СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНА Российский патент 2009 года по МПК A61K39/395 C07K16/06 

Изобретение относится к медицине, а именно к получению иммуноглобулинов - белков плазмы крови, которые принимают участие в иммунных реакциях, и может быть использовано при производстве лекарственных препаратов.

При производстве иммуноглобулинов большое значение уделяется стабильности и безопасности полученной лекарственной формы. Как правило, фракцию, содержащую иммуноглобулин G, получают методом спиртового фракционирования по Коном разными концентрациями этилового спирта при определенных электролитических показателях раствора соответствующей технологической стадии. Получение иммуноглобулина путем фракционирования этиловым спиртом с последующей очисткой раскрыто в патентах RU, 2199343 (кл. А61К, 39/395, опубл. 27.02.2003) [1], RU, 2261112 (кл. А61К 39/395, опубл. 27.09.2005) [2] и других.

Наиболее близким является способ получения иммуноглобулина, включающий фракционирование этиловым спиртом донорской плазмы с получением осадка Б и очистку выделенного иммуноглобулина [2]. Фракционирование этиловым спиртом проводят до выделения осадка Б, причем экстракцию спиртового осадка Б проводят в двенадцатикратном объеме дистиллированной воды, а при очистке добавляют хлорид натрия до конечной концентрации 0,9%, устанавливают рН от 4,0 до 5,0, потом добавляют хлороформ до 3,0% мас., выдерживают смесь в течение 14 часов при 0…3°С и центрифугируют. После центрифугирования осадок удаляют, проводят осветляющую фильтрацию. Для осаждения иммуноглобулина к фильтрату добавляют 50%-ный раствор полиэтиленгликоля до конечной концентрации 12 или 26% этилового спирта, осадок после центрифугирования растворяют в 0,3 М глицине, доводят до рН 4,6 и осуществляют осветляющую и стерилизующую фильтрации.

Недостатком известного способа является низкий уровень удаления/инактивации вирусов при проведении отмеченной обработки, который оставляет его вирусоопасным. В связи с этим известный способ предусматривает проведение дополнительной инактивации вирусов при комнатной температуре путем выдержки в течение 20…25 дней, что отрицательно влияет на стабильность готового препарата.

Задачей изобретения является усовершенствование способа получения иммуноглобулина, в котором за счет предложенного фракционирования и очистки обеспечивается высокая степень очистки иммуноглобулина при повышенной эффективности удаления/инактивации вирусов, что обеспечивает вирусобезопасность иммуноглобулина для лекарственных препаратов и стабильность готового препарата. Это позволяет повысить срок хранения лекарственной формы до 3-х лет. Предложенный способ является технологичным и легко контролируется.

Поставленная задача решается предложенным способом получения иммуноглобулина, который включает фракционирование этиловым спиртом донорской плазмы с получением осадка Б и очистку выделенного иммуноглобулина, в котором фракционирование проводят до выделения осадка В, а при очистке выделенный иммуноглобулин в виде раствора осадка В обрабатывают сольвент-детергентной смесью, обработанный иммуноглобулин иммобилизируют и промывают на сульфопропилкатионитном сорбенте с помощью колоночной хроматографии с последующей элюцией, и проводят ультрафильтрацию и стерилизующую фильтрацию.

Выделение осадка В проводят фракционированием, которое осуществляют таким образом. Осадок Б растворяют в 0,9%-ном растворе натрия хлорида при рН 5,15. Растворенный осадок Б смешивают с 2М ацетатным буферным раствором и 53%-ным этиловым спиртом с последующим центрифугированием при температуре минус (3…5)°С. Полученный центрифугат смешивают с гидрокарбонатом натрия при рН раствора 5,5 с последующим центрифугированием при температуре минус (3…5)°С. Далее полученный центрифугат осветляют, например, фильтрацией, осветленный центрифугат смешивают с ацетатным буферным раствором при рН 5,4, 96%-ным (об/об) этиловым спиртом и бикарбонатом натрия при рН 7,2 с последующим центрифугированием при температуре минус (10…12)°С.

При обработке иммуноглобулина в виде раствора осадка В в качестве сольвент-детергентной смеси используют 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, содержащий 1% мас. три-н-бутилфосфата и 1% мас. полисорбата 80. Обработку проводят путем перемешивания смеси в течение 12…16 часов с последующим разбавлением 0,05 М ацетатным буферным раствором при рН 5,5, содержащим 1% мас. октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л. Для иммобилизации иммуноглобулина используют сульфопропилкатионитный сорбент, имеющий размер зерен 50 мкм, и сорбционную емкость 55 мг/см³.

