков, рисовые отруби, пшеничные отруби, цитрусовая пульпа, ананасовая пульпа или свекловичная пульпа.

[0092] В некоторых вариантах осуществления, добавка в способах по настоящему изобретению представляет собой фермент, такой как, но без ограничения, целлюлаза, гемицеллюлаза, амилаза, пектиназа, протеаза или ксиланаза.

[0093] В некоторых вариантах осуществления, добавка в способах по настоящему изобретению представляет собой микроорганизм, стимулирующий ферментацию, такой как, но без ограничения, молочнокислые бактерии. В некоторых вариантах осуществления, микроорганизм представляет собой Lactobacillus, Pediococcus, Enterococcus, Propionibacterium, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc или Selenomonas. В некоторых вариантах осуществления, микроорганизм представляет собой Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus cornyiformis, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus salivarus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus viridescens, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentocaceus, Pediococcus cerevisiae, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Propionibacterium jensenii, Propionibacterium acidipropionici, Propionibacterium freudenreichii, Propionibacterium globosum, Propionibacterium shermanii, Lactococcus lactis, Streptococcus bovis, Leuconostoc mesenteroides или Selenomonas ruminantium.

[0094] В некоторых вариантах осуществления, добавка в способах по настоящему изобретению представляет собой ингибитор ферментации, включая, но без ограничения, кислоты и органические соли, такие как, но без ограничения, неорганические кислоты (например, соляная кислота), муравьиная кислота, уксусная кислота, капроновая кислота, сорбиновая кислота, бензойная кислота, серная кислота, молочная кислота, акриловая кислота, формат кальция, пропионовая кислота или пропионаты, или другие химические ингибиторы, такие как, но без ограничения, формальдегид, параформальдегид, нитрит натрия, метабисульфит натрия, диоксид серы, гидроксид натрия, сульфат натрия, хлорид натрия, мочевина или аммиак.

[0095] В некоторых вариантах осуществления, добавка в способах по настоящему изобретению представляет собой ингибитор аэробной порчи, такой, но без ограничения, пропионовая кислота, пропионаты, уксусная кислота, капроновая кислота или аммиак.

[0096] В некоторых вариантах осуществления, добавка в способах по настоящему изобретению представляет собой пищевую добавку или источник питательных веществ, такие как, но без ограничения, мочевина, аммиак, известняк или другой минерал.

[0097] В некоторых вариантах осуществления, добавка в способах по настоящему изобретению представляет собой абсорбент, такой как, но без ограничения, зерно, солома, бентонит, пульпа сахарной свеклы или полиакриламид.

[0098] В некоторых вариантах осуществления, эффективное количество Megasphaera elsdenii в способах по настоящему изобретению составляет по меньшей мере приблизительно 10⁶, по меньшей мере приблизительно 10⁷, по меньшей мере приблизительно 10⁸, по меньшей мере приблизительно 10⁹, по меньшей мере приблизительно 10¹⁰, от приблизительно 10⁶ до приблизительно 10¹⁴, от приблизительно 10⁶ до приблизительно 10¹³, от приблизительно 10⁶ до приблизительно 10¹², от приблизительно 10⁶ до приблизительно 10¹¹, от приблизительно 10⁷ до приблизительно 10¹⁴, от приблизительно 10⁷ до приблизительно 10¹³, от приблизительно 10⁷ до приблизительно 10¹², от приблизительно 10⁷ до приблизительно 10¹¹, от приблизительно 10⁸ до приблизительно 10¹¹, от приблизительно 10⁹ до приблизительно 10¹¹, от приблизительно 10¹⁰ до приблизительно 10¹¹, от приблизительно 10¹⁰ до приблизительно 10¹², от приблизительно 10¹⁰ до приблизительно 10¹³, или приблизительно 10¹⁰ до приблизительно 10¹⁴ колониеобразующих единиц (КОЕ) на тонну растительного материала.

[0099] В некоторых вариантах осуществления, клетки M. elsdenii в способах по настоящему изобретению выбраны из группы, состоящей из: ATCC® 25940, ATCC® 17752, ATCC® 17753, NCIMB 702261, NCIMB 702262, NCIMB 702264, NCIMB 702331, NCIMB 702409, NCIMB 702410, NCIMB 41125, NCIMB 41787, NCIMB 41788, NRRL 18624, NIAH 1102 и их комбинаций.

[0100] В некоторых вариантах осуществления, клетки M. elsdenii в способах по настоящему изобретению представляют собой клетки M. elsdenii NCIMB 41125.

[0101] В некоторых вариантах осуществления, способы по настоящему изобретению включают введение клеток M. elsdenii в жидкость.

[0102] В некоторых вариантах осуществления, способы по настоящему изобретению включают введение клеток M. elsdenii в форме сублимированных клеток. В некоторых вариантах осуществления, сухой носитель содержит сублимированные клетки. В некоторых вариантах осуществления, сухой носитель включает, но без ограничения, карбонат кальция, сухое молоко или сахарозу.

[0103] В некоторых вариантах осуществления, способы по настоящему изобретению дополнительно включают смешивание сублимированных клеток M. elsdenii с жидкостью до введения клеток.

[0104] В некоторых вариантах осуществления, способы по настоящему изобретению включают добавление добавки в жидкость. Когда как клетки M. elsdenii, так и добавку, добавляют в жидкость, их можно вводить в отдельных жидкостях, можно вводить в отдельных жидкостях в отдельные периоды времени или в одно и то же время, или можно вводить в форме смеси в одной и той же жидкости.

[0105] В некоторых вариантах осуществления, способы по настоящему изобретению включают добавление добавки в сухой форме, такой как, но без ограничения, порошок, гранулы или сублимированные формы. Когда она находится в сухой форме, добавку можно смешивать с сухим носителем. Когда как клетки M. elsdenii, так и добавку, вводят в сухой форме, они могут находиться в отдельных сухих формах, их можно вводить в отдельных сухих формах в отдельные периоды времени или в одно и то же время, или можно вводить в форме смеси сухих форм, включая смеси сухих форм в сухом носителе.

[0106] В другом аспекте настоящее изобретение относится к силосованному растительному материалу, полученному любым из способов по настоящему изобретению.

Megasphaera elsdenii

[0107] Клетки Megasphaera elsdenii из любого штамма или любой комбинации штаммов можно использовать по изобретению, описанному в настоящем описании.

[0108] Штамм или штаммы M. elsdenii могут быть выбраны из коллекции культур для хранения (например, Американской коллекции типовых культур («ATCC®»), Национальной коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий («NCIMB»), Национальной коллекции типовых культур («NCTC»), коллекции культур Научно-исследовательской службы США («ARC») (т.е. «NRRL»), коллекции культур Национального института охраны здоровья животных (NIAH)), или могут представлять собой штамм, выделенный из природного источника (например, из желудочно-кишечного тракта жвачного животного).

[0109] Примеры штаммов M. elsdenii, которые могут быть выбраны из коллекции культур, включают, но без ограничения, штаммы, перечисленные по номерам депонирования в таблице 1. Указаны также альтернативные обозначения номеров депонирования.

Таблица 1. Примеры штаммов M. elsdenii и источник каждого штамма.

Номер депонирования Альтернативные обозначения Источник штамма ATCC® 25940 NCIMB 8927; BE2-2083 Рубец овцы ATCC® 17752 B159; NCIMB 702409; NCDO2409 N/A ATCC® 17753 T81; NCIMB 702410; NCDO2410 N/A NCIMB 702261 A17-2; A12-2; NCDO2261 Фекалии взрослого человека NCIMB 702262 S17-3; NCDO2262 Фекалии неполовозрелой свиньи NCIMB 702264 LC1 N/A NCIMB 702331 LC1; NCDO2263; NCDO2264; NCDO2331; N/A NCIMB 41125 Рубец молочной коровы NCIMB 41787 Рубец молочной коровы NCIMB 41788 Рубец молочной коровы NRRL 18624 Рубец быка NIAH 1102 N/A

[0110] В некоторых вариантах осуществления, клетки M. elsdenii происходят из штамма, имеющего номер депонирования, выбранный из группы, состоящей из: ATCC® 25940, ATCC® 17752, ATCC® 17753, NCIMB 702261, NCIMB 702262, NCIMB 702264, NCIMB 702331, NCIMB 702409, NCIMB 702410, NCIMB 41125, NCIMB 41787, NCIMB 41788, NRRL 18624, NIAH 1102 и их комбинаций, включая любое из альтернативных обозначений в таблице 1.

[0111] В некоторых вариантах осуществления, клетки M. elsdenii происходят из штамма, выделенного из жвачного животного (например, коровы). См., например, Патент США No. 7550139.

[0112] В некоторых вариантах осуществления, клетки M. elsdenii происходят из штамма, выделенного из нежвачного животного (например, человека).

[0113] В некоторых вариантах осуществления, клетки M. elsdenii происходят из штамма, выбранного по утилизации лактата (например, штамма, утилизирующего лактат в присутствии сахаров), устойчивости к ионофорным антибиотикам, относительно высокой скорости роста, способности к преимущественной продукции ацетата, способности к пролиферации при значениях pH ниже 5,0 и настолько низких, как 4,5, продукции летучих жирных кислот (VFA), активности фитазы и их комбинациям. См., например, Патент США No. 7550139.

[0114] В некоторых вариантах осуществления, штамм, выбранный по утилизации лактата, утилизирует лактат в качестве предпочтительного источника углерода в присутствии растворимого углевода (например, глюкозы и/или мальтозы). Утилизацию лактата можно определять, например, на основании роста в среде, содержащей лактат и лишенной растворимых углеводов, по сравнению с такой же средой, дополненной растворимыми углеводами.

[0115] В некоторых вариантах осуществления, клетки M. elsdenii происходят из штамма с высокой скоростью роста, по сравнению с другими штаммами. Скорости роста различных штаммов можно определять, например, посредством культивирования клеток в жидкой среде и мониторирования увеличения оптической плотности с течением времени.

[0116] В некоторых вариантах осуществления, клетки M. elsdenii происходят из штамма, способного продуцировать VFA, которые можно определять, например, посредством газовой хроматографии. В некоторых вариантах осуществления, VFA представляет собой 6-углеродную жирную кислоту.

[0117] В некоторых вариантах осуществления, клетки M. elsdenii происходят из Megasphaera elsdenii штамма NCIMB 41125. Этот штамм Megasphaera elsdenii имеет высокую удельную скорость роста (0,94 поколений/час), является способным к росту в диапазоне pH от 4,5 до 6,5 или более, использует D- и L-лактат в качестве предпочтительного субстрата, но также имеет способность утилизировать глюкозу и другие углеводы, и является устойчивым к ионофорам.

[0118] В некоторых вариантах осуществления, клетки M. elsdenii происходят из Megasphaera elsdenii штамма NCIMB 41787. В некоторых вариантах осуществления, клетки M. elsdenii происходят из Megasphaera elsdenii штамма NCIMB 41788.

[0119] В некоторых вариантах осуществления, клетки M. elsdenii происходят из Megasphaera elsdenii штамма ATCC® 25940.

[0120] В некоторых вариантах осуществления, клетки M. elsdenii происходят из штамма, выбранного из коллекции культур для хранения или выделенного из природного источника. Клетки, «происходящие» из штамма, могут представлять собой природное или искусственное производное, например, такое как субизолят, мутант, вариант или рекомбинантный штамм.

[0121] В некоторых вариантах осуществления, клетки M. elsdenii представляет собой коммерческий препарат, такой как продукт Lactipro® (например, Lactipro advance®, MSBiotec®, Wamego, Kansas).

Получение культуры, содержащей клетки Megasphaera elsdenii

[0122] Клетки M. elsdenii для использования по настоящему изобретению можно выращивать в жидкой культуре и использовать непосредственно в форме жидкой культуры. Альтернативно, клетки можно выделять из жидкой или твердой культуры и либо ресуспендировать в пригодной жидкости, либо сублимировать перед использованием.

[0123] M. elsdenii представляет собой анаэробную бактерию, которую необходимо культивировать в строгих анаэробных условиях для получения максимальных выхода и жизнеспособности.

[0124] В некоторых вариантах осуществления, культура содержит клетки M. elsdenii и среду для роста.

[0125] В некоторых вариантах осуществления, культура содержит один или несколько штаммов клеток M. elsdenii. В некоторых вариантах осуществления, культура содержит один штамм клеток M. elsdenii. В некоторых вариантах осуществления, культура состоит из одного или нескольких штаммов клеток M. elsdenii (т.е. клетки в культуре состоят из клеток M. elsdenii, например, одного или нескольких штаммов клеток M. elsdenii). В некоторых вариантах осуществления, культура состоит из одного штамма клеток M. elsdenii.

[0126] В некоторых вариантах осуществления, способы по настоящему изобретению могут также включать выращивание, сбор, и/или сушку сублимацией клеток M. elsdenii для использования в способах.

[0127] Можно использовать различные параметры ферментации для инокуляции, выращивания и сбора клеток M. elsdenii, включая непрерывную ферментацию (т.е. непрерывное культивирование) или периодическую ферментацию (т.е. периодическое культивирование). См., например, Патент США No. 7550139.

