СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АУТОАНТИТЕЛ И СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АУТОИММУННОГО ТИРЕОИДИТА Российский патент 2008 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, бионанотехнологии и может быть использовано в диагностике аутоиммунных заболеваний, в частности аутоиммунного тиреоидита (АИТ).

Известен способ определения аутоантител к ДИК в сыворотке крови больных системной красной волчанкой (СКВ) методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) (Z.Amirghofran et aL, «Determination of anti-ds-DNA antibody levels in patients with systemic lupus erythematosus by ELISA, MA and Crithidia methods: changes in antibodies prior to disease activity», Im Med Sci 2000; (1,2):36-41). В данном способе определение антител к ДИК производится за счет специфического взаимодействия ДНК, сорбированной на планшете, с антителами к ДНК, содержащимися в исследуемой сыворотке крови. Образовавшийся комплекс «антиген-антитело» выявляют с помощью конъюгата, пероксидаза которого катализирует расщепление субстрата (перекиси водорода), вызывающего изменение окраски хромогена. Наиболее часто антитела к ДНК обнаруживают у больных системной красной волчанкой (в 50-90% случаев), системной склеродермией, ревматоидным артритом. Предварительно проведенные исследования уровня аутоантител к ДНК в сыворотке больных аутоиммунным тиреоидитом методом ИФА достоверных отличий между здоровыми и больными аутоиммунным тиреоидитом не выявили. Кроме того, недостатком данного способа является то, что он основан на сложной многоступенчатой методике, требует больших затрат времени и дорогостоящих оборудования и реактивов, специальной подготовки персонала.

Известен способ определения каталитических аутоантител к ДНК и способ диагностики системных аутоиммунных заболеваний (СКВ, склеродермия, ревматоидный артрит, псориаз) с его использованием. (Патент №2173464, G01N 33/483, 2001).

Недостатком данного способа является то, что он предусматривает выделение фракции IgG из сыворотки крови, последующий электрофоретический и количественный анализ каталитической активности выделенных антител методом линейного дихроизма, в связи с чем увеличиваются экономические затраты, повышается трудоемкость и увеличивается время проведения исследования.

Известен способ определения антител (или антигенов), в котором на твердой поверхности пьезокварцевого резонатора на основе поверхностно-акустических волн (ПАВ-резонатор), имеющего опорную и измерительную линии задержки поверхностно-акустических волн, формируют монослой специфических антигенов или антител, на поверхность измерительной линии наносят известное количество анализируемого раствора, инкубируют во влажной камере, промывают, высушивают, измеряют разность прохождения акустической волны в опорной и измерительной линиях задержки и по калибровочной кривой находят количество специфических антител (или антигенов). (Авторское свидетельство №1478122 SU, G01N 33/53, 1989).

К недостаткам известного способа можно отнести то, что масс-чувствительность ПАВ-резонатора зависит от упругих свойств осаждаемого слоя, а это приводит к необходимости проводить предварительную градуировку по исследуемому веществу. При этом повышение чувствительности за счет увеличения частоты колебаний ПАВ-резонатора способствует уменьшению добротности и приводит к потере стабильности. При использовании ПАВ-резонатора, который обладает большой масс-чувствительностью, имеет место дестабилизирующее влияние окружающей среды на ПАВ-резонатор, а также то, что генераторы ПАВ не отличаются температурной стабильностью, а при больших масс-нагрузках возникают перескоки частоты.

Наиболее близким к заявленному является способ определения антител к ДНК по изменению частоты колебаний пьезокварцевого резонатора на твердой поверхности электродов пьезокварцевого резонатора L-полилизина, антигена - ДНК с последующей инкубацией пьезокварцевого резонатора в сыворотке крови, разведенной в буфере («ДНК-модифицированный наносенсор на основе пьезоэлектрического кварцевого резонатора», Коновалова О.А. и др. Седьмая Всероссийская Молодежная научная школа «Когерентная оптика и оптическая спектроскопия», Казань, 2003, с.215-221).

Однако для того, чтобы данный метод мог быть использован для диагностики аутоиммунного тиреоидита, необходимо его усовершенствование до получения достоверных данных, позволяющих сделать вывод о возможности использования его для диагностики аутоиммунного тиреоидита.