Обработанный иммуноглобулин, иммобилизированный на сульфопропилкатионитном сорбенте, промывают в две стадии, причем на первой стадии используют 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, содержащий 1% мас. октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л, а на второй стадии используют 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5. На первой стадии промывание проводят объемом, соответствующим 5-ти объемам сорбента, а на второй стадии промывание проводят объемом, соответствующим трем объемам сорбента. Промывание ведут со скоростью 3 см/мин.

Элюцию осуществляют 0,05 М ацетатным буферным раствором при рН 5,5, содержащим 0,2 М хлорида натрия.

Экспериментально было установлено, что выделение иммуноглобулина спиртовым фракционированием до осадка В, обработка выделенного полуфабриката сольвент-детергентной смесью с последующей его иммобилизацией и промывкой на сульфопропилкатионитном сорбенте позволили максимально и без разрушения выделить иммуноглобулин G, очистить его от примесей, эффективно удалить вирусы при их наличии и получить лекарственную форму повышенной стабильности.

Способ осуществляется таким образом.

Донорскую плазму подвергают фракционированию этиловым спиртом до выделения осадка В. Фракционирование проводят таким образом.

Донорскую плазму смешивают с 96%-ным (об./об.) этиловым спиртом и центрифугируют при температуре минус 3°С. Полученный центрифугат смешивают с 96%-ным (об./об.) этиловым спиртом и центрифугируют при температуре минус (10…12)°С. Получают осадок А. Осадок А растворяют в 5%-ном этиловом спирте, содержащем 0,9% мас. натрия хлорида, перемешивают и центрифугируют при температуре минус 8°С. Получают осадок Б. Осадок Б растворяют в 0,9%-ном растворе натрия хлорида при рН 5,15, смешивают с 2 М ацетатным буферным раствором и 53%-ным этиловым спиртом и центрифугируют при температуре минус (3…5)°С. Полученный центрифугат смешивают с гидрокарбонатом натрия при рН раствора 5,5 и центрифугируют при температуре минус (3…5)°С. Полученный центрифугат осветляют фильтрацией и смешивают с ацетатным буферным раствором при рН 5,4, 96%-ным (об./об.) этиловым спиртом и бикарбонатом натрия при рН 7,2. Полученную смесь центрифугируют при температуре минус (10…12)°С. Получают осадок В.

Выделенный иммуноглобулин подвергают очистке. Для этого осадок В растворяют в ацетатном буферном растворе. Раствор осадка В обрабатывают сольвент-детергентной смесью. В качестве сольвента используют, например, 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, содержащий 1% мас. три-н-бутилфосфата и 1% мас. полисорбата 80. Смесь осадка В, сольвента и детергента перемешивают в течение 12…16 часов при температуре 25°С. Далее разбавляют 0,05 М ацетатным буферным раствором при рН 5,5, содержащим 1% мас. октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л. Обработанный таким образом иммуноглобулин с помощью колоночной хроматографии при линейной скорости элюента 1 см/мин иммобилизируют на сульфопропилкатионитном сорбенте, имеющем сорбционную емкость 55 мг/см³ и зерна размером 50 мкм. После завершения сорбции осуществляют промывание на сульфопропилкатионитном сорбенте при линейной скорости элюента 3 см/мин. Промывание лучше осуществлять в две стадии, при этом на первой стадии используют ацетатный буферный раствор того же состава, что и для разбавления смеси: 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, содержащий 1% мас. октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л. Промывание проводят объемом, соответствующим 5-ти объемам сорбента. На второй стадии промывания используют 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, и промывание проводят объемом, соответствующим трем объемам сорбента. Элюцию иммуноглобулина осуществляют 0,05 М ацетатным буферным раствором при рН 5,5, содержащим 0,2 М хлорида натрия. Элюат содержит иммуноглобулин G в концентрации 3,5…4%. Далее проводят ультрафильтрацию и стерилизующую фильтрацию.

Ниже приведены примеры, которые демонстрируют способ получения иммуноглобулина.

