СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИВАЛЕНТНОЙ СЫВОРОТКИ ПРОТИВ ПСЕВДОМОНОЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2009 года по МПК A61K39/40 

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к методам изготовления сывороток, и может быть использовано в учреждениях, занимающихся созданием сывороточных препаратов.

Известен способ получения поливалентной О-сыворотки (авт. св. № 789116, кл. A61K 39/40, 1980 г.), заключающийся в том, что животных-продуцентов иммунизируют возрастающими дозами полиантигенного препарата, полученного путем смешения в равных соотношениях О-антигенов, выделенных из различных серологических групп одного вида бактерий, предварительно обработанных кипячением в течение 20-25 ч, при этом иммунизацию ведут циклами по четыре инъекции с интервалом между циклами 12-14 дней, а между инъекциями - 5-6 дней, причем, первую инъекцию проводят подкожно, а последующие - внутривенно.

Наиболее близким по технической сущности является способ получения гипериммунной сыворотки против колибактериоза, сальмонеллеза клебсиеллеза телят, поросят, ягнят (см. патент РФ № 2306954, кл. A61K 39/40, 2007 г. - прототип), включающий гипериммунизацию быков-продуцентов поливалентным антигеном, полученным путем культивирования эпизоотических штаммов, выращенных раздельно на бульоне Хоттингера, имеющего рН 7,2-7,4, и смешанных в равных соотношениях с последующей инактивацией формалином, взятие крови для получения сыворотки, отделение сыворотки с последующим консервированием.

Однако известная сыворотка для профилактики псевдомоноза сельскохозяйственных животных не применяется.

Техническим решением задачи является повышение эффективности профилактических мер против заболеваний, вызванных возбудителем Pseudomonas aeruginosa, и расширение спектра действия.

Поставленная задача достигается тем, что в способе получения поливалентной сыворотки против псевдомоноза сельскохозяйственных животных, включающем гипериммунизацию быков-продуцентов поливалентным антигеном, полученным путем культивирования эпизоотических штаммов, выращенных раздельно на бульоне Хоттингера, имеющего рН 7,2-7,4, и смешанных в равных соотношениях с последующей инактивацией формалином, взятие крови для получения сыворотки, отделение сыворотки с последующим консервированием, согласно изобретению, в качестве эпизоотических штаммов используют Pseudomonas aeruginosa серотипов О1, О2, О3, О4, О6, О10, O11, О13, О18, О19 и проводят иммунизацию по циклам возрастающими дозами антигена, вводят антиген подкожно не более 14 раз через 3-4 дня в течение 51 дня, начиная с 5 мл, причем две последующие дозы каждый раз увеличивают в два раза, а остальные - в 1, 3 раза больше каждой предыдущей и последние четыре дозы не более 150 мл, при этом взятие крови у животных-продуцентов для контрольного определения титров осуществляют через 8, 22, 32 дня от начала введения антигена, а для получения сыворотки кровь берут на 52-53 день от начала введения антигена. В способе получения поливалентной сыворотки против псевдомоноза сельскохозяйственных животных контроль сыворотки на активность проводят на белых мышах.

Новизна заявляемого предложения заключается в том, что использование в качестве эпизоотических штаммов - Pseudomonas aeruginosa серотипов O1, О2, О3, О4, О6, О10, О11, О13, О18, О19 обеспечивает возможность повышения эффективности профилактических мер против заболеваний, вызванных возбудителем Pseudomonas aeruginosa, а применение предлагаемой схемы гипериммунизации животных-продуцентов и контроль сыворотки на активность посредством белых мышей упрощают процесс и снижают затраты на приготовление сыворотки.

По данным научно-технической и патентной литературы не обнаружена аналогичная заявляемой совокупность признаков, позволяющая получить технический результат, который ранее не достигался известными средствами, что позволяет судить об изобретательском уровне заявляемого предложения.

Предложенный способ получения сыворотки против псевдомоноза сельскохозяйственных животных соответствует критерию «промышленная применимость», поскольку воспроизводим, и возможно широкое использование при выращивании с.х. животных.

Пример конкретного осуществления способа получения поливалентной сыворотки против псевдомоноза сельскохозяйственных животных.

Процесс приготовления сыворотки можно разбить на несколько этапов.