[0128] Среда для роста для клеток M. elsdenii может являться твердой, полутвердой или жидкой. Среда может содержать питательные вещества, обеспечивающие необходимые элементы, и специфические факторы, обеспечивающие рост. Множество микробиологических сред и вариантов хорошо известны в данной области. Среды можно добавлять в культуру в любое время, включая в начале культивирования, во время культивирования или периодически/непрерывно.

[0129] Примеры среды для роста включают, но без ограничения: (1) среды частично определенного состава, содержащие пептон, 3 г/л; дрожжи, 3 г/л; раствор витаминов, 2 мл/л; раствор минералов, 25 мл/л; индигокармин (0,5%), 1 г/л; 12,5% L-цистеин, 2 г/л; 12,5% сульфид натрия, 2 г/л; и дополненные либо Na-лактатом (лактатом частично определенного состава, SDL), глюкозой (глюкозой частично определенного состава, SDG) или мальтозой (мальтозой частично определенного состава, SDM); (2) модифицированный усиленный клостридиальный агар/бульонную среду (предварительно восстановленные), содержащие пептон, 10 г/л; говяжий экстракт, 10 г/л; дрожжевой экстракт, 3 г/л; декстрозу 5 г/л; NaCl, 5 г/л; растворимый крахмал, 1 г/л; L-цистеин HCl, 0,5 г/л; ацетат натрия, 3 г/л; и резазурин (0,025%), 4 мл/л; (3) триптиказо-соевый агар/бульон с дефибринированной кровью овцы; (4) свободную от сока рубца среду частично определенного состава, которая содержит Na-лактат (70%), 10 г/л; пептон, 2 г/л; KH₂PO₄ 1 г/л; (NH₄)₂SO₄ 3 г/л; MgSO₄⋅7H₂O 0,2 г/л; CaCl₂⋅2H₂O 0,06 г/л; витамины (пиридоксолгидрохлорид, 4 мг/л; пиридоксамин, 4 мг/л; рибофлавин, 4 мг/л; тиаминхлорид, 4 мг/л; никотинамид, 4 мг/л; Ca-D-пантотенат, 4 мг/л; 4-аминобензойную кислоту, 0,2 мг/л, биотин, 0,2 мг/л, фолиевую кислоту, 0,1 мг/л и цианкобаламин, 0,02 мг/л); Na₂S⋅9H₂O, 0,25 г/л; цистеин, 0,25 г/л; противовспенивающее средство, 0,07 мл/л и монензин, 10 мг/л; и которую получают посредством добавления Na-лактата и раствора минералов в бутыль-резервуар и автоклавирования в течение 60 минут; растворения пептона в 300 мл дистиллированной H2O и автоклавирования по отдельности; стерилизации фильтрацией раствора витаминов и двух восстанавливающих средств предварительно; после автоклавирования, насыщения бутыли-резервуара анаэробным газом в течение ночи; добавления других составляющих по отдельности после охлаждения; и доведения pH до желательного значения с использованием 5 Н HCl; и (5) среду с инкубированным с лактатом соком рубца («IRFL»), содержащую 400 мл инкубированного осветленного сока рубца от откормленной люцерной овцы, 371 мл дистиллированной воды, 2 г пептона, 15 г агара, 100 мл 10% (масс./об.) раствора D, L-лактата натрия, 100 мл 0,04% (масс./об.) раствора бромкрезолового пурпурного и 25 мл раствора минералов, содержащего 40 г/л KH₂PO₄; 120 г/л (NH₄)₂SO₄; 8 г/л MgSO₄⋅7H₂O и 2,4 г/л CaCl₂⋅2H₂O, где молочную кислоту (90% масс./об.) используют для доведения pH до 5,5 до автоклавирования при 121° C в течение 25 минут, затем охлаждают в водяной бане при 50°C во время насыщения смесью анаэробных газов, с последующим добавлением каждого из Na₂S⋅9H₂O (12,5% масс./об.) и цистеина·HCl⋅H₂O (12,5% масс./об.).

[0130] В некоторых вариантах осуществления, культура содержит среду для роста, содержащую по меньшей мере два источника углерода. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере два источника углерода являются выбранными из группы, состоящей из: казеина, крахмала (например, клейстеризованного крахмала и/или растворимого крахмала), лактата (т.е. молочной кислоты), декстрозы, фруктозы, фруктана, глюкозы, сахарозы, лактозы, мальтозы, ацетата, глицерина, маннита, сахарозы, ксилоза, патока, фукозы, глюкозамина, декстрана, жира, масла, глицерина, ацетата натрия, арабинозы, соевого белка, растворимого белка, рафинозы и их комбинаций.

[0131] В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере два источника углерода состоят из приблизительно 1-99% первого источника углерода (например, любого источника углерода, описанного в настоящем описании) и приблизительно 1-99% второго источника углерода (например, любого источника углерода, описанного в настоящем описании, отличного от первого источника углерода), где 100% из по меньшей мере двух источников углерода состоит из первого источника углерода и второго источника углерода. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере два источника углерода состоят из приблизительно 50-60% первого источника углерода и приблизительно 40-50% второго источника углерода, из приблизительно 50-70% первого источника углерода и приблизительно 30-50% второго источника углерода, из приблизительно 50-80% первого источника углерода и приблизительно 20-50% второго источника углерода или приблизительно 50-90% первого источника углерода и приблизительно 10-50% второго источника углерода. В других вариантах осуществления, по меньшей мере два источника углерода состоят из приблизительно 65-75% первого источника углерода и приблизительно 25-35% второго источника углерода. В некоторых вариантах осуществления, первый источник углерода представляет собой лактат.

[0132] В некоторых вариантах осуществления, клетки M. elsdenii выращивают при от приблизительно 39°C до приблизительно 40°C, при приблизительно 35°C, при приблизительно 36°C, при приблизительно 37°C, при приблизительно 38°C, при приблизительно 39°C или при приблизительно 40°C.

[0133] В некоторых вариантах осуществления, клетки M. elsdenii охлаждают до от приблизительно 18°C до приблизительно 25°C для хранения.

[0134] В некоторых вариантах осуществления, pH культуры, содержащей клетки M. elsdenii (например, во время культивирования и/или во время сбора), составляет между приблизительно 4,5 и приблизительно 7,0, между приблизительно 4,5 и приблизительно 6,5, между приблизительно 4,5 и приблизительно 6,0, между приблизительно 4,5 и приблизительно 5,5, между приблизительно 4,5 и приблизительно 5,0, между приблизительно 4,6 и приблизительно 6,9, между приблизительно 4,7 и приблизительно 6,8, между приблизительно 4,8 и приблизительно 6,7, между приблизительно 4,9 и приблизительно 6,6, между приблизительно 5,0 и приблизительно 7,0, между приблизительно 5,0 и приблизительно 6,5, между приблизительно 5,0 и приблизительно 6,0, между приблизительно 5,0 и приблизительно 5,5, между приблизительно 5,1 и приблизительно 6,9, между приблизительно 5,2 и приблизительно 6,8, между приблизительно 5,3 и приблизительно 6,7, между приблизительно 5,4 и приблизительно 6,6, между приблизительно 5,5 и приблизительно 7,0, между приблизительно 5,5 и приблизительно 6,5, между приблизительно 5,1 и приблизительно 6,4, между приблизительно 5,2 и приблизительно 6,3, между приблизительно 5,3 и приблизительно 6,2, между приблизительно 5,4 и приблизительно 6,1, между приблизительно 5,5 и приблизительно 6,0, между приблизительно 5,0 и приблизительно 6,1, между приблизительно 5,0 и приблизительно 6,2, между приблизительно 5,0 и приблизительно 6,3, между приблизительно 5,0 и приблизительно 6,4, между приблизительно 5,1 и приблизительно 6,5, между приблизительно 5,2 и приблизительно 6,5, между приблизительно 5,3 и приблизительно 6,5, или между приблизительно 5,4 и приблизительно 6,5.

[0135] Для культивирования клеток M. elsdenii, можно использовать ферментеры различного размера и дизайна, поддерживающие анаэробные условия. Ферментер может являться способным, например, к ферментации объемов культуры, достаточных для коммерческой продукции клеток M. elsdenii.

[0136] В некоторых вариантах осуществления, культура, содержащая клетки M. elsdenii, содержит также другой микроорганизм (т.е., клетку микроорганизма, не являющуюся клеткой M. elsdenii). В некоторых вариантах осуществления, культура содержит клетки M. elsdenii и другой микроорганизм, являющийся облигатным анаэробом. В некоторых вариантах осуществления, культура содержит клетки M. elsdenii и другой микроорганизм, выбранный из группы, состоящей из: Lactobacillus, Pediococcus, Enterococcus, Propionibacterium, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc или Selenomonas.

Сублимированные клетки Megasphaera elsdenii

[0137] В некоторых вариантах осуществления, клетки Megasphaera elsdenii для использования в способах и силосованных растительных материалах по настоящему изобретению представляют собой сублимированные клетки.

[0138] Сублимированные клетки M. elsdenii можно получать способом, включающим: получение культуры, содержащей клетки M. elsdenii и среду для роста; сбор клеток; замораживание клеток; и сушка сублимацией клеток, где получают сублимированные клетки M. elsdenii. В некоторых вариантах осуществления, способ осуществляют в порядке получения культуры, затем сбора клеток (т.е., сбора культивированных клеток), затем замораживания клеток (т.е., замораживания собранных клеток) и затем сушки сублимацией клеток (т.е., сушки сублимацией замороженных клеток).

[0139] В некоторых вариантах осуществления, способ осуществляют в анаэробных условиях. В некоторых вариантах осуществления, способ включает получение культуры, сбор клеток, замораживание клеток, сушку сублимацией клеток или их комбинации в анаэробных условиях.

[0140] Способ может включать любой из способов получения культуры, как описано в настоящем описании. Культура из способа может также иметь любое из свойств культуры, описанных в настоящем описании.

[0141] В некоторых вариантах осуществления, клетки в культуре содержат клетки M. elsdenii. В некоторых вариантах осуществления, клетки в культуре состоят из клеток M. elsdenii.

[0142] В некоторых вариантах осуществления, среда для роста содержит по меньшей мере два источника углерода, выбранные из группы, состоящей из: казеина, лактата (т.е. молочной кислоты), декстрозы, фруктозы, фруктана, глюкозы, сахарозы, лактозы, мальтозы, ацетата, глицерина, маннита, сахарозы, ксилозы, патоки, фукозы, глюкозамина, декстрана, жира, масла, глицерина, ацетата натрия, арабинозы, соевого белка, растворимого белка, рафинозы и их комбинаций.

[0143] В некоторых вариантах осуществления, способ включает сбор клеток в пределах 12 часов после завершения фазы экспоненциального роста культуры. Культуру можно охлаждать до комнатной температуры для остановки роста на время сбора.

[0144] В некоторых вариантах осуществления, культура содержит жидкость, и способ включает сбор клеток M. elsdenii (например, концентрированных клеток M. elsdenii) с некоторым процентом жидкости. В некоторых вариантах осуществления, способ включает сбор клеток с от приблизительно 1% до приблизительно 40%, от приблизительно 1% до приблизительно 35%, от приблизительно 1% до приблизительно 30%, от приблизительно 1% до приблизительно 25%, от приблизительно 1% до приблизительно 20%, от приблизительно 1% до приблизительно 15%, от приблизительно 1% до приблизительно 10%, от приблизительно 1% до приблизительно 5%, приблизительно 10%, приблизительно 9%, приблизительно 8%, приблизительно 7%, приблизительно 6%, приблизительно 5%, приблизительно 4%, приблизительно 3%, приблизительно 2% или приблизительно 1% жидкости. В некоторых вариантах осуществления, способ включает сбор клеток с менее чем приблизительно 40%, менее чем приблизительно 35%, менее чем приблизительно 30%, менее чем приблизительно 25%, менее чем приблизительно 20%, менее чем приблизительно 15%, менее чем приблизительно 10%, менее чем приблизительно 9%, менее чем приблизительно 8%, менее чем приблизительно 7%, менее чем приблизительно 6%, менее чем приблизительно 5%, менее чем приблизительно 4%, менее чем приблизительно 3%, менее чем приблизительно 2% или менее чем приблизительно 1% жидкости.

[0145] В некоторых вариантах осуществления, культура содержит жидкость, и способ включает сбор клеток M. elsdenii (например, концентрированных клеток M. elsdenii) посредством удаления некоторого процента жидкости. В некоторых вариантах осуществления, сбор клеток включает удаление от приблизительно 50% до приблизительно 100% жидкости, от приблизительно 55% до приблизительно 100%, от приблизительно 60% до приблизительно 100%, от приблизительно 65% до приблизительно 100%, от приблизительно 70% до приблизительно 100%, от приблизительно 75% до приблизительно 100%, от приблизительно 80% до приблизительно 100%, от приблизительно 85% до приблизительно 100%, от приблизительно 90% до приблизительно 100% или от приблизительно 95% до приблизительно 100% жидкости. В некоторых вариантах осуществления, сбор клеток включает удаление по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или по меньшей мере приблизительно 100% жидкости.

