СРЕДСТВО, ПРОЯВЛЯЮЩЕЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВУЮ АКТИВНОСТЬ Российский патент 2009 года по МПК A61K33/00 A61K31/194 A61P35/00 

Изобретение относится к области медицины и касается расширения арсенала потенциальных противоопухолевых средств на основе комплекса оксованадия с органическим лигандом.

Микроэлемент ванадий рассматривается в настоящее время как важный регулятор роста, дифференцировки и гибели клеток. Ванадийсодержащие соединения представляют интерес и как потенциальные терапевтические агенты, поскольку многие из них проявляют инсулиноподобную [1] или противоопухолевую активность [2]. Для некоторых соединений оксованадия (IV), таких как бис(мальтолато)оксованадий (IV) и бис(ацетилацетонато)оксованадий (IV), являющихся эффективными инсулиномиметиками, описана и антипролиферативная активность в отношении целого ряда линий опухолевых клеток человека [3]. Исследования последних лет показали, что как неорганические соединения четырех- или пятивалентного ванадия, так и целый ряд его комплексов с органическими лигандами, в составе которых валентность ванадия изменяется от 3 до 5, обладают цитостатической активностью, подавляя рост опухолевых клеток in vitro и in vivo [4, 2, 5]. Так, соединения ванадия проявляют выраженный противоопухолевый эффект в отношении рака печени мыши, асцитной опухоли Эрлиха, карциномы молочной железы мыши [6], гепатомы Морриса [5], лейомиосаркомы крысы [7], некоторых линий опухолевых клеток человека [8-10]. Общим для различных соединений ванадия является их способность стимулировать апоптоз в неопластических клетках. Показано, что добавление в питьевую воду животным метаванадата аммония индуцирует апоптоз в неопластических клетках, не оказывая при этом никакого влияния на нормальные пролиферирующие клетки [11]. Комплекс 4-валентного ванадия (бис(4,7-диметил-1,10-фенантролин) сульфатооксованадий (IV))-метван намного более эффективно вызывает апоптоз лейкозных клеток от пациентов с различными формами лейкемии, чем такой стандартный химиотерапевтический агент, как винкристин. Кроме того, метван высокоэффективен в отношении резистентных к цисплатину линий клеток раковых опухолей яичников и тестикул [12, 9].

Исследования, проведенные на различных клеточных линиях, позволили сделать вывод о том, что соединения ванадия проявляют противоопухолевый эффект путем ингибирования тирозинфосфатаз, участвующих в передаче внутриклеточных сигналов. Этот эффект в конечном счете приводит к усилению апоптоза или к активации генов - супрессоров опухолей. Ингибирование фосфорилирования тирозина в белках, вызываемое соединениями ванадия, может также подавлять инвазию и метастазирование опухолевых клеток.

Имеющиеся в настоящее время экспериментальные данные позволяют говорить о том, что соединения ванадия могут проявлять (а) антипролиферативный эффект (т.е. подавлять скорость роста раковых клеток); (б) обладать цитотоксическим и (или) цитостатическим действием, обусловленным некрозом или апоптозом; (в) снижать инвазивный или метастатический потенциал малигнезированных клеток; (г) подавлять клеточную резистентность по отношению к химиотерапевтическим агентам [2].

Природа органического лиганда в молекуле ванадийсодержащего соединения во многом определяет его цитотоксическое (противоопухолевое) действие и в то же время цитотоксичность каждого конкретного соединения ванадия варьирует по отношению к различным видам опухолевых клеток. В этой связи актуальным является поиск новых эффективных и нетоксичных соединений ванадия, который продолжается в настоящее время во многих исследовательских центрах.

Известен билигандный комплекс ванадила с яблочной кислотой - бис(L-малато)оксованадий(IV) (VO(mal)₂) [Патент №2101287, 1998 г.], который прошел доклинические испытания в качестве гипогликемического агента [13].

Яблочная кислота, входящая в состав исследуемого комплекса, является естественным метаболитом и может стать дополнительным источником накопления энергии в клетке.

Сущность изобретения состоит в обнаружении противоопухолевой активности бис(L-малато)оксованадия (IV).