1-й этап. Предварительно готовят питательную среду для культивирования эпизоотических штаммов, в качестве которых используют Pseudomonas aeruginosa серотипов О1, О2, О3, О4, О6, О10, О11, О13, О18, О19. Для этого используют бульон Хоттингера, приготовленный из основного перевара Хоттингера, для этого готовят фарш из мяса, освобожденного от костей, жировой клетчатки, связок и сухожилий. На I кг фарша берут 1,5 л дистиллированной воды (рН 6,8-7,0), подогретой до температуры 40-42°С, и подщелачивают химически чистым двууглекислым натрием (ГОСТ 2156.76) или 10%-ным раствором натрия гидроокиси (ГОСТ 4328-77) до рН 7,8-8,0. На I литр смеси добавляют 150-200 г очищенной от оболочек и измельченной на мясорубке поджелудочной железы крупного рогатого скота или 20-30 г панкреатина и 20 мл химически чистого хлороформа. После добавления ингредиентов смесь тщательно перемешивают и оставляют для переваривания при температуре 40-42°С в течение 3-4 суток. Первые 6 часов смесь перемешивают через каждый час, а затем 3-4 раза в сутки. В процессе переваривания ежедневно определяют рН среды. В случае снижения рН перевар подщелачивают до 7,8-8,0 добавлением 10%-ного раствора натрия гидроокиси. После указанных сроков фарш превращается в рыхлый сероватый осадок, над которым при правильном переваривании верхний слой жидкости имеет соломенно-желтый цвет. Снижение процентного содержания триптофана свидетельствует о готовности перевара. К этому времени рН стабилизируется в пределах 7,6-8,0. Химические показатели перевара: общего азота 800-1200, аминного азота 700-900 и триптофана 100-200 мг, %.

Затем готовят бульон Хоттингера, для этого используют прозрачную надосадочную жидкость основного перевара, которую разводят дистиллированной водой до содержания в бульоне 200-300 мг % аминного азота. Среду подогревают и добавляют 0,5% пептона (ГОСТ 13805-76), 0,5 % натрия хлористого (ГОСТ 4233-77), 0,3% химически чистого двуосновного фосфорнокислого натрия (ГОСТ 11773-76) и 10% воды на выкипание. Среду кипятят в течение 30 минут. Во время кипячения устанавливают рН 6-8,0 путем добавления 10%-ого раствора натрия гидроокиси. Среду вновь кипятят в течение часа, оставляют в том же варочном котле для отставания на 1-1,5 часа и фильтруют до полной прозрачности через плотный слой ваты и марли. Среду перекачивают в другой заранее приготовленный стерильный реактор, который заполняют не более 2/3 объема, и стерилизуют при температуре 118-120°С в течение 45-50мин. Готовая питательная среда должна иметь следующие показатели: рН 7,2-7,4; аминного азота 200-250 и триптофана 50-100 мг, %.

2-й этап. После приготовления питательной среды приступают к приготовлению посевного материала. Для изготовления серии антигена каждый раз используют отдельную ампулу с лиофилизированной культурой штамма. Культуру каждого штамма в ампуле ресуспендируют до первоначального объема стерильным мясо-пептонным бульоном или бульоном Хоттингера, высевают из МПА в 3-4 бактериологические чашки по следующей методике: 0,1-0,2 мл суспензии культуры штамма вносят на поверхность агара и стеклянным шпателем распределяют ее по поверхности агара. Этим же шпателем проводят по поверхности агара второй, а затем третьей чашки, инкубируют 18-24 часа при 37-37,5°С. В третьей чашке должен быть рост изолированных колоний. Одновременно делают высевы в пробирки с МПБ, МПА МППБ под вазелиновым маслом и средой Сабуро, инкубируют при том же температурном режиме (для среды Сабуро 20-24°С) посевы на МПА и МПБ трое суток, а на МППБ под вазелиновым маслом и среде Сабуро 5 суток. По истечении срока инкубации культуру каждого штамма в отдельности проверяют на чистоту и характер роста визуальным просмотром, а также просмотром мазков, окрашенных по Граму. Из культур, выросших на агаре в чашках, отбирают 2- 3 пигментопродуцирующие колонии и высевают в пробирки с бульоном Хотингера каждый штамм в отдельности и инкубируют при 37-37,5°С 18-24 часа. Проверяют чистоту роста просмотром мазков, окрашенных по Граму, и высевают каждый штамм в отдельности на бульон Хоттингера во флаконы или бутыли в соотношении 1:100 и культивируют.

