СПОСОБ МОДИФИКАЦИИ ЖИВОЙ КЛЕТКИ Российский патент 2009 года по МПК C12Q1/00 B82B3/00 

Предлагаемое изобретение относится к области подготовки к исследованию интактных микроструктурных биологических объектов физическими методами. Может быть использовано для визуализации и/или характеризации клетки, преимущественно - живой клетки.

Регуляция жизнеспособности клеток, выявление (обнаружение) и идентификация клеток, а также возможность пространственной манипуляции клетками с помощью различных внешних воздействий - актуальные проблемы биологии. Для достижения цели изначально интактным клеткам необходимо придать новые, нехарактерные свойства, иначе говоря, клетки необходимо определенным образом модифицировать.

Известен способ модификации клетки наночастицами [1], который заключается в помещении интактных клеток, иммобилизованных на стеклянной подложке, в суспензию наночастиц и последующей инкубации клеток в суспензии в течение 7-12 часов.

Недостатком известного способа [1] является необходимость предварительной иммобилизации клеток на стеклянную подложку, что приводит к неравномерному одностороннему покрытию клеток наночастицами и затрудняет визуализацию, чем ухудшает точность и достоверность характеризации отдельной клетки.

Известен способ модификации клетки наночастицами [2], при котором к взвеси клеток в растворе добавляют суспензию наночастиц в соотношении 3:1 и инкубируют клетки при постоянном перемешивании в течение 1 часа.

Недостатком известного способа [2] является проникновение наночастиц внутрь клетки, что обуславливает их (наночастиц) цитотоксичность и приводит к гибели клетки с потерей некоторых из практически значимых характерных особенностей.

Наиболее близким по сущности к предлагаемому изобретению является способ модификации клетки чередующейся адсорбцией противоположно заряженных полиэлектролитов [3]. В результате адсорбции клетка оказывается инкапсулированной в некую «оболочку», образованную слоями противоположно заряженных полиэлектролитов, обволакивающих клетку. Недостатком известного способа [3] является то, что качество модификации неудовлетворительное и модифицированную таким образом клетку весьма сложно охарактеризовать с достаточной полнотой или невозможно охарактеризовать ее высокоинформативными способами, например при помощи Рамановской спектроскопии.

Целью предлагаемого изобретения является повышение качества модификации поверхности живой клетки в процессе подготовки клетки к исследованиям с сохранением ее (клетки) жизнеспособности.

Цели достигают тем, что в полимерные слои электролитов включают наночастицы, используя послойное чередующееся нанесение полиэлектролитов и наночастиц на поверхность клетки.

Предлагаемый способ может быть осуществлен, например, поэтапно следующим путем.

Предположим, что поверхность подлежащих модификации (интактных) клеток заряжена отрицательно.

1 - этап. Берут емкость, например пробирку №1, и заполняют ее раствором полиэлектролита со знаком, противоположным заряженности поверхности подлежащих модификации (интактных) клеток. В настоящем примере пробирку заполняют раствором положительно заряженного полиэлектролита, например, поли(аллиламин) гидрохлорида, в объеме 1,0 мл. Подлежащие модификации клетки берут, например пипеткой в объеме 0,1 мл и при непрерывном перемешивании вносят (клетки) в пробирку №1 с раствором положительно заряженного полиэлектролита. То есть с соблюдением соотношения объема полиэлектролита к объему клеток, как 10:1. Раствор полиэлектролита с внесенными клетками перемешивают, псевдоравномерно распределяя полиэлектролит на поверхности клеток. Затем при комнатной температуре и атмосферном давлении находящиеся в пробирке №1 с электролитом клетки инкубируют, например в течение 15 мин на качалке. Полученную суспензию клеток центрифугируют и удаляют избыток полиэлектролита. Оставшийся после центрифугирования осадок промывают путем ресуспендирования в бидистилированной воде. И получают клетки, покрытые одним слоем положительно заряженного полиэлектролита. Для удобства изложения полученные в результате выполнения 1-го этапа клетки далее назовем сокращенно первично модифицированные клетки ПМК.