[0146] В некоторых вариантах осуществления, способ включает сбор клеток M. elsdenii посредством концентрирования клеток. В некоторых вариантах осуществления, сбор клеток включает концентрирование клеток посредством по меньшей мере одного способа, выбранного из группы, состоящей из: центрифугирования, фильтрации, диализа, обратного осмоса и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления, фильтрация включает фильтрация через глину. В некоторых вариантах осуществления, фильтрация включает проточную фильтрацию вдоль потока, также известную как фильтрация в перекрестном потоке.

[0147] В некоторых вариантах осуществления, pH культуры, содержащей клетки M. elsdenii, на время сбора составляет между приблизительно 4,5 и приблизительно 7,0, между приблизительно 4,5 и приблизительно 6,5, между приблизительно 4,5 и приблизительно 6,0, между приблизительно 4,5 и приблизительно 5,5, между приблизительно 4,5 и приблизительно 5,0, между приблизительно 4,6 и приблизительно 6,9, между приблизительно 4,7 и приблизительно 6,8, между приблизительно 4,8 и приблизительно 6,7, между приблизительно 4,9 и приблизительно 6,6, между приблизительно 5,0 и приблизительно 7,0, между приблизительно 5,0 и приблизительно 6,5, между приблизительно 5,0 и приблизительно 6,0, между приблизительно 5,0 и приблизительно 5,5, между приблизительно 5,1 и приблизительно 6,9, между приблизительно 5,2 и приблизительно 6,8, между приблизительно 5,3 и приблизительно 6,7, между приблизительно 5,4 и приблизительно 6,6, между приблизительно 5,5 и приблизительно 7,0, между приблизительно 5,5 и приблизительно 6,5, между приблизительно 5,1 и приблизительно 6,4, между приблизительно 5,2 и приблизительно 6,3, между приблизительно 5,3 и приблизительно 6,2, между приблизительно 5,4 и приблизительно 6,1, между приблизительно 5,5 и приблизительно 6,0, между приблизительно 5,0 и приблизительно 6,1, между приблизительно 5,0 и приблизительно 6,2, между приблизительно 5,0 и приблизительно 6,3, между приблизительно 5,0 и приблизительно 6,4, между приблизительно 5,1 и приблизительно 6,5, между приблизительно 5,2 и приблизительно 6,5, между приблизительно 5,3 и приблизительно 6,5 или между приблизительно 5,4 и приблизительно 6,5.

[0148] В некоторых вариантах осуществления, способ включает инокуляцию среды для роста в ферментере с использованием инокулята, содержащего клетки M. elsdenii, для получения культуры, и инкубацию культуры при температуре приблизительно 39°C, пока pH культуры не составит приблизительно 6,0. В некоторых вариантах осуществления, инокулят, содержащий клетки M. elsdenii, представляет собой флакон культуры клеток M. elsdenii или его часть. В некоторых вариантах осуществления, способ включает инокуляцию среды для роста в ферментере при соотношении инокулята и среды от 1/50 до 1/4000. В некоторых вариантах осуществления, соотношение инокулята и среды составляет 1/100.

[0149] В некоторых вариантах осуществления, культура дополнительно содержит по меньшей мере один криопротектор. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере один криопротектор выбран из группы, состоящей из: фруктозы, глюкозы, сахарозы, молочного порошка, питательной смеси для грудных детей, обезжиренного молока, трегалозы, мальтодекстрина, бетаина и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере один криопротектор присутствует в количестве от приблизительно 1% до приблизительно 50% (масс./об.) культуры, от приблизительно 1% до приблизительно 40% (масс./об.) культуры, от приблизительно 1% до приблизительно 30% (масс./об.) культуры, от приблизительно 1% до приблизительно 20% (масс./об.) культуры, от приблизительно 1% до приблизительно 10% (масс./об.) культуры, от приблизительно 1% до приблизительно 5% (масс./об.) культуры, от приблизительно 10% до приблизительно 20% (масс./об.) культуры, от приблизительно 15% до приблизительно 25% (масс./об.) культуры, от приблизительно 20% до приблизительно 30% (масс./об.) культуры, от приблизительно 30% до приблизительно 40% (масс./об.) культуры, от приблизительно 40% до приблизительно 50% (масс./об.) культуры, от приблизительно 60% до приблизительно 70% (масс./об.) культуры, от приблизительно 70% до приблизительно 80% (масс./об.) культуры. В некоторых вариантах осуществления, криопротектор добавляют посредством добавления порошкообразного криопротектора непосредственно к концентрированным клеткам M. elsdenii. В некоторых вариантах осуществления, криопротектор добавляют посредством добавления раствор криопротектора непосредственно к концентрированным клеткам M. elsdenii в соотношении 1/1, в соотношении 1/5 или в соотношении 1/10.

[0150] В некоторых вариантах осуществления, замораживание клеток включает помещение клеток в морозильник или приведение клеток в контакт с сухим льдом, жидким азотом, или их комбинацией. Замораживание клеток включает замораживание клеток, в то время как они находятся внутри контейнера. Приведение клеток в контакт включает приведение контейнера, содержащего клетки, в контакт со средой для замораживания клеток. Среда для замораживания клеток включает, но без ограничения, морозильник, баню с ацетоном-сухим льдом, жидкий азот или их комбинацию.

[0151] В некоторых вариантах осуществления, способ включает замораживание клеток при температуре от приблизительно -20°C до приблизительно -210°C. В некоторых вариантах осуществления, способ включает замораживание клеток при температуре от приблизительно -20°C до приблизительно -80°C. В некоторых вариантах осуществления, способ включает замораживание клеток при температуре от приблизительно -80°C до приблизительно -210°C. В некоторых вариантах осуществления, способ включает замораживание клеток при температуре от приблизительно -20°C до приблизительно -196°C. В некоторых вариантах осуществления, способ включает замораживание клеток при температуре от приблизительно -80°C до приблизительно -196°C. В некоторых вариантах осуществления, способ включает замораживание клеток при температуре приблизительно -20°C. В некоторых вариантах осуществления, способ включает замораживание клеток при температуре приблизительно -80°C. В некоторых вариантах осуществления, способ включает замораживание клеток при температуре приблизительно -196°C. В некоторых вариантах осуществления, способ включает замораживание клеток посредством приведения клеток в контакт с жидким азотом.

[0152] В некоторых вариантах осуществления, способ включает замораживание клеток в анаэробных условиях.

[0153] В некоторых вариантах осуществления, при замораживании получают замороженные осадки, содержащие клетки. Например, замораживание можно осуществлять с использованием сверхбыстрого морозильника.

[0154] В некоторых вариантах осуществления, диаметр замороженных гранул составляет от приблизительно 0,001 (0,0025 см) до приблизительно 1,0 дюйма (2,54 см), от приблизительно 0,01 (0,0254 см) до приблизительно 1,0 дюйма (2,54 см), от приблизительно 0,1 (0,254 см) до приблизительно 1,0 дюйма (2,54 см), от приблизительно 0,2 (0,508 см) до приблизительно 1,0 дюйма (2,54 см), от приблизительно 0,3 (0,762 см) до приблизительно 1,0 дюйма (2,54 см), от приблизительно 0,4 (1,016 см) до приблизительно 1,0 дюйма (2,54 см), от приблизительно 0,5 (1,27 см) до приблизительно 1,0 дюйма (2,54 см), от приблизительно 0,6 (1,524 см) до приблизительно 1,0 дюйма (2,54 см), от приблизительно 0,7 (1,778 см) до приблизительно 1,0 дюйма (2,54 см), от приблизительно 0,8 (2,032 см) до приблизительно 1,0 дюйма (2,54 см), от приблизительно 0,9 (2,286 см) до приблизительно 1,0 дюйма (2,54 см), от приблизительно 0,001 (0,0025 см) до приблизительно 0,9 дюйма (2,286 см), от приблизительно 0,01 (0,0254 см) до приблизительно 0,9 дюйма (2,286 см), от приблизительно 0,1 (0,254 см) до приблизительно 0,9 дюйма (2,286 см), от приблизительно 0,2 (0,508 см) до приблизительно 0,9 дюйма (2,286 см), от приблизительно 0,3 (0,762 см) до приблизительно 0,9 дюйма (2,286 см), от приблизительно 0,4 (1,016 см) до приблизительно 0,9 дюйма (2,286 см), от приблизительно 0,5 (1,27 см) до приблизительно 0,9 дюйма (2,286 см), от приблизительно 0,6 (1,524 см) до приблизительно 0,9 дюйма (2,286 см), от приблизительно 0,7 (1,778 см) до приблизительно 0,9 дюйма (2,286 см), от приблизительно 0,8 (2,032 см) до приблизительно 0,9 дюйма (2,286 см), от приблизительно 0,001 (0,0025 см) до приблизительно 0,8 дюйма (2,032 см), от приблизительно 0,01 (0,0254 см) до приблизительно 0,8 дюйма (2,032 см), от приблизительно 0,1 (0,254 см) до приблизительно 0,8 дюйма (2,032 см), от приблизительно 0,2 (0,508 см) до приблизительно 0,8 дюйма (2,032 см), от приблизительно 0,3 (0,762 см) до приблизительно 0,8 дюйма (2,032 см), от приблизительно 0,4 (1,016 см) до приблизительно 0,8 дюйма (2,032 см), от приблизительно 0,5 (1,27 см) до приблизительно 0,8 дюйма (2,032 см), от приблизительно 0,6 (1,524 см) до приблизительно 0,8 дюйма (2,032 см), от приблизительно 0,7 (1,778 см) до приблизительно 0,8 дюйма (2,032 см), от приблизительно 0,001 (0,0025 см) до приблизительно 0,7 дюйма (1,778 см), от приблизительно 0,01 (0,0254 см) до приблизительно 0,7 дюйма (1,778 см), от приблизительно 0,1 (0,254 см) до приблизительно 0,7 дюйма (1,778 см), от приблизительно 0,2 (0,508 см) до приблизительно 0,7 дюйма (1,778 см), от приблизительно 0,3 (0,762 см) до приблизительно 0,7 дюйма (1,778 см), от приблизительно 0,4 (1,016 см) до приблизительно 0,7 дюйма (1,778 см), от приблизительно 0,5 (1,27 см) до приблизительно 0,7 дюйма (1,778 см), от приблизительно 0,6 (1,524 см) до приблизительно 0,7 дюйма (1,778 см), от приблизительно 0,001 (0,0025 см) до приблизительно 0,6 дюйма (1,524 см), от приблизительно 0,01 (0,0254 см) до приблизительно 0,6 дюйма (1,524 см), от приблизительно 0,1 (0,254 см) до приблизительно 0,6 дюйма (1,524 см), от приблизительно 0,2 (0,508 см) до приблизительно 0,6 дюйма (1,524 см), от приблизительно 0,3 (0,762 см) до приблизительно 0,6 дюйма (1,524 см), от приблизительно 0,4 (1,016 см) до приблизительно 0,6 дюйма (1,524 см), от приблизительно 0,5 (1,27 см) до приблизительно 0,6 дюйма (1,524 см), от приблизительно 0,001 (0,0025 см) до приблизительно 0,5 дюйма (1,27 см), от приблизительно 0,01 (0,0254 см) до приблизительно 0,5 дюйма (1,27 см), от приблизительно 0,05 (0,127 см) до приблизительно 0,5 дюйма (1,27 см), от приблизительно 0,1 (0,254 см) до приблизительно 0,5 дюйма (1,27 см), от приблизительно 0,15 (0,381 см) до приблизительно 0,5 дюйма (1,27 см), от приблизительно 0,2 (0,508 см) до приблизительно 0,5 дюйма (1,27 см), от приблизительно 0,3 (0,762 см) до приблизительно 0,5 дюйма (1,27 см) или от приблизительно 0,4 (1,016 см) до приблизительно 0,5 дюйма (1,27 см).

[0155] Замороженные клетки M. elsdenii можно хранить замороженными (например, ниже 0°C) перед сушкой сублимацией или можно немедленно сушить сублимацией. В некоторых вариантах осуществления, замороженные клетки M. elsdenii хранят при температуре ниже приблизительно 0°C, ниже приблизительно -10°C, ниже приблизительно -20°C, ниже приблизительно -50°C, ниже приблизительно -80°C, или ниже приблизительно -196°C. В некоторых вариантах осуществления, замороженные клетки M. elsdenii хранят при температуре приблизительно -20°C, приблизительно -30°C, приблизительно -40°C, приблизительно -50°C, приблизительно -60°C, приблизительно -70°C, приблизительно -80°C, приблизительно -90°C, приблизительно -100°C, приблизительно ­150°C, приблизительно -196°C или приблизительно -210°C.

[0156] В некоторых вариантах осуществления, замороженные клетки M. elsdenii являются лиофилизированными. В некоторых вариантах осуществления, замороженные клетки M. elsdenii являются сублимированными. Сушка сублимацией включает, например, удаление жидкости из замороженных клеток.

[0157] В некоторых вариантах осуществления, сушка сублимацией клеток M. elsdenii включает помещение замороженных клеток в сублиматор. В некоторых вариантах осуществления, сушка сублимацией включает подвергание замороженных клеток воздействию пониженного давления и постепенное нагревание клеток до комнатной температуры.

[0158] В некоторых вариантах осуществления, способ включает сушку сублимацией клеток в анаэробных условиях.