Для получения матричной расплодки из флаконов или бутылей чистую суточную бульонную культуру каждого штамма в отдельности пересевают в подогретый до 36-37°С бульон Хоттингера в баллонах из расчета 80-100 мл на 10 литров среды. Посевы культивируют при 37-37,5°С в течение 18-24 часов, проверяют чистоту роста. Оптическая концентрация культуры должна быть не менее 0,8-1,0 млрд микробных клеток в I мл.

3-й этап. Далее выращивание культуры осуществляют в реакторах для получения бактериальной массы.

После проверки матричной расплодки на чистоту микроскопией окрашенных мазков визуального определения по Граму и визуального определения характера роста в реактор или балон с бульоном Хоттингера, подогретого до 36-37°С, вносят матричную расплодку в количестве 5-8% к объему питательной среды. Для снижения пенообразования к питательной среде в реактор добавляют 0,03-0,05% стерильного пеногасителя (подсолнечного, сливового, абрикосового или персикового масла). Культуру каждого штамма засевают и выращивают в отдельном реакторе или балоне.

После внесения матричной расплодки в реактор содержимое реактора перемешивают механической мешалкой 1-2 минуты с нижеуказанной частотой вращения и оставляют для культивирования на 1,5-2 часа. Через 1,5-2 часа культивирование продолжают при непрерывном перемешивании и одновременной аэрацией стерильным воздухом. Частота вращения механической мешалки должна быть в пределах 150-240 оборотов в мин, количество продуваемого воздуха 1-1,5 объема в минуту к общему объему аэрируемой культуры. Культивирование проводят при температуре 37-37,5°С и прекращают через 24-36 часов при условии незначительного повышения или прекращения накопления бактериальной массы. К этому сроку концентрация бактериальной массы должна быть не выше 20 млрд м.к. в I мл по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича. Через 6-8 часов после начала культивирования и в последующем через каждые 2-3 часа проводят отбор проб. В отобранных пробах проверяют концентрацию микробных клеток по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича. Для поддержания в пределах рН 7,2-7,4 используют 10% раствор гидроокиси натрия. При повышении рН от исходного в щелочную сторону добавляют стерильный 40%-ный раствор глюкозы до концентрации 0,1%. По истечении срока инкубации нагревание реактора прекращают и охлаждают до температуры 6-8°С. Выращенную культуру каждого штамма в отдельности проверяют по показателям: чистота - микроскопией мазков, окрашенных по Граму; посевом на МПА, МПБ, среду Сабуро, МППБ под вазелиновым маслом; рН - электрометрическим методом и концентрацию микробных клеток по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича. Культура должна быть чистой, содержать не менее 20 млрд микробных клеток в I мл, рН 7,2-7,4.

4-й этап. Приготовление антигена для гипериммунизации волов-продуцентов осуществляют после установления чистоты, концентрации бактериальной массы и рН, культуры О1, О2, О3, О4, О6, О10, О11, О13, О18, О19 серотипов в реакторах разводят соответствующим количеством стерильного физиологического раствора до концентрации 10 млрд/мл микробных клеток, затем биомассу каждого серотипа перекачивают и смешивают в одной емкости в равных объемах. При избытке полученной бактериальной массы расчетное количество полученной культуры перекачивают в другой (другие) реакторы или емкости, обеспечивающие перемешивание и поддержание требуемого температурного режима 6-8°С. После смешивания суспензию культур подвергают инактивации формалином.

К объему поливалентной культуры, предназначенной для изготовления антигена для подкожного введения, при включенной мешалке добавляют формалин (ГОСТ 1625-75) до концентрации 0,3% в общем объеме и выдерживают при температуре 37-38°С в течение 20 суток. Формалин должен содержать не менее 36% формальдегида. Приготовленный антиген проверяют на стерильность, рН, содержание остаточного формалина и на безвредность введением подкожно пяти белым мышам в дозе 0,5 мл. Мыши должны остаться живыми в течение пяти дней, а посевы стерильными в течение 10 суток наблюдения, рН должен быть 7,0-7,2, содержание формалина должно быть не более 0,09%, контроль сыворотки на активность также проводили на белых мышах. Проверенный на стерильности, активность и безвредность антиген используют для гипериммунизации животных. Срок годности поливалентного антигена до шести месяцев при условии хранения в темном месте при температуре 2-15°С. 5-й этап. Затем проводят иммунизацию по циклам животных-продуцентов возрастающими дозами антигена, но предварительно проводят подготовку животных-продуцентов, в качестве которых используют волов.

