СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ ДРОЖЖЕЙ Российский патент 2010 года по МПК C12N1/16 C12N1/22 A23K1/00 C12R1/72 C12R1/865 

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологической, комбикормовой и перерабатывающей промышленности и может быть использовано для получения биомассы дрожжей путем их выращивания на питательных средах на основе зерносырья и отходов мукомольного производства для использования ее в качестве кормовой добавки в рацион с/х животных и птицы.

Уровень техники

Растительное сырье содержит 30-80% крахмала, 3-20% белка, 3-25% клетчатки. При этом низкое содержание незаменимых аминокислот и витаминов обуславливает малую эффективность их прямого скармливания животным. Одним из способов повышения качества растительных кормовых добавок является обогащение растительного сырья белком дрожжей. При этом актуальной проблемой является обеспечиваемая специальными стимуляторами интенсификация роста клеток дрожжей.

В качестве стимуляторов используются как отдельные вещества, такие как витамины, аминокислоты, микроэлементы, поверхностно-активные вещества, пуриновые или пирамидиновые основания, так и смеси сложного состава - композиционные биостимуляторы. Выявлен синергический эффект действия таких стимуляторов, заключающийся в том, что прирост биомассы при совместной их подаче выше, чем арифметическая сумма приростов биомассы при их раздельной подаче. Концентрация же каждого из стимуляторов по сравнению с количеством, необходимым для достижения аналогичного эффекта при их раздельной подаче, резко снижается.

Использование стимуляторов роста клеток в процессе получения биомассы как при периодическом, так и при непрерывном культивировании приводит к более полной утилизации субстрата, что позволяет повышать эффективность роста дрожжей при сниженных расходных коэффициентах по сырью и электроэнергии.

Известен способ выращивания дрожжей в условиях аэрации на минеральных питательных средах, содержащих источники углерода, азота, фосфора и микроэлементов с использованием в качестве стимулятора роста дрожжей одной или нескольких α-аминокарбоновых кислот, входящих в состав натуральных компонентов, таких как аргинина, лейцина и лизина, а также витаминов группы В, особенно пантотеновой кислоты, и пиридоксина (патент Франции №1538957, кл. С12С, 1969 г.)

Недостатком известного способа является высокая стоимость используемых исходных продуктов.

Известен способ выращивания дрожжей с использованием в качестве стимулятора роста кротонбетаина и бутилбетаина (патент Японии №54-17026, кл. С12С 11/08, 1979 г.). Однако действие стимуляторов проверено только в периодических условиях путем встряхивания колб при низких концентрациях биомассы. Другим недостатком известного способа является значительный расход кротонбетаина и бутилбетаина, который составляет 0,1 мг на 1 л питательной среды.

Наиболее близким аналогом предлагаемого способа по технической сущности и достигаемому эффекту, принятым в качестве прототипа, является способ выращивания дрожжей родов Pichia, Sacharomyces Schia saccharomyces, Candida и Torulopsis на средах с углеводородами, углеводами, спиртами или органическими кислотами, в котором в качестве стимулятора роста используют культуральную жидкость, полученную после выращивания нуждающихся в тиамине дрожжей, где для выращивания нуждающихся в тиамине дрожжей используется питательная среда, обогащенная биотином, пантотенатом кальция, фолевой кислотой, инозитом, α-аминобензойной кислотой, пиридоксином, рибофлавином, тиамином, причем после прекращения роста дрожжей клетки отделяют центрифугированием и культуральную жидкость добавляют в исходную среду (патент Японии №54-1946 г., кл. С12С 11/20, 1971 г.).

При использовании для стимуляции роста дрожжей 0,1-10,0% применяемой в прототипе культуральной жидкости отмечается прирост биомассы на 7-30% или увеличение выхода биомассы на 5-15%.