Целевое соединение бис(L-малато)оксованадий (IV) получают в 2 стадии взаимодействием L-яблочной кислоты (2 моля) с ванадилирующим агентом (ванадилацетатом) (1 моль) в водной среде, в результате чего образуется первичный ванадильный комплекс L-яблочной кислоты в смеси со свободной L-яблочной кислотой.

Реакционную смесь удалением воды переводят в твердофазное состояние, и полученный твердый раствор первичного ванадильного комплекса [(L-малато)оксованадия (IV)] в L-яблочной кислоте с целью получения целевого соединения бис(L-малато)оксованадия (IV) подвергают нагреванию при 105-115°С (Схема 1) при пониженном или атмосферном давлении.

Строение полученного комплекса подтверждено результатами элементного анализа, а также данными масс-спектрометрии.

Пример 1. Бис(L-малато)оксованадий (IV) (1).

В раствор 50,9 г (0,38 моль) L-яблочной кислоты в 250 мл воды вносят 35,2 г (0,19 моль) ацетата ванадила. Реакционную смесь перемешивают при 40-60°С до полного растворения осадка. Темно-голубой реакционный раствор упаривают досуха на роторном испарителе и полученный промежуточный темно-синий стекловидный продукт высушивают до постоянного веса в вакуум-эксикаторе. Высушенный продукт измельчают и нагревают в той же реакционной колбе на роторном испарителе при 105-115°С (температура в массе) в вакууме водоструйного насоса в течение 1-1,5 ч, процесс сопровождается выделением воды (5-7 г). Полученный бис(L-малато)оксованадий (IV) 1 представляет собой хрупкую темно-синюю пористую массу, выход 58-61 г (96-98%), содержит 1-2% свободной яблочной кислоты.

Бис(L-малато)оксованадий (IV) легко растворим в воде, слабо растворим метаноле и диметилсульфоксиде, почти не растворим в метаноле, не растворим в ацетоне.

Найдено, %: V 15,35; С 28,50; Н 3,32. Брутто-формула: C₈H₁₀O₁₁V.

Вычислено, %: V 15,30: С 28,84; Н 3,03.

Молекулярная масса (m/e) 333 (ионизация электроспреем).

Удельное оптическое вращение [α]²⁰-164° (вода), (вода, с 1,65).

Пример 2. Бис(L-малато)оксованадий (IV) (1).

Промежуточный продукт, полученный по методу А (1,0 г), нагревают при 97-100°С в течение 24-30 часов. Выход комплекса 0,93 г (99%), который идентичен по физико-химическим характеристикам продукту, полученному в примере 1.

В опытах in vitro исследовали влияние оксованадиевого комплека L-яблочной кислоты (VO(mal)₂) на рост нормальных фибробластов кожи человека, трансформированных вирусом фибробластов мыши NIH 3Т3, трансформированных вирусом клеток почки человека 293, клеток фибросаркомы мыши L 929, клеток феохромоцитомы крысы PC12 и карциномы печени человека HepG₂. Изучение цитотоксичности и противоопухолевой активности оксованадиевых комплексов проводили в сравнении с неорганическим соединением четырехвалентного ванадия -ванадилсульфатом (VOSO₄).

Культура клеток. Клетки PC12 и L929 были получены из Института морфологии человека и животных PAMH, клетки HepG₂ - из Института канцерогенеза Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН, клетки NIH 3Т3 и 293 получены из коллекции клеточных культур Института цитологии РАН. Нормальные фибробласты кожи человека были получены из Института ревматологии РАМН.

Клетки PC12 культивировали в среде RPMI 1640, клетки HepG₂, L929, NIH 3Т3 и 293 - в среде ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, фибробласты кожи здорового человека в среде Игла с добавлением 20% бычьей сыворотки. Среды содержали 2 мМ L-глутамина и гентамицин в концентрации 50 мг/мл. Клетки культивировали в 48-луночных планшетах в СО₂-инкубаторе при 37°С до состояния плотного монослоя.