Пример 1

150 л донорской плазмы крови подают в реактор. Добавляют 96%-ный (об./об.) этиловый спирт в количестве 13,8 л. Смесь перемешивают при температуре минус 2°С в течение часа и центрифугируют при температуре минус 3°С. Полученный центрифугат объемом 162 л подают в реактор, добавляют 26 л 96%-ного (об./об.) этилового спирта. Смесь перемешивают при температуре минус 9°С в течение 2 часов и центрифугируют при температуре минус 12°С. Получают 7,2 кг осадка А, который растворяют в 159 л 5%-ного этилового спирта, который содержит 0,9% мас. натрия хлорида. Раствор осадка А подают в реактор, перемешивают при температуре минус 9°С в течение 5 часов и центрифугируют при температуре минус 8°С. Получают 72 кг осадка Б, который растворяют в 81 л 0,9%-ного натрия хлорида при температуре 0°С в реакторе при рН 5,15, добавляют 970 л 2 М ацетатного буферного раствора, перемешивают в течение 3-х часов. Далее добавляют 31 л 53%-ного этилового спирта, перемешивают в реакторе при температуре минус 9°С в течение трех часов и центрифугируют при температуре минус 5°С. Получают 125 л центрифугата Б₁. Центрифугат Б₁ подают в реактор, добавляют 260 мл 1 М гидрокарбоната натрия при рН раствора 5,5, перемешивают смесь в течение 2 часов при температуре минус 4°С и центрифугируют при температуре минус 5°С.

Полученный центрифугат объемом 120 л осветляют фильтрацией. К осветленному центрифугату в реакторе добавляют 200 мл ацетатного буферного раствора при рН 5,4 и температуре минус 4°С, перемешивают и добавляют 23 л 96%-ного (об./об.) этилового спирта, перемешивают в течение часа, добавляют 730 мл 2 М бикарбоната натрия, раствор при рН 7,2 перемешивают в течение 3-х часов и центрифугируют при температуре минус 12°С. Получают 1800 г осадка В.

Для проверки эффективности удаления вирусов при реализации предложенного способа использовали модельные вирусы вирусной диареи ВРХ (BVDV), которые были внесены в разбавленный после элюции раствор фермента в количестве 2,5 log₁₀ ТЦЛД₅₀/см³ вируса BVDV.

Согласно требованиям GMP преднамеренное внесение любого вируса в производственные помещения не допускается. Потому валидация проводилась в отдельной лаборатории, оборудованной соответствующим образом, с использованием модели производственного процесса.

1800 г осадка В растворили в 9 л 0,05 М ацетатного буферного раствора при рН 5,5 и температуре 4°С и подавали в реактор. К реактору с помощью вакуума подают 9 л сольвент-детергентной смеси: 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, содержащий 1% мас. три-н-бутилфосфата и 1% мас. полисорбата 80. Смесь перемешивают при температуре 25°С в течение 12 часов при скорости вращения мешалки 80 об/мин. Далее к реактору с помощью вакуума подают 54 л раствора, который содержит: 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, 1% мас. октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л. Смесь перемешивают и пропускают через предварительно уравновешенную хроматографическую колонну диаметром 400 мм, содержащую 23 л сульфопропилкатионитного сорбента, при объемной скорости потока 1200 мл/мин (линейная скорость элюента - 1 см/мин). Сорбцию проводят около 10 часов. Иммобилизированный на сульфопропилкатионитном сорбенте предварительно обработанный иммуноглобулин подвергают промыванию в две стадии. Для этого через колонну пропускают 110 л 0,05 М ацетатного буферного раствора при рН 5,5, содержжащего 1% мас. октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л. Раствор пропускают при объемной скорости 3600 мл/мин (соответствует линейной скорости - 3 см/мин) в течение 30 минут. Потом промывают 70 л 0,05 М ацетатного буферного раствора при рН 5,5 в течение 20 минут.

Элюцию иммуноглобулина осуществляли 0,05 М ацетатным буферным раствором при рН 5,5, содержащим 0,2 М хлорида натрия. Процесс элюции длился около 60 минут. Элюат в количестве 34 л собирали в стерильные 20-ти л стеклянные баллоны и проводили ультрафильтрацию.

Титр вирусов после инактивации показал отсутствие вирусов.