В основу настоящего изобретения положена задача создания способа определения аутоантител к ДНК, который может быть использован в диагностике аутоиммунного тиреоидита.

Поставленная задача решается так, что в способе определения аутоантител по изменению частоты колебаний пьезокварцевого резонатора на основе объемно-акустических волн до и после поэтапной иммобилизации на твердой поверхности электродов пьезокварцевого резонатора L-полилизина, антигена - ДНК с последующей инкубацией пьезокварцевого резонатора в сыворотке крови, разведенной в буфере, электроды берут серебряные или золотые, L-полилизин берут в водном растворе 1,75 мг/мл и в объеме равном 10 мкл, и после нанесения его на электрод выдерживают в насыщенной водяными парами камере в течение 4 часов, затем отмывают и сушат, а антиген - ДНК берут в концентрации 0,68 мг/мл, разведенной в буфере 0,01 М Трис-HCl, 0,01 М ЭДТА, в объеме 10 мкл и после нанесения на электрод выдерживают в камере, насыщенной водяными парами в течение 1 часа, затем промывают и сушат, а инкубацию пьезокварцевого резонатора в сыворотке крови осуществляют в течение 1 часа в камере, насыщенной водяными парами, промывают и высушивают.

Известен способ диагностики аутоиммунных заболеваний, включающий клинико-лабораторные исследования, электрофоретический количественный анализы выделенных каталитических аутоантител (CU S.Paul et al.. Characterization of Thyroglobulin- Directed and Polyreactive Catalytic Antibodies in Autoimmune Disease., J. Immunology, v.159, p.1532, 1997).

Недостатком этого способа является то, что количественная оценка аутоимунного процесса проводится по регистрации радиоактивной метки, временной интервал которой составляет 12-21 час, из-за длительной инкубации исследуемых сывороток с тиреоглобулином.

Наиболее близким к заявляемому способу диагностики аутоиммунного тиреоидита является способ диагностики аутоиммунных заболеваний, включающий клинико-лабораторные исследования, электрофоретический и количественный анализ каталитических аутоантител, согласно которому диагностику проводят по количеству распрямленной плазмидной ДНК и при получении менее 25% линейной формы плазмидной ДНК диагностируют отсутствие аутоиммунного процесса, от 25 до 50% перевода суперскрученной ДНК в линейную форму диагностируют низкую степень активности иммунного процесса и свыше 50% - активность высокой степени (патент РФ №2173464, G01N 33/483, 2001).

Недостатком способа является его сложность, длительность и дороговизна, что практически привело к тому, что он не нашел применения в медицинской практике.

В предлагаемом способе диагностики аутоиммунного тиреоидита, включающем клинико-лабораторные исследования и определение аутоантител к ДНК, определение аутоантител к ДНК осуществляют способом по п.1 формулы изобретения, причем при показателе частоты колебаний пьезокварцевого резонатора в пределах Δf=124,50±13,84 Гц судят о наличии аутоиммунного тиреоидита у исследуемого.

Пьезокварцевый резонатор представляет собой кварцевую пластину (1), по обе стороны которой расположены металлические электроды (2) и контакты (3) (фиг.1). Используют, например, золотые или серебряные электроды. Пьезокварцевый резонатор (4) с помощью контактов соединен с генератором (5), подающим напряжение и обеспечивающим колебание резонатора. Для регистрации частоты колебаний ПКР применяют электронно-счетный частотомер АСН-1300 (6), который управляется от персонального компьютера (7) через последовательный порт RS232 с максимальной скоростью 19200 Бод (фиг.2).

Резонансная частота пьезокварцевого резонатора зависит от массы электродов и от массы иммобилизованных на поверхности электродов веществ. Изменение массы нанесенных слоев обусловливает изменение (сдвиг) частоты колебаний резонатора. (Малов В.В. «Пьезорезонансные датчики», М., 1989).

В качестве исследуемого раствора берут сыворотку крови.

На электроде ПКР путем иммобилизации из раствора последовательно формируют слои-предшественники: L-полилизин и ДНК. L-полилизин достаточно прочно связывается с поверхностью металлического электрода и играет роль «подложки» для последующей посадки ДНК. Прочное связывание ДНК и L-полилизина происходит вследствие сил электростатического взаимодействия (L-полилизин имеет положительный суммарный заряд, а ДНК за счет фосфатных группировок заряжена отрицательно). На подготовленную поверхность иммобилизируют сыворотку крови. После формирования каждого слоя измеряется сдвиг частоты колебаний ПКР.