Цитотоксичность соединений ванадия изучали в интервале концентраций от 0,5 до 24 мкг/мл, используя МТТ-тест. Этот тест, основанный на способности митохондриальных дегидрогеназ образовывать кристаллы формазана из МТТ-реактива (3-[4,5-диметилтиа-2-ил]-2,5-дифенилтетразолий бромида), позволяет точно определить число живых клеток.

Исследование действия различных концентраций VO(mal)₂ на рост нормальных фибробластов кожи показало, что через 24 часа после добавление VO(mal)₂ в концентрации от 0,5 до 6,0 мкг/мл жизнеспособность фибробластов не изменялась по сравнению с контролем. В то же время ванадилсульфат проявляет дозозависимое цитотоксическое действие, начиная с самой низкой концентрации (табл.1). Таким образом, VO(mal)₂ не проявляет цитотоксичности по отношению к нормальным клеткам. Увеличение времени инкубации фибробластов в присутствии как VO(mal)₂, так и VOSO₄ приводит к некоторой стимуляции пролиферации.

При исследовании действия VO(mal)₂ на клетки фибросаркомы L929 обнаружено дозозависимое уменьшение числа жизнеспособных клеток по сравнению с контролем, которое усиливается с увеличением времени инкубации. Через 72 часа культивирования VO(mal)₂ в концентрации 6 мкг/мл подавляет рост клеток на 74%. Такой же эффект вызывает и VOSO₄ (табл.2).

Клетки PC12 также чувствительны к цитотоксическому действию VO(mal)₂, которое проявлялось уже через 24 часа инкубации (табл.3).

Для выяснения значения органического лиганда в проявлении цитотоксического действия был исследован также монокомплекс ванадила с яблочной кислотой (L-малатооксованадий) (IV) - VO(mal). Оказалось, что в отличие от биокомплекса VO(mal) во всех исследуемых концентрациях практически не влияет на рост клеток PC12 в течение 24 часов. Через 48 часов культивирования (табл.3) в присутствии монокомплекса наблюдается стимуляция роста этих клеток.

Дозозависимое снижение жизнеспособности в присутствии VO(mal)₂ наблюдалось и для клеток NIH 3Т3 (табл.4).

Клетки HepG₂ менее чувствительны к соединениям ванадия по сравнению с другими линиями трансформированных клеток. Так, цитотоксическое действие VO(mal)₂ на клетки HepG₂ проявляется только через 72 часа культивирования. При инкубации в течение 96 часов число клеток снижается на 40% по сравнению с контролем. Ванадилсульфат в той же концентрации уменьшает число живых клеток приблизительно на 30% только через 96 часов инкубации (табл.5). Эти клетки оказались резистентными к действию комплексов ванадила, в состав которых входят стериоизомеры яблочной кислоты: ванадильные комплексы D-яблочной кислоты (хирального антипода L-яблочной кислоты) и рацемической формы DL-яблочной кислоты (данные не приведены).

В табл.6 представлены значения IC₅₀ для пяти линий трансформированных клеток. Из этих данных следует, что бискомплекс ванадила с яблочной кислотой эффективно подавляет рост клеток фибросаркомы (L929), феохромоцитомы (PC12) и трансформированных вирусом клеток почки человека (293). Менее чувствительными к цитотоксическому действию VO(mal)₂ оказались трансформированные вирусом фибробласты мыши (NIH 3Т3). В то же время этот комплекс не проявляет цитотоксичности по отношению к нормальным клеткам (табл.1).

Известно, что соединения ванадия могут осуществлять антипролиферативное и цитотоксическое действие путем ингибирования синтеза ДНК (14), а также взаимодействия ДНК с факторами транскрипции (15).

Включение радиоактивного предшественника в ДНК.

Для исследования пролиферации клетки синхронизовали в ростовой среде, содержащей 0,5% эмбриональной телячьей сыворотки в течение 24 часов, затем добавляли исследуемые соединения и С¹⁴-тимидин. Через 24 часа после этого клетки промывали холодным раствором Хэнкса и обрабатывали в течение ночи ледяным фиксирующим раствором для того, чтобы убрать из клеток свободный радиоактивный предшественник синтеза ДНК. Затем измеряли число клеток после их окраски кристаллвиолетом, используя мультискан "LabSystems". Клеточный монослой лизировали в течение 12-ти часов 0.6 н. КОН, затем лизат нейтрализовали 1н. HClO₄. Радиоактивность измеряли стандартными радиометрическими методами, используя сцинтилляционную жидкость Брея. Результаты рассчитывали в имп./мин на 10⁶ клеток и в % к контролю.