2. Берут другую пробирку - №2 и заполняют ее раствором отрицательно заряженного полиэлектролита, например поли(стирен) сульфоната, в объеме 1,0 мл. Первично модифицированные клетки берут, например пипеткой в объеме 0,1 мл и при непрерывном перемешивании вносят в пробирку №2 с раствором отрицательно заряженного полиэлектролита. То есть с соблюдением соотношения объема полиэлектролита к объему клеток, как 10:1. Раствор полиэлектролита - поли(стирен) сульфоната с внесенными первично модифицированными клетками перемешивают, равномерно распределяя полиэлектролит на поверхности ПМК. Затем при комнатной температуре и атмосферном давлении находящиеся в пробирке №2 с электролитом клетки инкубируют, например в течение 15 мин на качалке. Полученную суспензию клеток центрифугируют и удаляют избыток полиэлектролита. Осадок, оставшийся после центрифугирования, промывают путем ресуспендирования в бидистилированной воде. И получают клетки, покрытые двухслойной пленкой (слоем положительно заряженного и слоем отрицательно заряженного полиэлектролитов). Для удобства изложения полученные в результате выполнения 2-го этапа клетки далее назовем сокращенно вторично модифицированные клетки ВМК.

3. Берут вторично модифицированные клетки и с использованием пробирки №3 выполняют действия, как на этапе первом, используя вместо интактных клеток вторично модифицированные клетки ВМК. Для удобства изложения полученные в результате выполнения 3-го этапа клетки далее назовем сокращенно третично модифицированные клетки ТМК.

4. Берут пробирку №4, заполняют ее водной суспензией наночастиц, имеющих отрицательный заряд, например стабилизированных цитратом натрия частиц золота (далее по тексту наночастиц), в объеме 1,0 мл. Полученную на этапе 3 третично модифицированные клетки берут пипеткой, например в объеме 0,1 мл. При непрерывном перемешивании ТМК вносят в пробирку №4 с суспензией наночастиц (то есть с соблюдением соотношения объема наночастиц к объему клеток, как 10:1). Суспензию наночастиц с внесенными клетками перемешивают, псевдоравномерно распределяя наночастицы на поверхности третично модифицированных клеток ТМК. При комнатной температуре и атмосферном давлении клетки инкубируют, например 30 мин на качалке. Полученную суспензию клеток (с наночастицами на поверхности ТМК) центрифугируют и удаляют избыток наночастиц. Осадок, оставшийся после центрифугирования, промывают путем ресуспендирования в бидистилированной воде. Получают клетки, модифицированные тремя слоями полиэлектролитов и одним слоем наночастиц. Для удобства изложения такие клетки далее назовем сокращенно модифицированные наночастицами клетки МНК.

5. Берут МНК и с использованием пробирки №5 выполняют действия, как на этапе первом, используя вместо интактных клеток модифицированные наночастицами клетки МНК. Для удобства изложения полученные в результате выполнения 5-го этапа клетки далее назовем сокращенно пятикратно модифицированные клетки ПКМК.

6. Берут клетки ПКМК и с использованием пробирки №6 выполняют действия, как на этапе втором, используя пятикратно модифицированные клетки ПКМК вместо первично модифицированных клеток ПМК.

В итоге последовательного выполнения вышеописанных действий 6-ти этапов получают необходимые клетки с модифицированной поверхностью. Этим клеткам свойственны следующие особенности. Каждая из клеток покрыта многослойной пленкой, состоящей из полиэлектролитов - прилегающий к поверхности клетки слой положительно заряженный, затем - слой отрицательно заряженный, слой положительно заряженный с включением слоя наночастиц, слой отрицательно заряженный. При этом наночастицы от оболочки клетки отделены слоями полиэлектролитов, препятствующих проникновению наночастиц внутрь клетки. Это сохраняет жизнеспособность модифицированной клетки при определении ее характеристик, например высокоинформативными методами флуоресцентной микроскопии, Рамановской спектроскопии.

Приведенным примером не ограничивается возможность осуществления способа. Так, без ущерба для осуществления способа можно предполагать, что изначальная заряженность поверхности интактных клеток положительная. В этом случае изменяют последовательность нанесения полиэлектролитов. На первом этапе на поверхность клеток адсорбируют отрицательно заряженный полиэлектролит и получают первично модифицированные клетки ПМК. Затем совершают действия второго этапа - на образовавшийся слой адсорбируют положительно заряженный полиэлектролит и получают вторично модифицированные клетки ВМК.

Затем совершают действия третьего этапа - на образовавшийся слой адсорбируют отрицательно заряженный полиэлектролит и получают третично модифицированные клетки ТМК. На четвертом этапе на ТМК наносят наночастицы с положительным зарядом. После чего выполняют действия пятого этапа - на поверхность модифицированных наночастицами клеток адсорбируют отрицательно заряженный полиэлектролит. С соблюдением такого же порядка выполняют действия 6-го этапа и получают необходимым образом модифицированные клетки.