[0159] В некоторых вариантах осуществления, сублимированные M. elsdenii получают в коммерческом масштабе.

[0160] В некоторых вариантах осуществления, лиофилизацию клеток M. elsdenii проводят при давлении между приблизительно 50 мТорр (7 Па) и приблизительно 2000 мТорр (267 Па), между приблизительно 100 мТорр (13 Па) и приблизительно 1950 мТорр (260 Па), между приблизительно 150 мТорр (20 Па) и приблизительно 1900 мТорр (253 Па), между приблизительно 200 мТорр (27 Па) и приблизительно 1850 мТорр (247 Па), между приблизительно 250 мТорр (33 Па) и приблизительно 1800 мТорр (240 Па), между приблизительно 300 мТорр (40 Па) и приблизительно 1750 мТорр (233 Па), между приблизительно 350 мТорр (47 Па) и приблизительно 1700 мТорр (227 Па), между приблизительно 400 мТорр (53 Па) и приблизительно 1650 мТорр (220 Па), между приблизительно 450 мТорр (60 Па) и приблизительно 1600 мТорр (213 Па), между приблизительно 500 мТорр (67 Па) и приблизительно 1550 мТорр (207 Па), между приблизительно 550 мТорр (73 Па) и приблизительно 1500 мТорр (200 Па), между приблизительно 600 мТорр (80 Па) и приблизительно 1500 мТорр (200 Па), между приблизительно 650 мТорр (87 Па) и приблизительно 1450 мТорр (193 Па), между приблизительно 700 мТорр (93 Па) и приблизительно 1400 мТорр (187 Па), между приблизительно 750 мТорр (100 Па) и приблизительно 1350 мТорр (180 Па), между приблизительно 800 мТорр (107 Па) и приблизительно 1300 мТорр (173 Па), между приблизительно 850 мТорр (113 Па) и приблизительно 1250 мТорр (167 Па), между приблизительно 900 мТорр (120 Па) и приблизительно 1200 мТорр (160 Па), между приблизительно 950 мТорр (127 Па) и приблизительно 1150 мТорр (153 Па) или между приблизительно 1000 мТорр (133 Па) и приблизительно 1100 мТорр (147 Па). В некоторых вариантах осуществления, давление в ходе процесса лиофилизации составляет 135 мТорр (18 Па). В некоторых вариантах осуществления, давление в ходе процесса лиофилизации составляет 250 мТорр (33 Па).

[0161] В некоторых вариантах осуществления, время до завершения процесса лиофилизации составляет между приблизительно 5 часами и 15 сутками, между приблизительно 6 часами и 15 сутками, между приблизительно 7 часами и 15 сутками, между приблизительно 8 часами и 15 сутками, между приблизительно 9 часами и 15 сутками, между приблизительно 10 часами и 15 сутками, между приблизительно 11 часами и 15 сутками, между приблизительно 12 часами и 15 сутками, между приблизительно 18 часами и 15 сутками, между приблизительно 24 часами и 15 сутками, между приблизительно 36 часами и 14 сутками, между приблизительно 48 часами и 13 сутками, между приблизительно 3 сутками и 12 сутками, между приблизительно 4 сутками и 11 сутками, между приблизительно 5 сутками и 10 сутками, между приблизительно 6 сутками и 9 сутками, между приблизительно 7 сутками и 8 сутками. В некоторых вариантах осуществления, время до завершения процесса лиофилизации составляет приблизительно 18,5 часов. В некоторых вариантах осуществления, время до завершения процесса лиофилизации составляет приблизительно 38,5 часов.

[0162] В некоторых вариантах осуществления, от приблизительно 1×10³ до 1×10¹² КОЕ/г сублимированных клеток M. elsdenii получают способом, описанным в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления, от приблизительно 1×10³ до 1×10¹² КОЕ/г клеток M. elsdenii являются жизнеспособными после сушки сублимацией.

[0163] Сублимированные клетки Megasphaera elsdenii также мможно получать способом, включающим: (a) получение в анаэробных условиях культуры, содержащей клетки M. elsdenii и среду для роста, содержащую по меньшей мере два источника углерода, выбранных из группы, состоящей из: казеина, лактата (т.е. молочной кислоты), декстрозы, фруктозы, фруктана, глюкозы, сахарозы, лактозы, мальтозы, ацетата, глицерина, маннита, сахарозы, ксилозы, патоки, фукозы, глюкозамина, декстрана, жира, масла, глицерина, ацетата натрия, арабинозы, соевого белка, растворимого белка, рафинозы и их комбинаций, (b) сбор клеток в анаэробных условиях, (c) замораживание клеток и (d) сушку сублимацией клеток, где получают от приблизительно 1×10³ до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г сублимированных клеток M. elsdenii.

[0164] Сублимированные клетки Megasphaera elsdenii можно также получать способом, включающим: (a) получение культуры, содержащей клетки M. elsdenii и среду для роста, (b) сбор клеток в анаэробных условиях в пределах 12 часов после завершения фазы экспоненциального роста культуры, (c) замораживание клеток, (d) сушку сублимацией клеток и необязательно, (e) инкапсуляцию сублимированных клеток, где получают сублимированные клетки M. elsdenii или инкапсулированные сублимированные клетки M. elsdenii.

[0165] Сублимированные клетки Megasphaera elsdenii можно также получать способом, включающим: (a) получение культуры, содержащей клетки M. elsdenii и среду для роста, (b) сбор клеток, (c) замораживание клеток при температуре от приблизительно -80°C до приблизительно -210°C в пределах 5 часов от сбора, (d) сушку сублимацией клеток и необязательно, (e) инкапсуляцию сублимированных клеток, где получают сублимированные клетки M. elsdenii или инкапсулированные сублимированные клетки M. elsdenii.

[0166] В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к инкапсулированной сублимированной композиции, содержащей клетки M. elsdenii, где сублимированный порошок является инкапсулированным с использованием (a) масла, включая, но без ограничения, растительное масло, пальмовое масло, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, олеиновую кислоту, линолевую кислоту и линоленовую кислоту, (b) пищевого полимера, включая, но без ограничения, альгинат, хитозан, карбоксиметилцеллюлозу, ксантановую смолу, крахмал, каррагинан, желатин и пектин (c), молочные белки, включая, но без ограничения, казеин и белок молочной сыворотки, и (d) растительный белок из сои, зернобобовых культур и хлебных злаков, включая, но без ограничения, зеин. В некоторых вариантах осуществления, количество сублимированных клеток M. elsdenii или инкапсулированных сублимированных клеток M. elsdenii, полученных способом, описанным в настоящем описании, и/или количество клеток M. elsdenii или инкапсулированных сублимированных клеток M. elsdenii, которые являются жизнеспособными после сушки сублимацией, составляет от приблизительно 1×10³ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г, от приблизительно 1×10³ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹¹ КОЕ/г, от приблизительно 1×10³ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹⁰ КОЕ/г, от приблизительно 1×10³ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁹ КОЕ/г, от приблизительно 1×10³ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁸ КОЕ/г, от приблизительно 1×10³ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁷ КОЕ/г, от приблизительно 1×10³ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁶ КОЕ/г, от приблизительно 1×10³ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁵ КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁴ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁵ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁶ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁷ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁸ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁹ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г, от приблизительно 1×10¹⁰ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г, от приблизительно 1×10³ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁵ КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁴ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁶ КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁵ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁷ КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁶ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁸ КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁷ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁹ КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁸ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹⁰ КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁹ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹¹ КОЕ/г или от приблизительно 1×10¹⁰ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г.

[0167] В некоторых вариантах осуществления, сублимированные клетки M. elsdenii или инкапсулированные сублимированные клетки M. elsdenii являются жизнеспособными в течение от приблизительно 14 суток до приблизительно 24 месяцев при приблизительно -80 °C, приблизительно -20°C, приблизительно 4°C, приблизительно 25°C, или их комбинациях. В некоторых вариантах осуществления, сублимированные клетки M. elsdenii или инкапсулированные сублимированные клетки M. elsdenii являются жизнеспособными в течение по меньшей мере приблизительно 14 суток, по меньшей мере приблизительно 1 месяца, по меньшей мере приблизительно 6 месяцев, по меньшей мере приблизительно 8 месяцев, по меньшей мере приблизительно 10 месяцев, по меньшей мере приблизительно 12 месяцев, по меньшей мере приблизительно 15 месяцев, по меньшей мере приблизительно 18 месяцев или по меньшей мере приблизительно 24 месяцев при приблизительно -80°C, приблизительно -20°C, приблизительно 4°C, приблизительно 25°C или их комбинациях.

[0168] В некоторых вариантах осуществления, от приблизительно 1×10³ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г, от приблизительно 1×10³ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹¹ КОЕ/г, от приблизительно 1×10³ КОЕ/мл до приблизительно 1×10¹⁰ КОЕ/г, от приблизительно 1×10³ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁹ КОЕ/г, от приблизительно 1×10³ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁸ КОЕ/г, от приблизительно 1×10³ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁷ КОЕ/г, от приблизительно 1×10³ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁶ КОЕ/г, от приблизительно 1×10³ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁵ КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁴ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁵ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁶ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁷ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁸ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁹ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г, от приблизительно 1×10¹⁰ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г, от приблизительно 1×10³ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁵ КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁴ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁶ КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁵ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁷ КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁶ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁸ КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁷ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁹ КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁸ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹⁰ КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁹ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹¹ КОЕ/г или от приблизительно 1×10¹⁰ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г сублимированных клеток M. elsdenii или инкапсулированных сублимированных клеток M. elsdenii являются жизнеспособными после хранения при температуре приблизительно -80°C, приблизительно -20°C, приблизительно 4°C или их комбинациях в течение по меньшей мере приблизительно 14 суток, по меньшей мере приблизительно 1 месяца, по меньшей мере приблизительно 6 месяцев, по меньшей мере приблизительно 8 месяцев, по меньшей мере приблизительно 10 месяцев, по меньшей мере приблизительно 12 месяцев, по меньшей мере приблизительно 15 месяцев, по меньшей мере приблизительно 18 месяцев или по меньшей мере приблизительно 24 месяцев.

[0169] В некоторых вариантах осуществления, от приблизительно 1×10³ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г, от приблизительно 1×10³ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹¹ КОЕ/г, от приблизительно 1×10³ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹⁰ КОЕ/г, от приблизительно 1×10³ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁹ КОЕ/г, от приблизительно 1×10³ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁸ КОЕ/г, от приблизительно 1×10³ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁷ КОЕ/г, от приблизительно 1×10³ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁶ КОЕ/г, от приблизительно 1×10³ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁵ КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁴ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁵ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁶ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁷ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁸ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁹ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г, от приблизительно 1×10¹⁰ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г, от приблизительно 1×10³ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁵ КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁴ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁶ КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁵ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁷ КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁶ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁸ КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁷ КОЕ/г до приблизительно 1×10⁹ КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁸ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹⁰ КОЕ/г, от приблизительно 1×10⁹ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹¹ КОЕ/г или от приблизительно 1×10¹⁰ КОЕ/г до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г сублимированных клеток M. elsdenii или инкапсулированные сублимированные клетки M. elsdenii являются жизнеспособными после хранения при температуре приблизительно 25°C в течение по меньшей мере приблизительно 14 суток, по меньшей мере приблизительно 1 месяца, по меньшей мере приблизительно 6 месяцев, по меньшей мере приблизительно 8 месяцев, по меньшей мере приблизительно 10 месяцев, по меньшей мере приблизительно 12 месяцев, по меньшей мере приблизительно 15 месяцев, по меньшей мере приблизительно 18 месяцев или по меньшей мере приблизительно 24 месяцев.

ПРИМЕРЫ

[0170] В настоящее время приведена ссылка на следующие примеры, которые, вместе с приведенными выше описаниями, иллюстрируют некоторые варианты осуществления изобретения неограничивающим образом.

ПРИМЕР 1

Оценка Megasphaera elsdenii NCIMB 41125 для получения силосованного растительного материала

A. Обработка растительного материала и силосование

[0171] Растительный материал из свежей кукурузы либо обрабатывали с использованием 2×10⁸ КОЕ/мл клеток Megasphaera elsdenii (т.е. Megasphaera elsdenii штамма NCIMB 41125, MSBiotec®, Wamego, Kansas), введенных со скоростью 50 мл на тонну растительного материала посредством пистолета-распылителя, либо не обрабатывали (контроль).

[0172] Приблизительно 100 фунтов (ф) (40 килограмм (кг)) растительного материала, обработанного клетками Megasphaera elsdenii, или необработанного растительного материала упаковывали в отдельные 15-галлонные (57-литровые) бочки (т.е. силосные башни) и герметично закрывали. Подготавливали четыре повтора для каждой обработки. Силосование проводили в течение 120 суток в стандартных условиях.

[0173] Каждая силосная башня содержала термометр-щуп, соединенный с устройством регистрации данных. Считывания температуры (°C) собирали один раз в час в течение 120 суток силосования, где данные показаны на ФИГ. 1 для обработки клетками Megasphaera elsdenii («Megasphaera») или контроля («Контроль»).

[0174] Силосные башни взвешивали на сутки 7, 14, 21, 28, 39, 90 и 120 для определения процента суммарной потери массы (например, потери при дыхании) в течение периода силосования, по сравнению с начальной массой на сутки 0. См. ФИГ. 2; Эффект обработки, P < 0,01; Эффект суток, P > 0,10; Зависимость от суток обработки, P > 0,10; Стандартная ошибка среднего=3,16.