Недостатком прототипа является то, что стимулирующий эффект используемой культуральной жидкости проявляется лишь в сочетании с перечисленными витаминами, что делает способ весьма дорогим и экономически малоэффективным.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является увеличение прироста биомассы, снижение затрат на ее получение и повышение качества готового продукта по содержанию белка.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что способ получения биомассы дрожжей включает культивирование дрожжей в условиях аэрации при температуре 25-40°С и рН 3,0-6,0 на смешанной углеводсодержащей питательной среде, содержащей источники углерода, азота и (функционально необходимые минеральные добавки и стимуляторы роста, в качестве питательной среды используют гидролизаты или ферментолизаты зерносырья и/или отходов мукомольного производства, а также биостимуляторы роста клеток дрожжей, включающие антиоксиданты органической и неорганической природы, вес.%: сульфит натрия (1·10^-4-1·10^-8), в качестве фитогормонов - гиббереллиновые кислоты (1·10^-7-1·10^-12), водорастворимые олигосахариды хитина (1·10^-5-1·10^-9), конкретная концентрация которых определяется биотехнологическими задачами, при их общей концентрации (1·10^-5-1·10^-10) % к объему.

В качестве микроорганизмов используют штаммы дрожжей Sacharomyses serevisiae, Candida scotti.

В качестве источника углерода используют углеводсодержащие субстраты: гидролизаты или ферментолизаты зерносырья и/или отходов мукомольного производства.

По окончании процесса культивирования, биомассу отделяют, а отработанную культуральную жидкость возвращают в процесс культивирования дрожжей, предварительно обработав перегретым водяным паром до установления температуры жидкой фазы 80-95°С.

Осуществление изобретения

Выращивание дрожжей проводят в непрерывных или периодических условиях при перемешивании и аэрации среды кислородосодержащим газом, например воздухом, в присутствии источника азота, например фосфорнокислых или сернокислых солей аммония, источников фосфора, например фосфатов, минеральных солей калия, магния и микроэлементов - солей железа, цинка, марганца и др.

В качестве микроорганизма - продуцента белка - используют штаммы дрожжей Sacharomyses serevisiae, Candida Scotti.

В качестве источника углерода используют углеводсодержащие субстраты; гидролизаты или ферментолизаты зерносырья и/или отходов мукомольного производства.

Многокомпонентный композиционный биостимулятор (КБС) включает антиоксиданты органической и неорганической природы, вес.%: сульфит натрия (1·10^-4-1·10^-8), в качестве фитогормонов - гиббереллиновые кислоты (1·10^-7-1·10^-12), водорастворимые олигосахариды хитина (1·10^-5-1·10^-9), со степенью полимеризации 3-8, получаемые обработкой концентрированной серной кислотой хитина, образующегося в качестве отхода при выделении мяса ракообразных животных (RU №2126012 С1, кл. С07Н 3/06, 1997 г.), при их общей концентрации (1·10^-5-1·10^-10) % к объему.

Состав и соотношение указанных компонентов выбирают по известным их свойствам в зависимости от технических требований к продукту. В таких случаях их удобно называть по номерам - КБС₁, КБС₂ и т.д.

При этом отдельные компоненты композиционного биостимулятора подают в аппараты для выращивания биомассы либо одновременно, т.е. синхронно, либо раздельно, чередуя их подачу, в количестве (1×10^-5-1×10^-10)% к объему. Меньшее значение диапазона не дает требуемого эффекта, а большее - снижает экономическую эффективность способа из-за значительных затрат на приобретение компонентов.

В аппарат чистой культуры биостимулятор подают непосредственно после подачи в него инокулята и выращивают дрожжи в периодическом режиме, после чего активированную биомассу дрожжей переводят в ферментер, куда вводят композиционный биостимулятор целиком или периодическими порциями.

Выращивание дрожжей проводят при температуре 25-40°С и при рН 3,0-6,0 при непрерывном процессе как в одну, так и в несколько стадий.