Результаты исследования по влиянию VO(mal)₂ и VOSO₄ на включение С¹⁴-тимидина в ДНК свидетельствуют о том, что синтез ДНК в клетках L929 менее чувствителен к действию оксованадиевых соединений по сравнению с клетками PC12 и его подавление наблюдается только при высоких концентрациях (табл.6). Отметим, что в клетках HepG2, которые оказались на порядок менее чувствительными к цитотоксическому действию оксованадиевых соединений, чем другие линии трансформированных клеток (см. табл.7), ингибирования синтеза ДНК в этих условиях мы не наблюдали.

ЛИТЕРАТУРА

1. Badmaev V., Prakash S. and Majeed M. (1999) J. Alternat. Complement. Medicine, 5, 273-291.

2. Evangelou A.M. (2002) Crit. Rev. Oncol./Hematol., 42, 249-265.

3. U.S. Pat. №5,877,210, 02/03/1999.

4. Bishayee A., Oinam S., Basu M. and Chatterjiee M. (2000). Brain Cancer Res. Treatment, 63, 133-145.

5. Osinska-Krolicka I., Podsiadly H., Bukietynska K. et al (2004). J. Inorg. Biochem., 98, 2087-2998.

6. Thompson H.J., Chasteen N.D. and Meeker L.D. (1984). Carcinogenes, 5, 849-851.

7. Liasko R., Kabanos T. A., Karkabounas S. et al (1998). Antycancer Res., 18, 3609-3613.

8. Kopf-Maler P. (1994) Eur. J. Clin. Pharmacol., 47, 1-16.

9. Cruz O. J D., Uckun F.M. (2002). Expert Opin. Investig. Drugs, 11, 1829-1836.

10. Ray R.S., Rana В., Swami В. et al (2006) Chem. Biolog. Interact, 163, 239-247.

11. Ray R.S., Roy S, Ghosh S. et al (2004). Biochim. Biophys. Acta, 1675, 165-73.

12. Naria R.K, Chen C.L., Dong Y, Uckun F.M. (2001). Clin. Cancer Res., 7, 2124-33.

13. Патент РФ №2101287, 1998.

14. Hall I.H., Durham R.W, Tram M. et al. (2003). J Inorg. Biochem, 93, 125-131.

15. Lampronty I., Bianchi N., Borgatty M. et al. (2005). Oncol. Rep., 14, 9-15.

Таблица 1
Оценка выживаемости нормальных фибробластов кожи человека в присутствии различных концентраций VO(mal)₂ и VOSO₄ Концентрация соединения (мкг/мл) Выживаемость клеток после 24-х часовой инкубации (% от контроля)* VO(mal)₂ VOSO₄ 0 100±2 100±2 0,5 107±10 76±8 1,0 105±8 69±6 1,5 104±8 66±7 3,0 101±9 65±5 6,0 98±8 58±6 *Представлены средние арифметические величины по данным 4 измерений в трех независимых экспериментах ± ошибка среднего значения (X±m)

Таблица 2
Оценка цитотоксичности VO(mal)₂ и VOSO₄ для клеток фибросаркомы L929 Концентрация соединения (мкг/ мл) Жизнеспособность клеток (% от контроля)* VO(mal)₂
Время инкубации (часы) VOSO₄
Время инкубации (часы) 24 48 72 24 48 72 0 100±1 100±1 100±1 100±1 100±1 100±1 0,5 120±11 123±12 99±9 142±12 126±12 95±7 1,0 108±9 121±11 97±8 139±14 110±8 86±6 1,5 110±9 119±110 47±5 130±10 79±5 41±4 3,0 88±7 60±4 43±4 108±10 60±5 26±2 6,0 79±6 50±3 26±2 96±8 41±3 25±2 *Представлены средние арифметические величины по данным 4 измерений в трех независимых экспериментах ± ошибка среднего значения (X±m)