[0175] Дополнительные тесты проводили на трое суток открытия (т.е., на сутки, на которые силосные башни открывали), включая сутки 0, сутки 14 и сутки 120 силосования.

B. Тесты pH и VFA

[0176] Образцы собирали из силосной башни для каждой обработки на сутки открытия 0, 14 и 120. Измеряли pH и миллимолярные концентрации летучих жирных кислот (VFA) в образцах. Средние значения для pH показаны на ФИГ. 3; Отсутствие эффекта обработки, P > 0,6; Стандартная ошибка среднего=0,02. Средние значения для концентраций VFA показаны на ФИГ. 4; «SEM» представляет собой стандартную ошибку среднего. «D» = эффект суток открытия, с P < 0,05.

C. Тесты аэробной стабильности

[0177] На каждые сутки открытия 14 и 120, приблизительно 10 ф (4,5 кг) силосованного растительного материала переносили из силосной башни для каждой обработки в соответствующие 18-л контейнеры. Образец в каждом 18-л контейнере подвергали воздействию окружающего воздуха в течение 14 суток.

[0178] На ФИГ. 5 и ФИГ. 10 показана средняя температура (°C), измеренная в течение 14 суток воздействия окружающего воздуха для каждой обработки на сутки открытия 14 (ФИГ. 5; Зависимость обработки от времени, P < 0,01; Эффект времени, P < 0,01; Эффект обработки, P < 0,01; Стандартная ошибка среднего=0,023) и сутки открытия 120 (ФИГ. 10; Зависимость обработки от времени, P > 0,10; Эффект времени, P < 0,01; Эффект обработки, P < 0,01; Стандартная ошибка среднего=1,23).

[0179] На ФИГ. 6 и ФИГ. 11 показаны измерения среднего pH на сутки 0 («D0») и сутки 14 («D14») воздействия окружающего воздуха для каждой обработки на сутки открытия 14 (ФИГ. 6; Зависимость от суток обработки, P < 0,05; Эффект времени, P < 0,01; Эффект обработки, P < 0,05; Обработки, обозначенные звездочкой («*»), отличаются друг от друга на сутки 14 (P < 0,05; Стандартная ошибка среднего=0,07), и сутки открытия 120 (ФИГ. 11; Зависимость от суток обработки, P > 0,1; Эффект времени, P > 0,1; Эффект обработки, P > 0,1; Стандартная ошибка среднего=0,23).

[0180] На ФИГ. 7-8 и ФИГ. 12-13 показаны средние концентрации VFA (миллимолярные (мМ)), измеренные на сутки 0 и сутки 14 воздействия окружающего воздуха для каждого образца, собранного на сутки открытия 14 (ФИГ. 7-8) и сутки открытия 120 (ФИГ. 12-13). На ФИГ. 7 и ФИГ. 12 показаны общие концентрации VFA, включая образец до силосования. Для ФИГ. 7, Зависимость обработки от суток открытия, P > 0,5; Эффект инокулянта, P > 0,1; Эффект суток открытия, P < 0,6; Стандартная ошибка среднего=6,65. Для ФИГ. 8, «D» = Эффект суток открытия, с P < 0,05. Для ФИГ. 12, Зависимость обработки от воздействия кислорода, P > 0,5; Эффект инокулянта, P > 0,15; Эффект суток воздействия кислорода, P < 0,01; Стандартная ошибка среднего=18,4. Для ФИГ. 13, «D» = Эффект суток воздействия кислорода; «I» = Эффект взаимодействия; «T» = Эффект обработки; Буквами обозначено P < 0,05.

[0181] На ФИГ. 9 и ФИГ. 14 показана средняя масса (ф) на сутки 0, сутки 7, и сутки 14 воздействия окружающего воздуха для каждой обработки на сутки открытия 14 (ФИГ. 9, Зависимость от суток обработки, P > 0,9; Эффект суток, P > 0,1; Эффект обработки, P > 0,6; Стандартная ошибка среднего=0,16) и сутки открытия 120 (ФИГ. 14, Зависимость от суток обработки, P > 0,90; Эффект суток, P > 0,6; Эффект обработки, P < 0,01; Стандартная ошибка среднего=0,10).

D. Обобщение

[0182] По сравнению с контролем, обработка растительного материала клетками M. elsdenii до силосования приводила, например, к меньшей потере массы в ходе силосования (т.е., в ходе анаэробной ферментации), так же как к уменьшенному pH и меньшей потере массы после воздействия окружающего воздуха (т.е. увеличенной аэробной стабильности). См., например, ФИГ. 2, 6 и 9, соответственно.

ПРИМЕР 2

Эффект температуры на выход жидких культур M. elsdenii

[0183] Температуры при хранении 4°C, 20°C и 39°C тестировали для оценки жизнеспособности клеток в жидких культурах M. elsdenii NCIMB 41125 через 0, 7, 14, 21 и 28 суток. Результаты выявили, что хранение продукта при 4°C значимо (P < 0,001) улучшало жизнеспособность культуры, по сравнению с хранением при 20°C или 39°C, независимо от суток отбора образцов. Через 28 суток, продукт, сохраняемый при 4°C, имел 3,98×10⁶ колониеобразующих единиц на миллилитр (КОЕ/мл), по сравнению с 1,26×10⁶ и 6,3×10⁵ КОЕ/мл для продукта, сохраняемого при 20°C или 39°C, соответственно (P < 0,01; ФИГ. 15). Таким образом, результаты показывают, что уменьшение температуры хранения улучшает жизнеспособность жидких культур M. elsdenii NCIMB 41125.

[0184] Дополнительные данные из отдельного исследования показывают, что выход Megasphaera elsdenii NCIMB 41125 в жидкой культуре уменьшается после 0, 7, 14, 21 и 28 суток хранения при комнатной температуре (ФИГ. 16).

ПРИМЕР 3

Использование проточной фильтрации вдоль потока для концентрирования культур M. elsdenii

[0185] Проточную фильтрацию вдоль потока (TFF) исследовали в качестве способа концентрирования больших объемов культуры с высокой производительностью.

[0186] Систему TFF в пилотном масштабе (см. ФИГ. 17) интегрировали в производственную линию для M. elsdenii и тестировали на 500-литровых (л) циклах продукции для оценки системы в пилотном масштабе при уровнях уменьшения объема 70%, 80% и 90%. Использовали модуль TFF с одной 100 кДа мембраной RC (высота канала 0,875 мм). Три цикла продукции проводили для каждого уровня уменьшения, всего девять циклов. Образцы собирали для каждого цикла и анализировали по pH, оптической плотности (OD), присутствию или отсутствию аэробных контаминантов, осмолярности, профилю летучих жирных кислот, концентрации M. elsdenii и характеристикам роста. Образцы собирали из девяти культур M. elsdenii («Несублимированные») до начала фильтрации, из пермеата («Пермеат»), который представляет собой объем, удаленный посредством системы, и из ретентата («Ретентат»), который представляет собой объем концентрированной культуры M. elsdenii, содержащий клетки, оставшийся после уменьшений объема.

[0187] Образцы пермеата, собранные в начале, в середине и в конце процесса концентрирования, имели согласующиеся считывания OD среди уровней уменьшения объема, все ниже 0,045 (данные не представлены). Количество M. elsdenii, выделенных в пермеате, увеличивалось в ходе процесса концентрирования (P=0,0006), но все еще оставалось пренебрежимо малым (менее 3×10⁴ КОЕ/мл), по сравнению с количеством клеток, собранным в ретентате (< 0,002%). Уровни уменьшения объема не оказывали эффект на концентрацию M. elsdenii, выделенных в пермеате (P > 0,9; Таблица 2).

Таблица 2. Средний выход M. elsdenii в образцах, собранных в ходе девяти циклов продукции, проведенных для оценки системы TFF в пилотном масштабе при уменьшениях объема на 70%, 80% и 90%

КОЕ/мл, Log10 Стандартная ошибка Эффект обработки, значение P Образцы 70% 80% 90% Пермеат 1,19 1,07 1,12 0,40 0,958 Ретентат 8,99 9,04 9,25 0,03 <0,0001

[0188] Выход M. elsdenii в ретентате не отличался в пакетах, собранных в начале, в середине или в конце каждого процесса упаковки в пакеты (P=0,6088; данные не представлены). На выход ретентата влияли уровни уменьшения объема (P < 0,0001; таблица 2 и ФИГ. 18). Ретентат после уменьшения объема на 90% имел более высокий выход, чем ретентат после уменьшения объема на 70% и 80% (P < 0,0001). Однако ретентаты для 70% и 80% не отличались друг от друга (P > 0,09).

[0189] Процесс фильтрации не влиял на способность клеток M. elsdenii расти при инокуляции обратно в среды SDL-20 (таблица 3). На углы наклона кривой в экспоненциальной фазе не влиял уровень уменьшения объема (P > 0,3), но влиял тип образца: «Ретентат», по сравнению с «Несублимированным» (P < 0,001). На латентный период влиял как уровень уменьшения объема, так и тип образца (P < 0,001). Латентный период для ретентата уменьшался с увеличением уменьшения объема, что являлось репрезентативным для более высокой концентрации клеток.

Таблица 3. Сравнение угла наклона кривой и латентного периода между исходными M. elsdenii (до фильтрации=несублимированный) и ретентатом (после фильтрации), собранными в ходе различных циклов TFF для уменьшения объема

Тип образца Эффекты, значения P Несублимированный Ретентат Тип образца Уменьш. объема Взаимосвязь 70% 80% 90% 70% 80% 90% Угол наклона кривой 0,39 0,36 0,37 0,44 0,42 0,43 < 0,001 0,329 0,979 Латентный период, час 1,42^a 1,10^b 1,07^b 0,32^c 0,29^c 0,24^c 0,001 <0,001 < 0,001

ПРИМЕР 4

Параметры замораживания и сушки сублимацией для M. elsdenii

A. Замораживание и сушка сублимацией ретентатов

[0190] Ретентаты, полученные в ходе TFF, использовали для тестирования способов замораживания, включения криопротектора и различных параметров сушки сублимацией.

[0191] Ретентаты переносили в стерильные бутыли для сыворотки при дегазировании и смешивали в асептичечских условиях с различными составами криопротекторов (масс./об.): без криопротектора (Контр.), обезжиренное молоко (SM), трегалоза (T) и бетаин. Из ретентатов, смешанных с соответствующим криопротектором, отбирали образцы для определения концентрации M. elsdenii до сушки сублимацией (т.е. количества жизнеспособных клеток). Смеси переносили в 10 мл ампулы (4 мл/ампулу) и мгновенно замораживали в жидком азоте или медленно замораживали при -80°C в течение ночи. Ампулы переносили в сублиматор для лиофилизации с использованием либо медленного, либо быстрого цикла. По завершению сушки сублимацией, выживаемость бактерий определяли посредством ресуспендирования лиофилизированного продукта в анаэробной камере с анаэробным разбавителем, обеспечения регидратации в течение 40 минут при комнатной температуре и затем рассева на агар SDL20.

[0192] Потерю клеток рассчитывали посредством вычитания концентрации M. elsdenii, выделенных после сушки сублимацией, из исходной концентрации M. elsdenii, измеренной в соответствующем ретентате, смешанном с криопротекторами или нет. Программное обеспечение SAS® использовали для расчета данных потери клеток посредством анализа взаимодействий между уровнями уменьшения объема (70%, 80% или 90%), циклом сушки сублимацией (медленным по сравнению с быстрым), способом замораживания (-80°C по сравнению с жидким азотом), криопротекторами (без криопротектора, бетаин, трегалоза, обезжиренное молоко, мальтодекстрин, трегалоза/обезжиренное молоко (T/SM) и мальтодекстрин/обезжиренное молоко (M/SM)).

[0193] Потеря клеток, наблюдаемая при контрольной обработке (без криопротекторов), независимо от других критериев, составляла 5 Log (КОЕ/мл) или выше. Подобным образом, потеря клеток, наблюдаемая при обработке бетаином, независимо от других критериев, составляла 3,96 Log КОЕ/мл или выше. Приемлемый предел потери клеток устанавливали на 1,6 log КОЕ/мл. Ретентаты, смешанные с T/SM или M/SM, все были ниже этого порога, независимо от использованного цикла сушки сублимацией или способа замораживания, за исключением T/SM, при замораживании при -80°C и сушке сублимацией с использованием медленного или быстрого цикла (ФИГ. 19).

B. Эффекты условий сушки сублимацией на хранение

[0194] Megasphaera elsdenii NCIMB 41125 концентрировали 10x с использованием устройства для фильтрации и проводили анализы сушки сублимацией, тестирующие различные характеристики: быстрое или медленное начальное замораживание (жидкий азот по сравнению с -20°C), присутствие или отсутствие трегалозы (0%, 4%, 7,5% и 10%) и мягкие или быстрые циклы сушки сублимацией (38 час при 2×10^-6 Торр (2,7 ×10^-4 Па) по сравнению с 16,5 час при 135×10^-6 Торр (1,8×10^-2 Па)). При всех тестированных способах сушки сублимацией получали продукты, способные сохранять достаточную жизнеспособность для инициации роста культуры после регидратации, даже после длительного хранения от 4 до 12 месяцев при комнатной температуре. Различия в жизнеспособности бактерий тем не менее наблюдали, в зависимости от используемых характеристик сушки сублимацией (ФИГ. 20). Стадии медленного замораживания, включения 7,5% трегалозы и мягкой сушки сублимацией, поддерживающие конечную водную активность выше 0,04, являлись ассоциированными с большей выживаемостью Megasphaera elsdenii.