По окончании процесса выращивания биомассу отделяют, а жидкую фазу, т.е. отработанную культуральную жидкость (ОКЖ), остающуюся после выделения целевого продукта, возвращают в процесс выращивания через аппарат для приготовления гидролизата растительного сырья. При этом перед подачей на стадии разжижения или осахаривания зерносырья ОКЖ подвергают обработке перегретым водяным паром до установления температуры жидкой фазы 80-95°С.

Примеры реализации способа

Пример 1. Готовят питательную среду, для чего 37,5 г дерти и 87,5 г ржаных отрубей заливают 875 мл водопроводной воды. Гидромодуль: твердая и жидкая фракции - 1: 7. Суспензию подвергают термообработке на кипящей водяной бане в течение 4-х часов при рН 6,7. После термообработки смесь охлаждают до комнатной температуры, доводят с помощью 10%-ной серной кислоты рН до 5,0 и добавляют соли: 3 г/л (NH₄)₂SO₄ и 0,8 г/л КH₂PO₄, после чего к суспензии добавляют 2 г/л ферментного препарата глюкаваморина ГЗХ. Ферментолиз проводят в течение 5 часов, после чего суспензию термостатируют в течение 1,5 часа на водяной бане.

Дрожжи Sacharomyses serevisiae ВКПМ-у-1985 выращивают в колбах на качалке с 200-240 об/мин, при температуре 32-34°С в течение 20 часов с объемом питательной среды 100 мл.

В питательную среду добавляют в качестве стимулятора композиционный биостимулятор КБС₁ в количестве 1×10^-10, содержащий, вес.%: сульфит натрия 1,0·10^-4-1·10^-8; гиббереллиновую кислоту 1·10^-7-10^-12; хитиновые олигосахариды 1·10^-5 1·10^-9.

В контрольных опытах в питательную среду стимуляторы не добавляют.

При введении в ферментационную среду композиционного биостимулятора содержание остаточных РВ снижается па 50%, концентрация сухих веществ возрастает на 6,2%, а содержание белка увеличивается на 15%.

Пример 2. Дрожжи Candida scotti ВСБ-775 выращивают но примеру 1.

При введении в ферментационную среду композиционного биостимулятора степень биоконверсии сырья возрастает почти на 24%, ЛСВ увеличивается на 17,3%, а содержание сырого протеина увеличивается на 5,6% (19,7 отн.%).

Пример 3. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae diastaticus (ВКПМ-у-1218) выращивают в непрерывном режиме в промышленном аппарате с V=1000 м³ (V_раб=500 м³) на ферментативном гидролизате зсрносырья. В аппарат подают композиционный биостимулятор КБС₁ в количестве 10^-9% (вес/объем).

Технологические показатели работы промышленного аппарата представлены в табл.1.

Табл.1. № п/п Вариант Проток м³/час Время выращивания, час АСВ% Расходный коэфф. по зерносырью Сырой протеин % Белок по Барнштейну, % Выработка дрожжей ЛСВ. т/сут 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1. Контроль 54 8,0 8,2 1,55 39,8 29,0 80,7 2. Опыт 67 7,2 8,9 1,42 41,2 30,8 106,7

Таким образом, введение в питательную среду с гидролизатом зерносырья композиционного биостимулятора КБС₁ позволяет существенно интенсифицировать процесс выращивания дрожжей, что проявляется в увеличении протока на 13 м³/час (24 отн.%), уменьшении времени выращивания на 10 отн.%, увеличении суточной выработки дрожжей на 26 т/сут (32 отн.%), снижении расходного коэффициента на 8,4 отн.%. При этом улучшается качество готового продукта, что проявляется в увеличении содержания сырого протеина на 3,5 отн.% и белка по Барнштейну на 5,2 отн.%.

Пример 4. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae diastaticus (ВКПМ-у-1218) выращивают в непрерывном режиме в промышленном аппарате с V_раб=1000 м³ (V_раб=500 м³) на ферментативном гидролизате зерносырья. В аппарат подают композиционный биостимулятор КБС₂ в количестве 10^-8 % к объему.

Технологические показатели работы промышленного аппарата прадставлены в табл.2.