Таблица 3
Оценка цитотоксичности оксованадиевых комплексов L-яблочной кислоты для клеток феохромоцитомы PC12 Концентрация соединения (мкг/мл) Жизнеспособность клеток (% от контроля)* VO(mal)₂ VO(mal) VO(mal)₂ VO(mal) Время инкубации 24 часа Время инкубации 48 часов 0 100±3 100±3 100±3 100±3 0,5 108±7 111±12 106±12 141±12 1,0 105±8 109±9 101±14 134±13 1,5 85±9 110±9 86±9 130±13 3,0 73±7 112±10 65±5 122±13 6,0 56±6 96±7 31±2 114±10 *Представлены средние арифметические величины по данным 4 измерений в трех независимых экспериментах ± ошибка среднего значения (X±m)

Таблица 4
Оценка цитотоксичности VO(mal)₂ и VOSO₄ для клеток NIH 3Т3 Жизнеспособность клеток (% от контроля)* Концентрация соединения (мкг/мл) VO(mal)₂ VOSO₄ 48 час 72 час 48 час 72 час 0,5 117±10 122±11 112±9 121±13 1,5 - 102±9 - 99±10 3,0 59±6 56±4 65±6 53±6 6,0 53±5 45±4 56±5 41±4 24,0 42±5 25±3 37±3 25±3 *Представлены средние арифметические величины по данным 4 измерений в трех независимых экспериментах ± ошибка среднего значения (X±m)

Таблица 5
Оценка цитотоксичности VO(mal)₂ и VOSO₄ для клеток карциномы печени HepG₂ Концентрация соединения (мкг/мл) Жизнеспособность клеток (% от контроля)* VO(mal)₂
Время инкубации (часы) VOSO₄
Время инкубации (часы) 24 48 72 96 24 48 72 96 0 100±1 100±1 100±1 100±1 100±1 100±1 100±1 100±1 0,5 100±8 128±13 91±9 92±9 - - - - 1,0 104±10 118±11 76±6 87±7 110±9 113±12 98±8 90±8 1,5 105±10 117±12 87±6 86±8 113±10 110±10 101±11 82±8 3,0 99±9 113±11 86±9 72±6 110±9 111±10 89±8 79±7 6,0 102±10 99±10 69±5 59±5 105±9 90±10 91±9 68±7 *Представлены средние арифметические величины по данным 4 измерений в трех независимых экспериментах ± ошибка среднего значения (X±m)

Таблица 6
Действие VO(mal)₂ и VOSO₄ на синтез ДНК в клетках L929 и РС12 Концентрация соединения (мкг/мл) Включение ¹⁴С тимидина в ДНК (% от контроля) Клетки PC12 Клетки L929 Время инкубации (часы) Время инкубации (часы) VO(mal)₂ VOSO₄ VO(mal)₂ VOSO₄ 72 96 72 96 72 96 72 96 0 100±1 100±1 100±1 100±1 100±1   100±1 - 3,0 88±8 59±5 96±8 90±8 - -   - 6,0 70±7 34±3 66±7 58±6 - - - - 12,0 - - - - 76±6 - 104±7 - 24,0 - - - - 68±6 - 63±5 -

Таблица 7
Цитотоксическая активность VO(mal)₂ и VOSO₄ по отношению к различным линиям трансформированных клеток IC₅₀ (мкМ) Клетки Ванадильные соединения   VO(mal)₂ VOSO₄ 48 час 72 час 48 час 72 час PC12 13,5 3,2 15,8 3,9 L929 18,0 4,2 15,0 5,1 293 18,1 - - - NIH 3Т3 37,5 12,9 35,6 13,4 HepG₂ - 45,0 - 83,0

Изобретение относится к области медицины, в частности фармации, и касается нового противоопухолевого средства, представляющего собой билигандный комплекс ванадила с яблочной кислотой - бис(L-малато)оксованадий (IV). 7 табл., 1 ил.

Средство, проявляющее противоопухолевую активность, представляющее собой бис(L-малато)оксованадий (IV).