Процесс осуществляют в несколько этапов:

1этап. Перед началом работы измеряют базовую частоту колебаний ПКР АТ-среза с частотой колебаний 8 МГц (кварцевый кристалл d=13 мм) золотыми электродами (d=6 мм) производства ОАО «Морион», Санкт-Петербург. На чистую поверхность золотого электрода ПКР наносят 10 мкл водного раствора L-полилизина (1,75 мг/мл), помещают в насыщенную водяными парами камеру на 4 часа при +4°С, затем отмывают в течение 15 минут в 30 мл дистиллированной воды в стеклянном стаканчике при постоянном перемешивании на магнитной мешалке, высушивают в термостате при 37°С в течение 30 минут.

2 этап. На сформированный слой L-полилизина наносят 10 мкл раствора нативной ДНК эритроцитов цыплят производства Reanal, Hungary (0,68 мг/мл, разведенной в буфере 0,01М Трис-HCl, 0,01М ЭДТА), оставляют на 1 час в насыщенной парами камере при +4°С, затем отмывают и высушивют как на 1 этапе.

После нанесения каждого слоя регистрируют изменение частоты колебаний ПКР.

3 этап. ПКР инкубируют в образце сыворотки крови, разведенной 1:100 в буфере 0,01М Трис-HCl, 0,01М ЭДТА, в течение 1 часа в насыщенной водяными парами камере при +4°С, промывают и высушивают, как описано в 1 этапе, и измеряют сдвиг частоты колебаний резонатора. По величине сдвига частоты колебаний ПКР судят о содержании аутоантител к ДНК в сыворотке крови.

Зависимость частоты колебаний от массы нанесенного вещества описывается уравнением Зауэрбрея:

где Δf - изменение резонансной частоты колебаний пьезокварцевого резонатора при нанесении исследуемого вещества f₀-f или сорбции определяемого соединения, Гц; f₀ - резонансная (базовая) частота колебаний пьезокварцевого резонатора, Гц; Δm - масса нанесенного покрытия, г; S - площадь электродов пьезокварцевого резонатора, см².

На содержание аутоантител к ДНК исследованы сыворотки 9 больных АИТ (опыт), 2 больных СКВ (положительный контроль) и 3 доноров (отрицательный контроль). Сыворотка больных системной красной волчанкой использована как положительный контроль, так как данное заболевание является классическим аутоиммунным заболеванием, при котором присутствие аутоантител к ДНК в сыворотке крови изучено. Всем больным проводят полное клинико-лабораторное обследование. Для подтверждения диагноза АИТ проводят консультацию эндокринолога и ультразвуковое исследование (УЗИ) щитовидной железы, определяют содержание антител к микросомальной фракции иммуноферментным методом в сыворотке крови. Диагноз СКВ подтвержден по клинической картине болезни, наличию в крови LE-клеток и специфических антинуклеарных антител. Показано, что и у здоровых, и у больных АИТ и СКВ наблюдается изменение частоты колебаний ПКР, но у больных сдвиг частоты значительно больше: у здоровых Δf=74,00±4,56 Гц, у больных АИТ Δf=124,50±13,84 Гц, у больных СКВ Δf=144,00±2,00Гц.

При использовании заявленного способа определения аутоантител к ДНК установлена достоверная разница между группой здоровых и больных АИТ (р<0,01), между группой здоровых и больных СКВ (р<0,001).

Пьезокварцевый резонатор является устройством многоразового использования. Перед каждым последующим опытом поверхность электрода ПКР очищали раствором 1 М гидроксида натрия и 30% перекиси водорода в соотношении 1:1, затем последовательно промывали дистиллированной водой, 96% этиловым спиртом, дистиллированной водой и высушивают. Такой метод очистки позволяет полностью освободить поверхность электрода ПКР от ранее нанесенных слоев, что подтверждается восстановлением частоты колебаний ПКР до базовых значений. Стабильная повторяемость результатов получена при использовании ПКР с золотыми электродами до 30 раз.