Для модификации живой клетки используют наночастицы, имеющие различную геометрическую форму и размерности структурных элементов в зависимости от цели модификации и характерных особенностей модифицируемой клетки. Например, идентификацию (визуализацию и характеризацию) микроорганизмов, имеющих различные конфигурации, например - микробов шаровидных (кокков), палочковидных (бацилл), спиралевидных (вибрионов и спирилл), микроскопических грибов в виде мицелий, конидий, - производят, модифицируя живые клетки этих микроорганизмов наночастицами, имеющими геометрическую форму пластин, конусов, трубок, волокон, например, в виде нитей, стержней. Конфигурацию используемых (для модификации клеток) наночастиц выбирают с учетом особенностей строения клеток модифицируемого микроорганизма, например их конфигурации, размера, обеспечивая оптимальные условия взаимодействия клетки с наночастицами. Под условиями взаимодействия подразумевают, например, способность улавливания наночастицей клеток модифицируемого микроорганизма из массива клеток других разнообразных микроорганизмов (модификация которых не является целью в конкретном случае).

Приведенные примеры осуществления предлагаемого изобретения показывают его полезность для модификации живых клеток, например для селективного определения и характеризации клеток ранее неизвестного микроорганизма, для классификации микроорганизмов. Модифицированные предлагаемым способом живые клетки приобретают новые свойства, которые позволяют осуществлять пространственные манипуляции ими (клетками) с помощью различных внешних воздействий. Приобретенные в результате модификации свойства полезны и в решении задач практической медицины, ветеринарии, экологии.

Кроме того, применение предлагаемого способа модификации клеток позволяет определить, охарактеризовать и единичную клетку. Это способствует, например, выявлению ранее неизвестных заболеваний на ранних стадиях, когда лечение наиболее эффективно, производится с меньшей затратой лечебных препаратов, труда и времени медицинских работников, с наименьшим ущербом для здоровья пациентов - по сравнению с лечением болезней в поздней, запущенной стадии.

Модификации предлагаемым способом могут быть подвержены как живые, так и неживые клетки. Исходя же из цели предлагаемого изобретения в качестве примера рассмотрены только живые клетки.

Предлагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как при определении уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.

Способ модификации имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками данного изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.

Заявленное техническое решение можно реализовать в промышленном производстве диагностического оборудования, в деятельности организаций здравоохранения, животноводства посредством использования известных стандартных технических устройств и оборудования. Это соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям.

Достоверное определение характеристик клетки нередко требуется при решении задач медицинской и ветеринарной практики, например при определении особенностей строения и жизнедеятельности носителей ранее неизвестных болезней, например в процессе поиска средств профилактики и/или лечения этих болезней.

Использованные источники

1. Berry, V. Highly Selective, Electrically Conductive Monolayer of Nanoparticles on Live Bacteria / V.Berry, S.Rangaswamy, R.F.Saraf // Nano Letters. - 2004. - V.46. - P.939-942.

2. Safarik, I. New magnetically responsive yeast-based biosorbent for the efficient removal of water-soluble dyes/1. Safarik, L.F. Teixeira Rego, M.Borovska, E.Mosiniewicz-Szablewska, F.Weyda, M.Safarikova // Enzyme and Microbial Technology. - 2007. - V.40. - P.1551-1556.

3. Diaspro, A. Single living cell encapsulation in nano-organized polyelectrolyte shells/A.Diaspro, D.Silvano, S.Krol, O.Cavalleri, A.Gliozzi // Langmuir. - 2002. - V.18. - P.5047-5050.

Изобретение относится к биотехнологии. Живую клетку модифицируют, используя послойное чередующееся нанесение полиэлектролитов и наночастиц на поверхность клетки. Изобретение может быть использовано для визуализации и/или характеризации клетки, при этом повышается качество модификации поверхности живой клетки в процессе подготовки клетки к исследованиям с сохранением ее жизнеспособности. 4 з.п. ф-лы.

1. Способ модификации поверхности живой клетки адсорбцией противоположно заряженных полиэлектролитов, отличающийся тем, что в многослойную пленку полиэлектролитов включают слой наночастиц.

2. Способ модификации поверхности живой клетки по п.1, отличающийся тем, что в многослойную пленку полиэлектролитов включают слой наночастиц в виде нанотрубок.

3. Способ модификации поверхности живой клетки по п.1, отличающийся тем, что в многослойную пленку полиэлектролитов включают слой наночастиц в виде нановолокон.

4. Способ модификации поверхности живой клетки по п.1, отличающийся тем, что в многослойную пленку полиэлектролитов включают слой наночастиц в виде наноконусов.

5. Способ модификации поверхности живой клетки по п.1, отличающийся тем, что в многослойную пленку полиэлектролитов включают слой наночастиц в виде нанопластин.