Завезенных на биопредприятие волов подвергают карантину, затем обследованию и необходимой обработке против инфекционных болезней в соответствии с «Основными ветеринарными правилами заготовки, содержания животных и закупки яиц, используемых в биологической промышленности», утвержденными ГУВ МСХ СССР 17.03.81 г.

После окончания карантина, обследования и обработки здоровых волов переводят в сывороточный цех для гипериммунизации. К эксплуатации допускаются животные в возрасте 2,5-5 лет, массой не менее 400 кг.

Гипериммунизацию волов-продуцентов проводят по следующей схеме (см. таблицу 1).

Как видно из схемы, вводят антиген подкожно не более 14 раз через 3-4 дня в течение 51 дня, начиная с 5 мл, причем две последующие дозы каждый раз увеличивают в два раза, а остальные - в 1, 3 раза больше каждой предыдущей и последние четыре дозы не более 150 мл, при этом взятие крови у животных-продуцентов для контрольного определения титров осуществляют через 8, 22, 32 дня от начала введения антигена, а для получения сыворотки кровь берут на 52-53 день от начала введения антигена.

Таблица I
Предлагаемая схема гипериммунизации продуцентов № Дни инъекции антигена Кол-во дней, через которые вводили антиген Дозы антигена в мл Кол-во дней, через которые осуществляли взятие крови после введения антигена Грундиммунизация I 1 0 5,0   2 4 3 10,0   3 8 4 20,0 8 4 11 3 30,0   5 15 4 40,0   6 18 3 50,0   7 22 4 70,0 22 8 25 3 90,0   9 29 4 110,0   10 32 3 150,0 32 Гипериммунизация 11 35 3 150   12 39 4 150   13 43 4 150   14 51 8 150 51

При подкожном введении антигена в больших дозах его вводят в разные места шеи, верхней части туловища, но не ближе 10-15 см от заднего края лопатки. Через 8, 22, и 32 дня после начала введения антигена у продуцентов из яремной вены берут кровь в пробирки для контрольного определения титров. Титры антител к каждому серотипу определяют в пробирочной реакции агглютинации общепринятым методом. В качестве антигена применяют суточную суспензию культуры каждого серотипа, выращенную на МПА в чашках, смытую физиологическим раствором (рН 7,2-7,4, содержащую 0,5 млрд т. микробных клеток в I мл по оптическому стандарту мутности), инактивированную формалином. Титры антител в РА после 10-го введения антигена должны быть не ниже 1:800 с оценкой в три-четыре креста к каждому серотипу. В процессе эксплуатации после каждого взятия крови проводят, в зависимости от массы продуцента, двукратное введение антигена: первый раз в половинной дозе (75-100 мл) подкожно через 5-6 дней после взятия крови, второй раз в полной дозе (150-200 мл) через 5-6 суток после первой инъекции антигена. Через 5-6 суток после второго введения антигена производят очередное взятие крови и т.д. Эксплуатируемым волам-продуцентам ежегодно предоставляют месячный отдых от взятия крови (лучше в летнее время). Во второй половине отдыха (через 15-20 дней) продуцентам трехкратно подкожно с интервалом 5-6 дней с учетом массы животных вводят поливалентный антиген, инактивированный формалином: первый раз в дозе 80-100 мл, повторно 110-150 мл и третий раз 150-200 мл и начинают очередной цикл эксплуатации продуцентов.

6-й этап. Взятие крови и получение сыворотки. Пробное взятие крови от продуцентов производят из расчета не более 0,8 л на 100 кг живой массы, а последующие - 1,6 литра. Кровь берут у продуцентов с нормальной температурой тела после предварительной 12-часовой выдержки на голодной диете при неограниченном поении. Кровь берут в стерильные градуированные бутыли вместимостью 15-20 литров. Затем кровь сепарируют, а полученную плазму дефибринируют. Для предохранения крови от свертывания применяют антикоагулянт - 1%-ный раствор лимоннокислого натрия, который готовят на дистиллированной воде или физиологическом растворе и стерилизуют в автоклаве при температуре 120°С в течение 30 мин.