C. Эффекты криопротекторов на жизнеспособность сублимированных M. elsdenii

[0195] Центрифугированные концентраты клеток M. elsdenii NCIMB 41125 ресуспендировали в питательной молочной смеси для грудных детей до лиофилизации, получая в результате уменьшение только на 1-log жизнеспособности клеток, когда клетки впоследствии регидратировали. Добавление 4% трегалозы и 7,5% обезжиренного молока к концентрату M. elsdenii тестировали перед медленным замораживанием при -80°C или мгновенным замораживанием в жидком азоте для определения потери клеток, встречающейся в ходе процесса начального замораживания. Как показано на ФИГ. 21, мгновенное замораживание с 4% трегалозы или 7,5% обезжиренного молока приводило к наибольшему восстановлению жизнеспособных клеток (уменьшению на 0,79 log количества жизнеспособных клеток). Продукт без добавления криопротекторов, независимо от используемого способа замораживания, терял между 2,34 и 1,95 log КОЕ/мл Megasphaera elsdenii.

ПРИМЕР 5

Эффекты условий хранения на выход и стабильность сублимированных M. elsdenii

[0196] Для определения эффекта способов сушки сублимацией и условий хранения на характеристики роста и время хранения Megasphaera elsdenii NCIMB 41125, ретентат, полученный после уменьшения объема на 90%, смешивали с 8% трегалозы/15% обезжиренного молока (T/SM) или 8% мальтодекстрина/15% обезжиренного молока (M/SM), замораживали при -80°C или в жидком азоте (LiqN) и сублимировали с использованием быстрого цикла. Затем образцы ретентата тестировали по характеристикам бактериального роста и выживаемости клеток во время хранения при 4°C или 25°C в аэробных или анаэробных условиях в течение 0, 2, 4, 8, 12, 16, 20 и 24 недель с использованием анализа кривой роста и способа распределения и рассева. Кратко, отбирали образцы продуктов после хранения, получали серийные разведения и рассевали на чашку с агаром SDL. Кроме того, среду для роста (SDL) инокулировали (1:100) регидратированными сублимированными продуктами, и оптическую плотность (OD, 600 нм) регистрировали, пока культуры не достигали стационарной фазы. Эксперимент повторяли на 3 различных суток, и все обработки проводили в трех повторах. Регидратированные сублимированные образцы разводили, чтобы получить кривые роста, поскольку без разведения, оптическая плотность превышала предел из-за присутствия обезжиренного молока. Для облегчения сравнения кривых роста, такое же разведение проводили для несублимированных образцов, используемых в качестве контроля.

[0197] РЕЗУЛЬТАТЫ: Образцы сублимировали и хранили при комнатной температуре или 4°C в аэробных или анаэробных условиях в течение 6 месяцев. Образцы, сохраняемые в аэробных условиях, независимо от обработки, быстро разрушались с дополнительной потерей клеток, по сравнению с их анаэробным эквивалентом, в диапазоне от 0,4 до 3,2 Log, после только 2 недель хранения. На основании этих результатов и для улучшения ясности фигуры, только потеря клеток, наблюдаемая в сублимированных продуктах, сохраняемых анаэробно, представлена на ФИГ. 22. Во время хранения в анаэробных условиях, образцы, сохраняемые при комнатной температуре, разрушались быстрее, чем их эквиваленты, сохраняемые при 4°C, за исключением образцов T/SM, замороженные в жидком азоте. Образцы T/SM, замороженные в жидком азоте и сохраняемые при комнатной температуре после сушки сублимацией, статистически значимо не теряли больше клеток, чем их эквивалент, сохраняемый при 4°C, на протяжении 16-недельного периода хранения (P > 0,1). Однако различия между образцами становились значимыми между хранением при комнатной температуре и 4°C после 20 недель хранения (P=0,0002), с различием 0,84 log после 20 недель и с различием 0,89 log после 24 недель хранения. Все образцы M/SM разрушались быстрее, чем их эквивалент T/SM. После 24 недель хранения (ФИГ. 23), потеря клеток в образцах T/SM, замороженных в жидком азоте и сохраняемых при 4°C в анаэробных условиях, была значимо ниже, чем при любой из других обработок (P < 0,02). Образцы T/SM, замороженные в жидком азоте и сохраняемые при 4°C в анаэробных условиях, имели потерю 2,16 log, по сравнению с концентрацией M. elsdenii, наблюдаемой до сушки сублимацией, с потерей 0,82 log в результате 24-недельного периода хранения. На каждые сутки отбора образцов, проводили эксперимент по кривой роста для сравнения характеристик роста сублимированных продуктов с несублимированным продуктом. На ФИГ. 24 показаны кривые роста, полученные для образцов, замороженных в жидком азоте, сублимированных с использованием быстрого цикла (18,5 часов при 250 мТорр (33 Па)), и сохраняемых анаэробно при 4°C или комнатной температуре. Несублимированные образцы, используемые для каждой кривой роста, являлись «свежими» (в возрасте не более 2 суток). Сублимированный продукт, сохраняемый при 4°C, имел более короткий латентный период, чем сублимированный продукт, сохраняемый при комнатной температуре, что согласуется с различием в концентрации M. elsdenii, наблюдаемой в этих образцах (Таблица 4). После 16 недель хранения образцов T/SM, независимо от температуры хранения, имел более короткий латентный период, чем образцы M/SM.

Таблица 4. Латентный период, наблюдаемый для несублимированного или регидратированного сублимированного образца, полученного из ретентата с 90% уменьшением объема, смешанного с 8% трегалозы/15% обезжиренного молока (T/SM) или 8% мальтодекстрина/15% обезжиренного молока (M/SM), замороженного в жидком азоте (LiqN) и сублимированного с использованием быстрого цикла, после 12, 16, 20 или 24 недель хранения в анаэробных условиях при 4 или 25°C

Латентный период (час) после X недель хранения 12 16 20 24 Среднее Ст. откл. Lactipro 2,50 2,75 3,75 3,75 2,69 0,72 M/SM, сохраняемый при 25°C 8,50 9,00 10,00 11,75 9,81 1,24 T/SM, сохраняемый при 25°C 6,50 6,75 7,25 8,00 7,13 0,57 M/SM, сохраняемый при 4°C 5,75 8,25 8,00 8,75 7,69 1,15 T/SM, сохраняемый при 4°C 4,25 5,25 5,00 4,75 4,81 0,37

[0198] Углы наклона кривых для несублимированных и подвергнутых обработке MSM образцов, сохраняемых при 25°C в течение 12 недель, и для подвергнутых обработке MSM образцов, сохраняемых при 20°C в течение 16 недель, являлись аномально низкими (таблица 5). После 20 и 24 недель хранения, углы наклона кривых в экспоненциальной фазе для сублимированных образцов количественно не отличались от несублимированного контроля.

Таблица 5. Углы наклона кривых в экспоненциальной фазе, наблюдаемые для несублимированного или регидратированного сублимированного образца, полученного из ретентата с 90% уменьшением объема, смешанного с 8% трегалозы/15% обезжиренного молока (T/SM) или 8% мальтодекстрина/15% обезжиренного молока (M/SM), замороженного в жидком азоте (LiqN), и сублимированного с использованием быстрого цикла, после 12, 16, 20 или 24 недель хранения в анаэробных условиях при 4 или 25°C

Углы наклона кривых в экспоненциальной фазе после X недель хранения 12 16 20 24 Среднее Ст. откл. Lactipro 0,22 0,31 0,34 0,31 0,30 0,04 M/SM, сохраняемый при 25°C 0,24 0,18 0,33 0,29 0,26 0,05 T/SM, сохраняемый при 25°C 0,31 0,30 0,34 0,32 0,32 0,02 M/SM, сохраняемый при 4°C 0,30 0,33 0,30 0,30 0,31 0,01 T/SM, сохраняемый при 4°C 0,32 0,31 0,33 0,32 0,32 0,01

ПРИМЕР 6

Обработка свежескошенного фуража с использованием M. elsdenii изменяет профиль органических кислот в кукурузном силосе

A. Способ силосования свежескошенного фуража и измерение сухого вещества, pH, VFA, молочной кислоты и уксусной кислоты в образцах

[0199] Цельную зерновую кукурузу (растительный материал), содержащую приблизительно 39% сухого вещества, жали и обрабатывали с использованием Megasphaera elsdenii или оставляли необработанной (контроль). Растительный материал помещали в четыре силосных мешка (100-125 тонн/мешок). Растительный материал обрабатывали с использованием либо 2×10⁹ КОЕ/мл клеток Megasphaera elsdenii (т.е. Megasphaera elsdenii штамм NCIMB 41125, MSBiotec®, Wamego, Kansas), вводимых со скоростью 50 мл на тонну растительного материала посредством встроенного в жатку для фуража аэрозольного аппликатора, или оставляли необработанным (контроль). Обработка с использованием M. elsdenii приводила к приблизительно 100 миллиарду колониеобразующих единиц (КОЕ) M. elsdenii на тонну свежего растительного материала. Затем силос упаковывали в силосные мешки.

[0200] После 120 суток силосования фуражный щуп (длиной 30” (76 см)) использовали для извлечения 12 образцов силоса из каждого. Образцы отбирали из 12 точек, равномерно распределенных на протяжении длины каждого мешка, помещали в саше из фольги, которые герметично закрывали с использованием вакуума и сохраняли при -20°C в морозильнике. Два подобразца отбирали из каждого саше из фольги. Первый использовали для определения содержания сухого вещества посредством взвешивания приблизительно 200 г в кювету из фольги и помещения ее в печь с принудительной вентиляцией при 105°C на 24 часа. Оставшуюся часть прессовали с использованием рычажного пресса для извлечения жидкости, и pH жидкого экстракта измеряли. Четыре мл жидкого экстракта объединяли с 1 мл раствора 25% (масс./об.) метафосфорной кислоты в 10 мл конических пробирках и замораживали для облегчения депротеинизация образцов.

[0201] Затем экстракты размораживали, гомогенизировали и центрифугировали при 14000 x g в течение 15 минут. Прозрачный супернатант переносили в хроматографические флаконы, и концентрации летучих жирных кислот (VFA) определяли с использованием газового хроматографа Agilent 7890, оборудованного пламенно-ионизационным детектором и капиллярной колонкой (Nukol, длина 15 м × диаметр 0,5 мм × толщина пленки 0,5 мкм) с использованием водорода в качестве газа-носителя.

[0202] Колориметрический способ использовали для анализа концентраций молочной кислоты в жидких экстрактах. Кратко, подготавливали стандарты молочной кислоты в концентрациях 0, 2,5, 5, 10 и 15 мг/дл. Деионизированную воду объединяли с подкисленным жидким экстрактом для получения разведения 40:1. Полученные растворы (0,5 мл) объединяли с 0,5 мл 20% CuSO₄·5H₂O, 4 мл деионизированной воды и 0,5 г Ca(OH)_2. Растворы интенсивно встряхивали и оставляли стоять в течение приблизительно 30 мин, затем центрифугировали при 1000 x g в течение 10 мин, после чего 0,5 мл супернатанта переносили в стеклянную пробирку, содержащую 0,25 мкл 4% CuSO₄·5H₂O. Три мл концентрированной серной кислоты добавляли к растворам, и растворы гомогенизировали с использованием встряхивающего смесителя, нагревали в кипящей водяной бане в течение 5 минут и затем охлаждали до ниже 20°C посредством погружения в ледяную баню. После охлаждения раствора, добавляли 50 мкл п-гидроксидифенола, пробирки встряхивали, нагревали в водяной бане при 30°C в течение 30 мин, затем возвращали в кипящую водяную баню на 1,5 минуты для выжигания избытка щелочи. Пробирки охлаждали в ледяной бане, и 30 мкл растворов переносили посредством пипетки в одну из лунок в 96-луночном планшете. Оптическую плотность определяли при длине волны 560 нм с использованием считывателя для планшетов. Значения оценивали с использованием компьютерного программного обеспечения на основании кривой регрессии, полученной из 5 стандартов.

[0203] Все данные анализировали с использованием процедуры MIXED из SAS (версии 9.2). Обработку использовали в качестве фиксированного эффекта, и повтор использовали в качестве случайного эффекта. Средние значения, полученные способом наименьших квадратов, сравнивали с использованием функции pdiff в SAS.