Пример 1.

Больная Е.А.А., 36 лет, аутоиммунный тиреоидит, по клинико-лабораторным данным гипертрофическая форма (объем щитовидной железы 26,4 мл), субклинический гипотиреоз (ТТГ 9,1 мкМЕ/мл, свободный Т4 14,5 нмоль/л, общий Т4 92,2 нмоль/л, общий Т3 1,1 нмоль/л), высокая степень аутоиммунного процесса (антитела к микросомальной фракции +++1,9 ед. (норма не более 0,3 ед.), выраженные фиброзные изменения в щитовидной железе по данным УЗИ). Сдвиг частоты колебаний ПКР составил 134 Гц. Разница с сывороткой крови здорового донора 60±4,56 Гц.

Пример 2.

Больная У.Р.А., 43 года, системная красная волчанка, по клинико-морфологической характеристике поражений: симптом «бабочки», экссудативная эритема кожи, умеренный миокардит, титры антинуклеарных антител повышены в 2 раза. Сдвиг частоты колебаний ПКР составил 146 Гц. Разница с сывороткой здорового донора 72±4,56 Гц.

Приведенный способ определения аутоантител к ДНК за счет включения в процесс дополнительных операций и условий его проведения позволил достичь большей его чувствительности и более точного определения аутоантител, что в свою очередь позволяет использовать его для диагностики аутоиммунного тиреоидита и при сдвиге частоты колебаний пьезокварцевого резонатора в пределах Δf=124,50±13,84 Гц судить о наличии заболевания у исследуемого.

Изобретение относится к области медицины и бионанотехнологии. Определение аутоантител осуществляют по изменению частоты колебаний пьезокварцевого резонатора на основе объемно-акустических волн до и после поэтапной иммобилизации на твердой поверхности электродов пьезокварцевого резонатора L-полилизина, антигена-ДНК и последующей инкубации пьезокварцевого резонатора в сыворотке крови. При этом электроды берут серебряные или золотые, L-полилизин берут в водном растворе 1,75 мг/мл в объеме 10 мкл, ДНК берут в концентрации 0,68 мг/мл, разведенной в буфере 0,01 М Трис-HCl, 0,01 М ЭДТА в объеме 10 мкл. Инкубацию пьезокварцевого резонатора в сыворотке крови осуществляют в течение 1 часа в камере, насыщенной водяными парами, промывают и высушивают. При показателе сдвига частоты колебаний пьезокварцевого резонатора в пределах Δf=124,50±13,84 Гц диагностируют аутоиммунный тиреоидит. Использование способа позволяет повысить точность и достоверность определения антител к ДНК и, в частности, диагностики аутоиммунного тиреоидита. 2 с.п. ф-лы, 2 ил.

1. Способ определения аутоантител по изменению частоты колебаний пьезокварцевого резонатора на основе объемно-акустических волн до и после поэтапной иммобилизации на твердой поверхности электродов пьезокварцевого резонатора L-полилизина, антигена- ДНК и последующей инкубацией пьезокварцевого резонатора в сыворотке крови, разведенной в буфере, отличающийся тем, что электроды берут серебряные или золотые, L-полилизин берут в водном растворе 1,75 мг/мл в объеме 10 мкл и после нанесения на электрод выдерживают в насыщенной водяными парами камере в течение 4 ч, затем отмывают и сушат, а ДНК берут в концентрации 0,68 мг/мл, разведенной в буфере 0,01 М Трис-HCl, 0,01 М ЭДТА в объеме 10 мкл и после нанесения на электрод выдерживают в камере, насыщенной водяными парами в течение 1 ч, затем промывают и высушивают, а инкубацию пьезокварцевого резонатора в сыворотке крови осуществляют в течение 1 ч в камере, насыщенной водяными парами, промывают и высушивают.2. Способ диагностики аутоиммунного тиреоидита, включающий клинико-лабораторные исследования, определение аутоантител к ДНК, отличающийся тем, что определение аутоантител к ДНК осуществляют с использованием способа по п.1 формулы, причем при показателе сдвига частоты колебаний пьезокварцевого резонатора в пределах Δf=124,50±13,84 Гц судят о наличии заболевания у исследуемого.