Выход целевого продукта - 98%. Фракционный состав полученного полуфабриката - сумма мономера и димера иммуноглобулина - 96%, агрегаты - менее 1%. Специфическая биологическая активность отвечает требованиям Европейской Фармакопеи. Чистота (метод электрофореза на ацетатно-целлюлозных пленках) - более 99%. Примеси иммуноглобулинов А и М не обнаружены. Полученный продукт обладает низкой активностью активатора прекалакреина и минимальным содержанием анти-А и анти-Б гемаглютининов, что свидетельствует о его безвредности.

Титр инфекционности вируса BVDV после инактивации показал отсутствие инфекционности.

Пример 2

250 л донорской плазмы крови подают в реактор. Добавляют 96%-ный (об./об.) этиловый спирт в количестве 23 л. Смесь перемешивают при температуре минус 3°С в течение часа и центрифугируют при температуре минус 5°С. Полученный центрифугат объемом 270 л подают в реактор, добавляют 42 л 96%-ного (об./об.) этилового спирта. Смесь перемешивают при температуре минус 9°С в течение 2 часов и центрифугируют при температуре минус 10°С. Получают 12 кг осадка А, который растворяют в 295 л 5%-ного этилового спирта, содержащего 0,9% мас. натрия хлорида. Раствор осадка А подают в реактор, перемешивают при температуре минус 9°С в течение 5 часов и центрифугируют при температуре минус 9°С. Получают 72 кг осадка Б, который растворяют в 134 л 0,9%-ного натрия хлорида при температуре 1°С в реакторе при рН 5,15, добавляют 1600 л 2 М ацетатного буферного раствора, перемешивают в течение 3-х часов. Далее добавляют 52 л 53%-ного этилового спирта, перемешивают в реакторе при температуре минус 9°С в течение трех часов и центрифугируют при температуре минус 3°С. Получают 210 л центрифугата Б₁. Центрифугат Б₁ подают в реактор, добавляют 420 мл 1 М гидрокарбоната натрия при рН раствора 5,5, перемешивают смесь в течение 2 часов при температуре минус 3°С и центрифугируют при температуре минус 3°С. Полученный центрифугат объемом 200 л осветляют фильтрацией. К осветленному центрифугату в реакторе добавляют 1000 мл ацетатного буферного раствора при рН 5,2 и температуре минус 5°С, перемешивают, и добавляют 37 л 96%-ного (об./об.) этилового спирта, перемешивают на протяжении часа, добавляют 1200 мл 2 М бикарбоната натрия, раствор при рН 7,2 перемешивают в течение 3-х часов и центрифугируют при температуре минус 10°С. Получают 3000 г осадка В.

3000 г осадка В растворили в 15 л 0,05 М ацетатного буферного раствора при рН 5,5 и температуре 4°С и подали в реактор. К реактору с помощью вакуума подают 15 л сольвент-детергентной смеси: 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, содержащий 1% мас. три-н-бутилфосфата и 1% мас. полисорбата 80. Смесь перемешивают при температуре 25°С в течение 12 часов при скорости вращения мешалки 80 об/мин. Дальше к реактору с помощью вакуума подают 90 л раствора, который содержит: 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, 1% мас. октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л. Смесь перемешивают и пропускают через предварительно уравновешенную хроматографическую колонну диаметром 400 мм, содержащую 23 л сульфопропилкатионитного сорбента, при объемной скорости потока 1200 мл/мин (линейная скорость элюента - 1 см/мин). Сорбцию проводят около 10 часов. Иммобилизированный на сульфопропилкатионитном сорбенте предварительно обработанный иммуноглобулин подвергают промыванию в две стадии. Для этого через колонну пропускают 110 л 0,05 М ацетатного буферного раствора при рН 5,5, содержащего 1% мас. октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л. Раствор пропускают при объемной скорости 3600 мл/мин (соответствует линейной скорости - 3 см/мин) в течение 37 минут. Потом промывают 70 л 0,05 М ацетатного буферного раствора при рН 5,5 в течение 23 минут.

Элюцию иммуноглобулина осуществляли 0,05 М ацетатным буферным раствором при рН 5,5, содержащим 0,2 М хлорида натрия. Процесс элюции длился около 60 минут. Элюат в количестве 34 л собирали в стерильные 20-ти л стеклянные баллоны и проводили ультрафильтрацию.