B. Результаты для содержания сухого вещества, pH, содержания VFA, молочной кислоты и уксусной кислоты в образцах

[0204] Кукурузный силос, полученный с использованием Megasphaera elsdenii, содержал немного меньше сухого вещества, по сравнению с контрольным силосом (38,8% против 40,3%; P<0,02) (таблица 6). Дополнительные характеристики ферментации представлены в таблице 6. pH силоса был немного ниже для обработанного с использованием Megasphaera elsdenii силоса, по сравнению с контрольным (необработанным) силосом (3,77 против 3,81; P=0,01). По сравнению с контрольным силосом, продукт, обработанный с использованием Megasphaera elsdenii, содержал более высокие концентрации пропионата (6,1 мМ против 10,0 мМ; P=0,04), изобутирата (3,6 мМ против 5,1 мМ; P<0,01) и общую концентрацию летучих жирных кислот (297,6 мМ против 359,1 мМ; P<0,001), но содержал меньше молочной кислоты (4,36 M против 4,75 M; P=0,01). Большая часть летучих жирных кислот, присутствующих в обеих силосах, состояла из уксусной кислоты, концентрация которой была больше в кукурузном силосе, обработанном с использованием Megasphaera elsdenii (342,6 мМ против 286,6 мМ; P<0,001; фигура 25).

Таблица 6. Характеристики Ферментации жидких экстрактов из силоса, обработанного с использованием Megasphaera elsdenii. Концентрации органических кислот и значения pH отражают характеристики жидких экстрактов после 120 суток силосования.

Контроль Megasphaera SEM Значение P Летучая жирная кислота, мМ Всего 297,6 359,1 17,95 <0,001 Пропионат 6,13 10,00 1,815 0,04 Изобутират 3,55 5,08 0,898 <0,01 Бутират 0,76 0,93 0,281 0,54 Лактат; М 4,75 4,36 0,14 0,01 pH 3,81 3,77 0,016 0,01 Сухое вещество, % 40,3 38,8 0,66 0,02

[0205] Кукурузный силос, обработанный с использованием Megasphaera elsdenii, имел более низкий pH и меньшую концентрацию молочной кислоты, но содержал более высокие концентрации летучих жирных кислот, по сравнению с необработанной контрольной группой. Наиболее примечательно, концентрации уксусной кислоты были больше для силосов, обработанных с использованием Megasphaera elsdenii, что могло улучшать аэробную стабильность кукурузного силоса, когда силосованный материал подвергают воздействию окружающего воздуха, и активность аэробных организмов увеличивается, потенциально портя силосованный материал (фаза откорма). Считают, что силосы с увеличенными концентрациями уксусных кислот, как правило, улучшают аэробную стабильность силоса. Обработка растительного материала с использованием Megasphaera elsdenii увеличивала концентрации уксусной кислоты на приблизительно 20%, по сравнению с необработанным контролем (ФИГ. 25), показывая, что эта обработка увеличивает аэробную стабильность обработанного силоса.

ПРИМЕР 7

Обработка восстановленного зерна кукурузы с высокой влажностью с использованием M. elsdenii изменяет характеристики ферментации, по сравнению с необработанным контролем

A. Способ силосования восстановленного зерна кукурузы с высокой влажностью и измерение содержания сухого вещества, pH, содержания VFA, молочной кислоты, уксусной кислоты и перевариваемости в образцах

[0206] Зерно кукурузы укатывали в сухом состоянии до среднего геометрического размера частиц приблизительно 3000 мкм (3 мм) и затем объединяли с водой для достижения конечного содержания влажности 32%. Экспериментальные обработки состояли из необработанного контроля (Контроль) и кукурузы, обработанной с использованием Megasphaera elsdenii штамма NCIMB 41125 (MS Biotec, Wamego, KS). Megasphaera elsdenii предварительно разводили в анаэробном разбавителе и добавляли к зерну в качестве аэрозоля, получая приблизительно 45 млн КОЕ на фунт зерна. Затем смесь гомогенизировали посредством измельчения в течение 3 минут с использованием планетарного смесителя (Univex M20, Salem, NH). Затем измельченные смеси разделяли на аликвоты по 2 фунта (0,9 кг), которые затем помещали в саше из фольги и герметично закрывали с использованием вакуума. Этот процесс повторяли четыре раза для каждой обработки. Мешки в пределах каждой обработки и повтора распределяли для продолжительности ферментации 0, 7, 14, 21 или 28 суток. Мешки для суток 0 немедленно помещали в морозильник для хранения. Остальные мешки помещали в изотермический ларь и хранили в течение соответствующих периодов силосования 7, 14, 21 или 28 суток. После силосования, мешки извлекали из ларя и помещали в морозильник.

[0207] После ферментации, pH полученных продуктов определяли посредством смешивания 25 грамм образца (на основании сухого вещества) с 70 мл дистиллированной воды. Смеси помещали в орбитальный встряхиватель при 100 об/мин на 30 минут, и затем процеживали через волокнистую бумагу. Пермеат собирали, и pH определяли с использованием откалиброванного pH-метра. 4 мл пермеата затем объединяли с 1 мл раствора 25% метафосфорной кислоты, гомогенизировали с использованием встряхивающего смесителя и замораживали. Затем образцы размораживали, гомогенизировали с использованием встряхивающего смесителя, и фракции по 2 мл жидкости переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали при 14000×g в течение 15 минут. Супернатант удаляли и помещали в хроматографические флаконы. Концентрации летучих жирных кислот, включая ацетат, пропионат, изобутират, бутират, изовалерат, валерат, изокапроат, капроат и гептаноат, определяли посредством газовой хроматографии с использованием с использованием газового хроматографа Agilent 7890, оборудованного пламенно-ионизационным детектором и капиллярной колонкой Nukol (длина 15 м × диаметр 0,53 мм × толщина пленки 0,50 мкм). Образцы измеряли в двух повторах.

[0208] Колориметрические лабораторные анализы использовали для определения концентрации молочной кислоты в экстрактах кукурузы. Подготавливали стандарты молочной кислоты в концентрациях 0, 2,5, 5, 10 и 15 мг/дл. Фильтрованный, подкисленный и центрифугированный пермеат разводили посредством объединения 20 частей дистиллированной воды с 1 частью пермеата, и гомогенизации с использованием встряхивающего смесителя. Разведенный образец (0,5 мл) смешивали с 4 мл деионизированной воды, 0,5 г гидроксида кальция и 0,5 мл раствора 20% сульфата меди. Смеси центрифугировали в течение 10 минут при 1000×g. Полученный супернатант (0,5 мл) смешивали с 25 мкл раствора 4% сульфата меди и 3 мл серной кислоты, перемешивали, и немедленно помещали в кипящую водяную баню на 5 минут. Затем образцы помещали в ледяную баню и охлаждали до комнатной температуры. Пятьдесят (50) мкл п-гидроксидифенила добавляли в раствор, смеси гомогенизировали с использованием встряхивающего смесителя и затем помещали в баню при 86°F (30°C) на 30 минут. Затем образцы помещали в кипящую водяную баню и через 90 секунд извлекали из бани и позволяли охладиться до комнатной температуры. Двести (200) мкл раствора помещали в лунку 96-луночного планшета, и оптическую плотность считывали при 560 нм с использованием считывателя для планшетов. Образцы анализировали в четырех повторах.

[0209] Перевариваемость кукурузы, обработанной с использованием Megasphaera elsdenii, оценивали с использованием системы культуры in vitro. Рубцовый сок собирали от канюлированных быков джерсийских смешанных пород, содержавшихся в Kansas State University Beef Cattle Research Center. Рубцовый сок процеживали через марлю, выливали в делительную воронку, барботировали газом азотом, и помещали в инкубатор при 102°F (39°C) на приблизительно 45 минут для обеспечения разделения на слои. Нижний слой отбрасывали, и средний слой собирали и использовали в качестве инокулята микрорганизмов для анализов in vitro. По десять (10) мл фильтрованного рубцового сока добавляли в культуральные бутыли, содержащие 140 мл буфера Мак-Дугалла и 3 грамм зерна (на основании сухого вещества). Содержимое барботировали азотом, бутыли закрывали с использованием чувствительных к давлению модулей ANKOM (ANKOM RF Gas Production System, Macedon, NY), помещали в инкубатор с орбитальной платформой при 102°F (39°C) и встряхивали непрерывно в течение 16 часов. По окончанию цикла инкубации, бутыли извлекали из встряхивателя, и pH измеряли с использованием откалиброванного pH-метра. Четыре (4) мл жидкого слоя переносили в флаконы, смешивали с 1 мл раствора 25% метафосфорной кислоты, гомогенизировали с использованием встряхивающего смесителя и затем помещали в морозильник. Оставшееся содержимое каждой бутыли опустошали в плоскую алюминиевую кювету и сушили при 221°F (105°C) в течение 48 часов. Массу высушенной массы регистрировали, и исчезновение сухого вещества определяли для каждой культуры. Профили органических кислот определяли для каждой культуры посредством газовой хроматографии с использованием способов, описанных ранее для экстрактов зерна.

B. Результаты для содержания сухого вещества, pH, содержания VFA, молочной кислоты и уксусной кислоты в образцах

[0210] Изменения pH зерна в ходе 28-суточного периода силосования показаны на ФИГ. 26. Обработка зерна с использованием Megasphaera elsdenii приводила к более быстрому уменьшению pH от суток 0 до 7, по сравнению с контрольным (необработанным) зерном (P < 0,01), и различия pH сохранялись на 14, 21 и 28 сутки силосования (Эффект обработки; эффект времени; и взаимосвязь между обработкой и сутками силосования; P < 0,01). Профили органических кислот для зерна обобщены в таблице 7. По сравнению с контрольным зерном, общие концентрации летучих жирных кислот были выше для восстановленного зерна, обработанного с использованием Megasphaera elsdenii, на 7 и 14 сутки силосования (P < 0,05), но не отличались после этого (P > 0,50). Концентрации уксусной кислоты и пропионовой кислоты являлись сходными для зерна, силосованного в присутствии и в отсутствие обработки Megasphaera elsdenii (P > 0,10). Концентрации изовалериановой, валериановой, изокапроновой, капроновой и гептановой кислот, как правило, были выше для зерна, обработанного с использованием Megasphaera elsdenii, по сравнению с контролем (P < 0,05), но концентрации молочной кислоты являлись сходными для зерна в присутствии или в отсутствие обработки Megasphaera elsdenii (P > 0,10).

Таблица 7. Концентрации органических кислот в жидких экстрактах из восстановленного зерна кукурузы с высокой влажностью, обработанного с использованием Megasphaera elsdenii, или необработанной контрольной группы. ‡ = Стандартная ошибка среднего. § = вероятность эффекта обработки (P < 0,05). M=Эффект обработки. D=Эффект суток силосования. I=Взаимосвязь между обработкой и сутками силосования.

Сутки силосования Органическая кислота, мМ 0 7 14 21 28 SEM ‡ Значение P § Общие концентрации летучих жирных кислот Контроль 14,2 34,3 40,9 55,3 60,0 10,2 M, D Megasphaera 18,2 59,0 59,4 59,0 56,7 Уксусная кислота Контроль 8,3 28,1 34,6 43,5 48,6 7,5 D Megasphaera 11,9 42,1 41,9 42,3 43,7 Пропионовая кислота Контроль 0,6 0,6 0,0 2,6 2,1 1,0 - Megasphaera 0,5 0,0 1,3 0,0 1,6 Масляная кислота Контроль 0,0 0,0 0,0 0,4 1,4 0,3 D Megasphaera 0,0 0,0 0,0 0,0 0,4 0,4 Изомасляная кислота Контроль nd nd nd nd nd - - Megasphaera nd nd nd nd nd - - Валериановая кислота Контроль 0,0 2,5 2,9 3,6 3,3 1,2 M, D Megasphaera 0,0 8,0 7,5 8,6 5,2 Изовалериановая кислота Контроль 0,0 0,9 0,8 1,9 1,5 0,9 M, D Megasphaera 0 3,1 2,9 2,0 1,6 Капроновая кислота Контроль 0,0 0,9 0,8 1,0 1,0 0,6 M, D Megasphaera 0,0 2,4 2,3 1,6 1,4 Изокапроновая кислота Контроль 0,0 0,0 0,0 0,3 0,0 0,4 M Megasphaera 0,0 0,5 0,5 1,3 0,5 Гептановая кислота Контроль 5,3 1,4 1,8 2,0 2,1 0,5 M, D Megasphaera 5,9 2,9 2,9 3,1 2,4 Молочная кислота Контроль 1,1 39,8 50,9 52,4 57,5 5,4 D Megasphaera 1,1 42,2 49,7 48,4 51,7

[0211] Изменения содержания сухого вещества in vitro обобщены для обработанной Megasphaera elsdenii кукурузы и необработанной кукурузы на ФИГ. 27. Обработка кукурузы с использованием Megasphaera elsdenii не изменяла чувствительности зерна кукурузы к расщеплению микроорганизмами, по сравнению с необработанным контрольным зерном. Уменьшение содержания сухого вещества в культурах, как правило, увеличивалось в зависимости от суток силосования, но не присутствовало очевидной взаимосвязи между сутками силосования и обработкой кукурузы с использованием Megasphaera elsdenii.

[0212] Этот пример показывает, что обработка зерна с высокой влажностью с использованием Megasphaera elsdenii изменяет характеристики ферментации силосованного зерна, по сравнению с контрольным (необработанным) зерном. Этот способ составляет путь для ускорения активности ферментации в восстановленном зерне с высокой влажностью.

