СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ПСЕВДОМОНОЗА СВИНЕЙ Российский патент 2007 года по МПК A61K39/104 

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к методам изготовления вакцин, и может быть использовано в учреждениях, занимающихся созданием вакцинных препаратов.

Известен способ получения поливалентной вакцины против кишечных инфекций (патент РФ на изобретение №2080875 от 18.03.92, МКИ А61К 39/125, 39/135). Данный способ получения поливалентной вакцины включает раздельное выращивание культур Salmonella typhi, Salmonella paratyphi B, Shigella Flexneria, Shigella Sonne, отделение биомассы от питательной среды, экстракцию антигенов проводят водно-солевым раствором при шуттелировании в присутствии антибиотика и мелко раздробленного стекла в течение 1-1,5 часов, полученные экстракты центрифугируют, очистке подвергают супернатанты и после смешивания получают целевой продукт в виде смеси клеточных стенок, содержащих O-антигены используемых культур, со жгутиками, содержащими Н-антигены, и растворимыми Vi-антигенами сальмонелл.

Технология получения данной вакцины очень сложная и для профилактики инфекционных болезней свиней не применяется.

Известно техническое решение (патент РФ на изобретение №2159127, МКИ А61К 39/104, 2000 г. - прототип). В данном техническом решении при получении вакцины против псевдомоноза пушных зверей предусмотрено культивирование штаммов возбудителей, выделенных от больных и павших животных, их инактивацию 0,3-0,4%-ным раствором формалина и внесение гидроокиси алюминия.

Данный способ позволяет получать вакцину против псевдомоноза только пушных зверей.

Техническим решением задачи является повышение эффективности профилактических мер против заболеваний, вызванных возбудителем Pseudomonas aeruginosa, и расширение спектра действия.

Поставленная задача достигается тем, что в способе изготовления вакцины против псевдомоноза свиней, включающем культивирование антигенов, инактивацию формалином и внесение гидроокиси алюминия, согласно изобретению в качестве антигена используют эпизоотические штаммы Pseudomonas aeruginosa серогрупп О1, О3, О4, О6, O11, О19, дающих "S" формы колоний, готовят суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры возбудителей Pseudomonas aeruginosa серогрупп О1, О3, О4, О6, О11, О19, дающих "S" формы колоний, затем их выращивают раздельно в течение 24-36 часов на бульоне Хоттингера с рН 7,2-7,4 и разбавляют при температуре 36-37°С физиологическим раствором до концентрации 10 млрд микробных клеток в 1 мл, инактивируют формалином, содержащим не менее 36% формальдегида, доводя до конечной концентрации 0,3-0,4% и выдерживают в течение 14 суток при температуре 37-37,5°С, при этом культуру перемешивают по 20 минут 3 раза в сутки, далее культуры смешивают в равных объемах и при непрерывном перемешивании вносят 3% раствор гидроокиси алюминия из расчета не более 25% к объему смеси культур, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.

Новизна заявляемого предложения заключается в том, что в качестве антигена используют эпизоотические штаммы Pseudomonas aeruginosa серогрупп О1, О3, О4, О6, О11, О19, дающих "S"-образные формы колоний, которые получают путем отбора пораженных органов (печень, селезенка, почка) от павших поросят из местного эпизоотического очага (см. паспорта №1-5 на штаммы Pseudomonas aeruginosa О1, О3, О4, О6, О11, О19 серогрупп) с последующим выделением чистых культур возбудителей псевдомоноза и обработкой их при определенных режимах.

По данным научно-технической и патентной литературы не обнаружена аналогичная заявляемой совокупность признаков, позволяющая получить технический результат, который ранее не достигался известными средствами, что позволяет судить об изобретательском уровне заявляемого предложения.

Предложенный способ получения вакцины против псевдомоноза свиней соответствует критерию "промышленная применимость", поскольку воспроизводим и прост в изготовлении.

Пример конкретного осуществления способа изготовления вакцины против псевдомоноза свиней.

Для изготовления вакцины против псевдомоноза проводили отбор пораженных органов (печень, селезенка, почка) от павших поросят в период их заболевания псевдомонозом из местного эпизоотического очага (см. паспорта №1-5 на штаммы Pseudomonas aeruginosa О1, О3, О4, О6, О11, О19 серогрупп) и проводили бактериологический посев с целью выделения чистых культур возбудителей.