Выход целевого продукта - 98,3%. Фракционный состав полученного полуфабриката - сумма мономера и димера иммуноглобулина - 95%, агрегаты - менее 1%. Специфическая биологическая активность отвечает требованиям Европейской Фармакопеи. Чистота (метод электрофореза на ацетатно-целлюлозных пленках) - более 99%. Примеси иммуноглобулинов А и М не обнаружены. Полученный продукт обладает низкой активностью активатора прекалакреина и минимальным содержанием анти-А и анти-Б гемаглютининов, что свидетельствует о его безвредности.

Титр вирусов после инактивации - отсутствие вирусов.

Таким образом, предложенный способ обеспечивает вирусобезопасность иммуноглобулина для лекарственных препаратов и стабильность готового препарата.

Изобретение относится к медицине, а именно к производству лекарственных препаратов. Предложен способ получения иммуноглобулина G, включающий фракционирование этиловым спиртом донорской плазмы с получением осадка Б и очистку выделенного иммуноглобулина, при этом осадок Б растворяют в 0,9%-ном растворе натрия хлорида при рН 5,15 и смешивают с 2 М ацетатным буферным раствором и 53%-ным этиловым спиртом, центрифугируют, центрифугат смешивают с гидрокарбонатом натрия при рН раствора 5,5, после центрифугирования центрифугат осветляют, смешивают с ацетатным буферным раствором при рН 5,4, 96%-ным (об./об.) этиловым спиртом и бикарбонатом натрия при рН 7,2, центрифугируют при минус (10-12)°С, выделенный осадок растворяют в 0,05 М ацетатном буферном растворе с рН 5,5, добавляют к нему сольвент-детергентную смесь, содержащую 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, 1% мас. три-н-бутилфосфата и 1% мас. полисорбата 80, смесь перемешивают, затем разбавляют 0,05 М ацетатным буферным раствором при рН 5,5, содержащим 1% мас. октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л, обработанный таким образом иммуноглобулин иммобилизируют и промывают в две стадии на сульфопропилкатионитном сорбенте с помощью колоночной хроматографии с последующей элюцией, ультрафильтрацией и стерилизующей фильтрацией. Изобретение обеспечивает высокую степень очистки иммуноглобулина G, отсутствие вирусов и стабильность готового препарата. 2 з.п. ф-лы.

1. Способ получения иммуноглобулина G, включающий фракционирование этиловым спиртом донорской плазмы с получением осадка Б и очистку выделенного иммуноглобулина, отличающийся тем, что осадок Б растворяют в 0,9%-ном растворе натрия хлорида при рН 5,15 и смешивают с 2 М ацетатным буферным раствором и 53%-ным этиловым спиртом с последующим центрифугированием при температуре минус (3-5)°С, полученный центрифугат смешивают с гидрокарбонатом натрия при рН раствора 5,5 с последующим центрифугированием при температуре минус (3-5)°С, полученный центрифугат осветляют, осветленный центрифугат смешивают с ацетатным буферным раствором при рН 5,4, 96%-ным (об./об.) этиловым спиртом и бикарбонатом натрия при рН 7,2 с последующим центрифугированием при температуре минус (10-12)°С, выделенный осадок растворяют в 0,05 М ацетатном буферном растворе с рН 5,5, добавляют к нему сольвент-детергентную смесь, представляющую собой 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, содержащий 1 мас.% три-н-бутилфосфата и 1 мас.% полисорбата 80, и перемешивают смесь в течение 12-16 ч, затем разбавляют 0,05 М ацетатным буферным раствором при рН 5,5, содержащим 1 мас.% октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л, обработанный таким образом иммуноглобулин иммобилизируют и промывают в две стадии на сульфопропилкатионитном сорбенте с размером зерен 50 мкм и сорбционной емкостью 55 мг/см³ с помощью колоночной хроматографии с последующей элюцией, ультрафильтрацией и стерилизующей фильтрацией, при этом на первой стадии промывания используют 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, содержащий 1 мас.% октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л, и промывание проводят объемом, соответствующим 5-ти объемам сорбента, а на второй стадии используют 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5 и промывание проводят объемом, соответствующим трем объемам сорбента.

2. Способ по п.5, отличающийся тем, что на первой и второй стадиях промывание ведут со скоростью 3 см/мин.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что элюцию осуществляют 0,05 М ацетатным буферным раствором при рН 5,5, содержащим 0,2 М хлорида натрия.