ПРИМЕР 8

Обработка с использованием M. elsdenii кукурузного силоса, которым откармливают скот, улучшает стоимость туши, по сравнению с необработанным контролем

A. Способ откорма скота, состав корма и сбор туш

[0213] Быков смешанных пород (336 голов; 633±14,1 ф (287,1±6,4 кг)) использовали в исследовании подготовки к откорму для оценки влияния Megasphaera elsdenii в качестве обработки силоса на эффективность роста. Приблизительно через 24 часа после прибытия в Beef Cattle Research Center, быков вакцинировали с использованием Bovishield Gold 5 и Ultrabac 7/Somnubac (Zoetis Animal Health, Florham Park, NJ), обрабатывали с использованием жидкого наружного средства против эктопаразитов (StandGuard, Elanco Animal Health, Greenfield, IN), идентифицировали с использованием пронумерованных ушных бирок, имплантировали картриджи Component TE-200 с тиланом (Elanco Animal Health) и взвешивали.

[0214] Быков стратифицировали по исходной массе и распределяли, внутри страты, по 28 загонам для откорма скота с 14 головами на загон и 14 загонами на обработку. Обработки состояли из рационов для подготовки к откорму (таблица 8), полученных из необработанного кукурузного силоса (Контроль) или кукурузного силоса, обработанного с использованием 1 миллиарда колониеобразующих единиц Megasphaera elsdenii (штамм NCIMB 41125; MS Biotec, Wamego, KS) на тонну свежего фуражного материала. Быкам предоставляли неограниченный доступ к корму один раз в сутки в течение 112 суток.

Таблица 8. Состав рационов для подготовки к откорму и завершающего откорма. ¹Влажный кукурузный глютеновый корм, Cargill Starches & Sweeteners North America; Minneapolis, MN. ²Megasphaera elsdenii штамм NCIMB 41125 вводили в фураж в жатке с использованием встроенного аэрозольного аппликатора со скоростью 50 мл свежей культуры на тонну свежескошенного фуражного материала. Инокулянт обеспечивал 100 миллиардов колониеобразующих единиц на тонну фуража. Инокулянта микроорганизмов не использовали для получения контрольного кукурузного силоса. ³Содержала соевый жмых, известняк, соль, микроэлементы, витамины и предварительные смеси пищевых добавок, и обеспечивала (на основании общей DM рациона) 0,25% соли, 0,15 м.д. кобальта, 10 м.д. меди, 0,50 м.д. иода, 20 м.д. марганца, 0,10 м.д. селена, 30 м.д. цинка, 1000 МЕ/ф витамина A, 10 МЕ/ф витамина E и 30 грамм/тонну румензина (Elanco Animal Health). ⁴Содержала известняк, соль, мочевину, микроэлементы, витамины и предварительные смеси пищевых добавок и обеспечивала (на основании общей DM рациона) 0,25% соли, 0,15 м.д. кобальта, 10 м.д. меди, 0,50 м.д. иода, 20 м.д. марганца, 0,10 м.д. селена, 30 м.д. цинка, 1000 МЕ/ф витамина A, 10 МЕ/ф витамина E и 30 грамм/тонн румензина (Elanco Animal Health). Фосфат тилозина (тилан, Elanco Animal Health) вводили в корм в соотношении 0 или 8 грамм/тонну во время фазы завершающего откорма (одинаково распределяя среди обработок в фазе подготовки к откорму). Гидрохлорид рактопамина (Optaflexx, Elanco Animal Health) вводили в корм в соотношении 24 грамм/тонну в течение последних 34 суток перед сбором.

Фаза подготовки к откорму Фаза завершающего откорма Контроль Megasphaera Ингредиент, % сухого вещества Плющенное под паром зерно кукурузы - - 57,68 Сладкие отруби¹ - - 30,00 Контрольный кукурузный силос (без инокулянта) 57,21 - - Кукурузный силос, инокулированный Megasphaera elsdenii - 57,21 - Люцерновое сено 38,36 38,36 10,00 Добавка³ 4,43 4,43 - Добавка⁴ - - 2,32 Состав питательных веществ (на основании DM) Общий белок, % 12,50 12,50 13,30 Полезная энергия для поддержания массы, Мкал/cwt 66 66 0,97 Полезная энергия для прироста массы, Мкал/cwt 40 40 0,66 Нейтрально-детергентная клетчатка, % 39,1 39,1 19,06 Кальций, % 0,65 0,65 0,66 Фосфор, % 0,27 0,27 0,49

[0215] В конце фазы подготовки к откорму, скот взвешивали, повторно имплантировали картриджи Component TE-200 с тиланом и переводили на общий рацион для завершающего откорма (таблица 8). Скоту предоставляли неограниченный доступ к корму один раз в сутки в течение всего 115 суток во время фазы завершающего откорма. В конце фазы завершающего откорма, загоны взвешивали и быков транспортировали в коммерческую скотобойню, где данные о массе парной туши и встречаемости абсцесса печени получали на сутки сбора.

[0216] Площадь спинной мякоти, толщину хребтового жира у 12^го ребра, показатель мраморности, и показатели качества и выхода по USDA собирали после 36 часов охлаждения. Конечную живую массу рассчитывали как массу парной туши, деленную на обычный выход мясной туши после разделки 63%, и средний ежесуточный прирост и эффективность использования кормов рассчитывали с использованием живой массы с коррекцией на убойную массу. Стоимость туши определяли с использованием стандартизованной сетки, сконструированной с использованием 10-летних средних значений базовой цены и премий, и скидок для туши, как опубликовано USDA (за январь 2008 - январь 2018).

[0217] Данные анализировали в SAS версии 9.2 (SAS Inst. Inc., Cary, NC) с использованием процедуры MIXED для непрерывных данных и процедуры GLIMMIX для категориальных данных. Обработка для подготовки к откорму представляла собой фиксированный эффект, блок представлял собой случайный эффект и загон представлял собой экспериментальную единицу.

B. Результаты для роста скота и потребления корма, и характеристики туши

[0218] Эффективность во время фаз подготовки к откорму и завершающего откорма скота обобщены в таблице 9. Средний ежесуточный прирост, потребление сухого вещества и соотношение корм:прирост во время фаз выращивания и завершающего откорма, являлись сходными для скота, откармливаемого с использованием рационов для подготовки к откорму, содержащих кукурузные силосы в присутствии и в отсутствие инокулянта (P > 0,10).

Таблица 9. Эффективность подготовки к откорму и завершающего откорма быков, откармливаемых с использованием кукурузного силоса, в присутствие или в отсутствие Megasphaera elsdenii в качестве обработки силоса, во время фазы подготовки к откорму (до загона для завершающего откорма). Megasphaera elsdenii штамм NCIMB 41125 вводили в жатке с использованием встроенного аэрозольного аппликатора со скоростью 50 мл свежей культуры на тонну свежего фуражного материала. Инокулянт обеспечивал 100 миллиардов колониеобразующих единиц на тонну фуража. При контрольной обработке силоса не вводили инокулянта. ^¥Стандартная ошибка среднего. ^‡Конечная масса, рассчитанная как масса парной туши, деленная на стандартизированный выход мясной туши после разделки 63%.

Контроль Megasphaera SEM^¥ Значение P Эффективность подготовки к откорму Исходная масса, ф 635 632 1,4 0,10 Конечная масса, ф 1010 1005 17,7 0,83 Средний ежесуточный прирост, ф 3,39 3,40 0,028 0,71 Потребление сухого вещества, ф/сутки 19,14 19,51 0,411 0,28 Корм:прирост 5,65 5,73 0,092 0,36 Эффективность завершающего откорма Конечная масса с коррекцией на убойную массу, ф‡ 1361 1377 16,9 0,35 Средний ежесуточный прирост с коррекцией на убойную массу, ф‡ 3,05 3,24 0,132 0,16 Потребление сухого вещества, ф/сутки 23,72 23,99 0,370 0,48 Корм:прирост с коррекцией на убойную массу‡ 8,03 7,50 0,359 0,16

[0219] Характеристики туши представлены в таблице 10. Индивидуальные показатели характеристик туши являлись сходными для двух обработок (P > 0,10); однако, кумулятивное воздействие незначимых изменений характеристик туши проявляло тенденцию (P < 0,07) к увеличению общей стоимости туши для скота, откармливаемого силосом, инокулированным Megasphaera elsdenii, по сравнению со скотом, откармливаемым необработанным силосом ($1628,68 против $1597,98) (ФИГ. 28). Это различие было в большой степени обусловлено незначимыми, но значительными увеличениями массы туши для группы силоса с Megasphaera elsdenii, так же как меньшими различиями в показателях качества туши и выхода. Авторы настоящего изобретения считают, что эти различия фактически проявлялись во время фазы подготовки к откорму, но были, вероятно, замаскированы различиями в заполнении желудочно-кишечного тракта. Таким образом, этот эксперимент показывает, что кормление скота силосом, обработанным с использованием Megasphaera elsdenii, увеличивает общую стоимость туши.

Таблица 10. Характеристики туши быков, откармливаемых кукурузным силосом, в присутствии или в отсутствие Megasphaera elsdenii в качестве инокулянта силоса, во время фазы подготовки к откорму (до загона для завершающего откорма). ^†Megasphaera elsdenii штамм NCIMB 41125 вводили в жатке с использованием встроенного аэрозольного аппликатора со скоростью 50 мл свежей культуры на тонну свежего фуражного материала. Инокулянт обеспечивал 100 миллиардов колониеобразующих единиц на тонну фуража. При контрольной обработке силоса не вводили инокулянта. ^¥Стандартная ошибка среднего. ^‡Показатель мраморности, определенный посредством компьютерной системы для визуализации (VBG 2000, E+V Technology GmbH & Co. KG, Oranienburg, Germany). Небольшой (400-499). ^§Состоит из туш, ранжированных по стандарту USDA или коммерческих.

Контроль Megasphaera SEM^¥ Значение P Масса парной туши, ф 857 868 9,1 0,23 Толщина хребтового жира у 12^го ребра, дюйм 0,53 0,53 0,019 0,94 Площадь спинной мякоти, дюйм² 14,28 14,36 0,200 0,69 Показатель мраморности^‡ 407 409 7 0,78 Показатель качества USDA, % Градация «Choice» 50,6 57,3 5,43 0,21 Градация «Select» 48,2 42,1 5,42 0,26 Градация ниже «Select»^§ 1,2 0,6 0,85 0,15 Общий показатель выхода USDA, % 2,42 2,44 0,090 0,86 Показатель выхода 1, % 10,4 12,4 6,71 0,77 Показатель выхода 2, % 46,3 38,7 8,60 0,38 Показатель выхода 3, % 34,7 42,2 7,96 0,34 Показатель выхода 4, % 8,0 6,0 2,91 0,50 Показатель выхода 5, % 0,6 0,7 0,85 0,99 Абсцесс печени, % 12,7 16,7 5,20 0,44

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения силосованных растительных материалов с использованием анаэробной бактерии Megasphaera elsdenii и к полученным таким образом силосованным растительным материалам, включающему введение эффективного количества клеток M. elsdenii NCIMB 41125 в растительный материал и силосование растительного материала. Способ позволяет получить растительный материал с улучшенной аэробной стабильностью. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 28 ил., 10 табл.

1. Способ получения силосованного растительного материала с улучшенной аэробной стабильностью, включающий:

(a) введение эффективного количества клеток M. elsdenii NCIMB 41125 в растительный материал, и

(b) силосование растительного материала для получения силосованного растительного материала.

2. Способ по п.1, где улучшенная аэробная стабильность включает сниженный pH.

3. Способ получения увеличенного количества силосованного растительного материала, включающий:

(a) введение эффективного количества клеток M. elsdenii NCIMB 41125 в растительный материал, и

(b) силосование растительного материала для получения силосованного растительного материала.

4. Способ по любому из пп.1-3, дополнительно включающий введение добавки в растительный материал.

5. Способ по п.4, где введение проводят до сбора растительного материала, после сбора растительного материала, во время силосования или в их комбинации.

6. Способ по п.4 или 5, где добавку выбирают из группы, состоящей из: другого микроорганизма, фермента, поддающегося ферментации субстрата, кислоты, консерванта, питательного вещества и их комбинаций.

7. Способ по любому из пп.1-6, где растительный материал выбирают из группы, состоящей из: фуража, сельскохозяйственной культуры, травы, бобовых, зерна, фруктов, овощей или их комбинаций.

8. Способ по п.7, где растительный материал представляет собой кукурузу, люцерну, пшеницу, рожь, ячмень, овес, тритикале, просо, клевер, сорго или их комбинации.

9. Способ по любому из пп.1-8, включающий введение клеток M. elsdenii NCIMB 41125 в жидкости.

10. Способ по любому из пп.1-9, где способ дополнительно включает смешивание сублимированных клеток M. elsdenii NCIMB 41125 с жидкостью до введения клеток.

11. Способ по любому из пп.1-8, включающий введение клеток M. elsdenii NCIMB 41125 в форме сублимированных клеток.

12. Способ по п.11, где сублимированные клетки являются инкапсулированными.

13. Способ по п.11, где сухой носитель содержит сублимированные клетки.

14. Способ по любому из пп.1-13, включающий введение по меньшей мере от приблизительно 10⁶ до приблизительно 10¹⁴ КОЕ клеток M. elsdenii NCIMB 41125 на тонну растительного материала.