Культуру каждого штамма инкубировали 18-24 часа при температуре 37°С. После чего для определения чистоты культуры делали контрольные посевы на дифференциально-диагностические среды МПБ, МПА, МППБ под вазелиновым маслом и среду Сабуро при том же температурном режиме (для Сабуро - 20-24°С). Посевы выдерживали 3 суток для МПБ и МПА и 10 - для МППБ и Сабуро.

По окончании культивирования каждый штамм в отдельности проверяли визуально на чистоту и характер роста, а также микроскопией мазков, окрашенных по Грамму. Рост должен быть типичным для псевдомоноза, а культурально-морфологические свойства выделенных чистых культур проявились в следующем: палочка без спор и капсул, подвижная, грамотрицательная; на жидких и твердых питательных средах продуцирован пигмент пиоцианин, среды приобрели зеленоватую окраску; все штаммы продуцируют слизь; на мясо-пептонном агаре все штаммы образовали круглые "S"-формы, различной величины колонии серого цвета со слегка вогнутым центром, вокруг которых за счет выхода пиоцианина образовалась пигментированная зона; на жидких питательных средах образовалась нежная сероватая поверхность, легко разбивающаяся при встряхивании. На среде Гиса штаммы ферментировали без образования газа глюкозу, ксилозу, арабинозу, разжижали желатин, пептонизировали молоко, обладали каталазной активностью, агглютинировали с монорецепторными сыворотками соответствующих серотипов.

Из культур, выросших на чашках Петри, отобрали 2-3 пигментобразующие колонии каждого штамма и засеяли в пробирки с бульоном Хоттингера по отдельности и инкубировали 24-36 часа при 37°С. Затем проверили чистоту каждого штамма микроскопией мазков, окрашенных по Граму, и засеяли каждый штамм во флаконы с бульоном Хоттингера, культивировали 18-24 часа при 37°С. Далее опять проверили чистоту каждого штамма микроскопией мазков, окрашенных по Граму. Через сутки из флаконов бульонную культуру каждого штамма в отдельности пересеяли в бульон Хоттингера в баллонах. Культивировали 18-24 часа при 37°С. После культивирования проверили чистоту каждого штамма микроскопией мазков, окрашенных по Граму.

Культуру каждого штамма засевали и выращивали в отдельном биореакторе, который предварительно стерилизовали при температуре 121°С и давлении 1 бар в течение 1 часа. При тех же параметрах стерилизовали линию приема питательной среды для выращивания бактериальной массы. В качестве питательной среды использовали бульон Хоттингера, содержащего аминный азот 200-250 мг%, с добавлением 0,5% пептона, 0,5% натрия хлористого, 0,3% натрия фосфорнокислого двузамещенного ХЧ, рН 7,2-7,4. Выращенную и проверенную на чистоту культуру засевали в биореакторы в количестве 5-8% к объему питательной среды в нем. После внесения чистой культуры содержимое каждого биореактора перемешивали в течение 1-2 минуты и культивировали на 1,5-2 часа. По истечении указанного времени в каждом биореакторе включали мешалки, культивирование проводили при непрерывном перемешивании и аэрации воздухом в объеме 1,5-2 в минуту к объему среды при температуре 37°С. Культивирование прекращали через 24-36 часов, когда накопление бактериальной массы повышалось незначительно. К этому времени накопление микробиологических клеток в 1 мл по оптическому стандарту мутности ГИСК должно быть 15-20 млрд. Через 6-8 часов в начале выращивания и каждые 2-3 часа в последующем в отобранных пробах проверяли рН, концентрацию микробиологических клеток, чистоту роста. Для поддержания рН в пределах 7,2-7,4 использовали 10% раствор натрия гидроокиси для его повышения или 40% раствор глюкозы для снижения, добавляя до концентрации 0,1%. По истечении срока инкубации нагревание биореакторов прекращали, выросшую культуру проверяли (каждую отдельно) на чистоту роста, посевом на МПБ, МПА, МППБ (3-4 дня без пересева), рН, концентрацию по ранее описанным методикам. Бактериальную массу в биореакторах хранили до получения результатов исследования при температуре 4°С.