7-й этап. Контроль сыворотки. Проверяют сыворотку на безвредность, стерильность известными методами, а активность на белых мышах.

Эффективность предлагаемой сыворотки подтверждена сравнительными данными (см. таблица 2), которые были получены в результате проведения опытов с 9-ю группами сельскохозяйственных животных (поросята, телята и свиноматки), в 3-х из которых каждого вида животных была использована предлагаемая сыворотка, в 3-х других применяли традиционные методы лечения посредством химиопрепаратов, антибиотиков и 3 группы животных - контроль, которых не лечили.

Таблица 2
Сравнительные данные, подтверждающие эффективность предлагаемой сыворотки. №№ Вид животных Чем лечили, доза К-во животных в группе Вылечено Процент эффективности, % 1. Поросята сыворотка, 0,5 мл/кг веса 229 189 82,5 2. Поросята стрептомицин, полимиксин 92 56 60,9 3. Поросята контроль 24 11 45,8 4. Телята сыворотка, 0,5 мл/кг веса 28 24 85,7 5. Телята стрептомицин, полимиксин 24 15 62,5 6. Телята контроль 7 3 42,8 7. Свиноматки сыворотка, 0,5 мл/кг веса 54 48 88,9 8. Свиноматки стрептомицин, полимиксин 48 37 77,1 9. Свиноматки контроль 36 21 58,3

Из таблицы 2 видно, что по сравнению с традиционным методом лечения предлагаемая сыворотка против псевдомоноза сельскохозяйственных животных эффективна как для лечения молодняка поросят и телят, так и для свиноматок, во всех случаях процент эффективности лечения достаточно высок и составляет в среднем 85,7 %.

Изобретение относится к ветеринарной медицине. Способ включает гипериммунизацию быков-продуцентов поливалентным антигеном, полученным путем культивирования эпизоотических штаммов, выращенных раздельно на бульоне Хоттингера, имеющего рН 7,2-7,4, и смешанных в равных соотношениях с последующей инактивацией формалином, взятие крови для получения сыворотки, отделение сыворотки с последующим консервированием и контролем на активность. При этом в качестве эпизоотических штаммов используют Pseudomonas aeruginosa серотипов 01, 02, 03, 04, 06, 010, 011, 013, 018, 019 и проводят иммунизацию по циклам возрастающими дозами антигена. Антиген вводят подкожно не более 14 раз через 3-4 дня в течение 51 дня, начиная с 5 мл, причем две последующие дозы каждый раз увеличивают в два раза, а остальные - в 1, 3 раза больше каждой предыдущей, и последние четыре дозы не более по 150 мл. Взятие крови у животных-продуцентов для контрольного определения титров осуществляют через 8, 22, 32 дня от начала введения антигена. Для получения сыворотки кровь берут на 52-53 день от начала введения антигена. Сыворотка обладает высокой эффективностью как для лечения поросят и телят, так и для свиноматок. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ получения поливалентной сыворотки против псевдомоноза сельскохозяйственных животных, включающий гипериммунизацию быков-продуцентов поливалентным антигеном, полученным путем культивирования эпизоотических штаммов, выращенных раздельно на бульоне Хоттингера, имеющего рН 7,2-7,4, и смешанных в равных соотношениях с последующей инактивацией формалином, взятие крови для получения сыворотки, отделение сыворотки с последующим консервированием и контролем на активность, отличающийся тем, что в качестве эпизоотических штаммов используют Pseudomonas aeruginosa серотипов 01, 02, 03, 04, 06, 010, 011, 013, 018, 019 и проводят иммунизацию по циклам возрастающими дозами антигена, при этом вводят антиген подкожно не более 14 раз через 3-4 дня в течение 51 дня, начиная с 5 мл, причем две последующие дозы каждый раз увеличивают в два раза, а остальные - в 1, 3 раза больше каждой предыдущей, и последние четыре дозы не более по 150 мл, при этом взятие крови у животных-продуцентов для контрольного определения титров осуществляют через 8, 22, 32 дня от начала введения антигена, а для получения сыворотки кровь берут на 52-53 день от начала введения антигена.

2. Способ получения поливалентной сыворотки против псевдомоноза сельскохозяйственных животных по п.1, отличающийся тем, что контроль сыворотки на активность проводят на белых мышах.