Табл. 2 № п/п Вариант Проток, м³/час Время выращивания час АСВ, % Расходный коэфф. по зерносырью Сырой протеин, % Белок по Барнштейну, % Выработка дрожжей АСВ, т/сут 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1. Контроль 54 8,2 8,2 1,55 40,5 29,0 80,7 2. Опыт 75 6,6 8,6 1,37 42,1 30,6 113,7

Таким образом, введение композиционного биостимулятора КБС₂ в питательную среду промышленного аппарата приводит к существенному улучшению всех технологических показателей и качества биомассы: проток возрастает в среднем на 21 м³/час; время выращивания снижается на 20%; концентрация сухих веществ возрастает на 4,9%; расчетная производительность ферментера возрастает на 40%; расходный коэффициент по зерносырью снижается на 11,4%; суточная выработка дрожжей увеличивается на 33 т/сут, т.е. на 40 отн.%.

Как видно из табл.2, в период испытаний биостимуляторов в отделении чистой культуры и передачи активированной с помощью КБС₁ культуры в промышленный аппарат улучшились технологические показатели работы ферментера. Концентрация сухих веществ выросла на 3,7 отн.%; расходный коэффициент снизился на 4,4 отн.%; суточная выработка дрожжей возросла на 10,1 т, т.е. на 12,5 отн.%; увеличилось содержание сырого протеина на 1,1 абс.%, или 2,7 отн.%; содержание белка по Барнштейну возросло на 0,6 абс.%, или 2 отн.% Микрорбиологический контроль за состоянием культуры дрожжей в период испытаний стимуляторов показал, что дрожжевые клетки имели хорошее морфологическое состояние и активно почковались. Протоплазма была гомогенна, количество почкующихся клеток составляло 50-60%. В конце накопления биомассы клетки становились одиночными, почкование уменьшалось, рН повышался. По морфологическому состоянию клеток принималось решение по сливу биомассы в промышленный ферментер, где на протяжении всего периода испытаний морфологическое состояние дрожжевых клеток было хорошим. В связи с глубокой утилизацией углеводов (свыше 80%) в последней секции наблюдалось значительное количество вакуолизированных клеток.

Способ получения биомассы дрожжей включает культивирование дрожжей в условиях аэрации при температуре 25÷40°С и рН 3,0÷6,0 на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные добавки и стимуляторы роста. В качестве питательной среды используют гидролизаты или ферментолизаты зерносырья и/или отходов мукомольного производства. В качестве биостимуляторов роста клеток дрожжей используют (вес.%): сульфит натрия (1·10^-4÷1·10^-8), гиббереллиновые кислоты (1·10^-7÷1·10^-12), водорастворимые олигосахариды хитина (1·10^-5÷1·10^-9) при их общей концентрации (1·10^-5÷1·10^-10) % к объему. Способ позволяет увеличить прирост биомассы, снизить затраты на ее получение и повысить качество готового продукта по содержанию белка. Содержание сырого белка готового продукта составляет 42,1%. 2 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ получения биомассы дрожжей, включающий культивирование дрожжей в условиях аэрации при температуре 25÷40°С и рН 3,0÷6,0 на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные добавки и стимуляторы роста; в качестве питательной среды используют гидролизаты или ферментолизаты зерносырья и/или отходов мукомольного производства, в качестве биостимуляторов роста клеток дрожжей, используют, вес.%: сульфит натрия (1·10^-4÷1·10^-8), гиббереллиновые кислоты (1·10^-7÷1·10^-12), водорастворимые олигосахариды хитина (1·10^-5÷1·10^-9) при их общей концентрации (1·10^-5÷1·10^-10)% к объему.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют дрожжи: Saccharomyces cerevisiae, Candida scotti.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что по окончании процесса культивирования, биомассу отделяют, а отработанную культуральную жидкость возвращают в процесс культивирования дрожжей, предварительно обработав перегретым водяным паром до установления температуры жидкой фазы 80÷95°С.