При удовлетворительных показателях чистоты, рН и оптической концентрации культуру в биореакторе подогревали до 37°С, вносили стерильный физиологический раствор до концентрации 10 млрд. микробных тел (с учетом последующего добавления необходимых ингредиентов) в 1 мл. Затем проводили инактивация культуры. В разведенную до 10 млрд. микробных клеток в 1 мл культуру при включенной мешалке добавляли формалин, разведенный физиологическим раствором 1:1, таким образом, чтобы его концентрация в культуре была 0,4%. Формалин для инактивации должен содержать не менее 36% формальдегида. Инактивацию культуры формалином проводили в течение 14 суток при температуре 37-37,5°С. В процессе инактивации культуру перемешивали по 20 минут 3 раза в сутки. Через 14 суток брали пробу для проверки на чистоту вакцины, полноту инактивации культуры и для определения рН и концентрации микробных тел в 1 мл.

При получении требуемых результатов контроля штаммы соединяли в равных объемах в биореакторе, вносили при непрерывном перемешивании стерильный адъювант - 3% раствор гидроокиси алюминия из расчета 25% к объему смеси культур. Через трое суток после внесения гидроокиси алюминия формировали серию вакцины, рН которой должна быть в пределах 7,0-7,4. Затем вакцину фасовали в флаконы и укупоривали.

Таким образом, использование для изготовления вакцины против псевдомоноза свиней чистых культур возбудителей Pseudomonas aeruginosa серогрупп О1, О3, О4, О6, О11, О19, дающих "S"-образные формы колоний, выделенных из местного эпизоотического очага, позволяет получать более специфичную, высокоиммуногенную вакцину для защиты от псевдомоноза свиней. Раздельное выращивание возбудителей на бульоне Хоттингера позволяет получать концентрацию бактериальных клеток каждого штамма не менее 10 млрд. в 1 мл. Использование формалина для инактивации в 0,3-0,4%-ной конечной концентрации позволяет в течение 14 суток при температуре 37-37,5°С подавить патогенность и сохранить высокую иммуногенность в течение 12 месяцев хранения. Адсорбирование шести антигенов на гидроокиси алюминия позволяет через 12-15 суток после однократного введения в дозе 1 мл свиньям обеспечить у привитых свиней формирование напряженного иммунитета против псевдомоноза продолжительностью не менее 9 месяцев (срок наблюдения). После однократного введения свиньям внутримышечно не вызывает у них поствакцинальных осложнений.

Изобретение относится к области ветеринарной медицины. Способ включает культивирование антигена, инактивацию формалином и внесение гидроокиси алюминия. В качестве антигена используют эпизоотические штаммы Pseudomonas aeruginosa серогрупп O1, O3, O4, O6, O11, O19, дающих "S" формы колоний, готовят суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры возбудителей Pseudomonas aeruginosa O1, O3, O4, O6, O11, O19 серогрупп, дающих "S"-образные формы колоний. Затем их выращивают раздельно в течение 24-36 часов на бульоне Хоттингера с рН 7,2-7,4 и разбавляют при температуре 36-37°С физиологическим раствором до концентрации 10 млрд микробных клеток в 1 мл. После чего инактивируют формалином, содержащим не менее 36% формальдегида, доводя до конечной концентрации 0,3-0,4%, и выдерживают в течение 14 суток при температуре 37-37,5°С. При этом культуру перемешивают по 20 минут 3 раза в сутки. Далее культуры смешивают в равных объемах и при непрерывном перемешивании вносят 3% раствор гидроокиси алюминия из расчета не более 25% к объему смеси культур, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают. Способ позволяет получить высокоиммуногенную вакцину, которая формирует напряженный иммунитет продолжительностью не менее 9 месяцев и не вызывает поствакцинальных осложнений.

Способ изготовления вакцины против псевдомоноза свиней, включающий культивирование антигена, инактивацию формалином и внесение гидроокиси алюминия, отличающийся тем, что в качестве антигена используют эпизоотические штаммы Pseudomonas aemginosa серогрупп O1, O3, O4, O6, O11, O19, дающих S формы колоний, готовят суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры возбудителей Pseudomonas aeruginosa O1, O3, O4, O6, O11, O19 серогрупп, дающих S-образные формы колоний, затем их выращивают раздельно в течение 24-36 ч на бульоне Хоттингера с рН 7,2-7,4 и разбавляют при температуре 36-37°С физиологическим раствором до концентрации 10 млрд микробных клеток в 1 мл, инактивируют формалином, содержащим не менее 36% формальдегида, доводя до конечной концентрации 0,3-0,4%, и выдерживают в течение 14 сут при температуре 37-37,5°С, при этом культуру перемешивают по 20 мин 3 раза в сутки, далее культуры смешивают в равных объемах и при непрерывном перемешивании вносят 3%-ный раствор гидроокиси алюминия из расчета не более 25% к объему смеси культур, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.