СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 1998 года по МПК C12P21/00 C12N1/14 C12N1/16 C12N9/28 A23K1/00 

Изобретение относится к области микробиологической, пищевой, комбикормовой и перерабатывающей промышленности и может быть использовано для получения биомассы микроорганизмов путем ее выращивания на питательных средах на основе крахмала и целлюлозосодержащего растительного сырья, в частности некондиционного зерносырья и отходов мукомольного производства, для использования ее в качестве кормовой добавки в рационе сельскохозяйственных животных и птицы.

Различные виды растительного сырья содержат 30 - 80% крахмала, 3 - 20% белка, 3 - 25% клетчатки. При этом низкое содержание незаменимых аминокислот, витаминов обусловливает малую эффективность их прямого скармливания животным.

Одним из способов повышения качества растительных кормов является обогащение растительного сырья белком микроорганизмов.

Известен способ получения биомассы [1] путем непрерывного выращивания дрожжей рода Кандида в условиях аэрации на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода н-парафины, источники азота, фосфора, минеральные соли и микроэлементы, отличающийся тем, что для выращивания дрожжей используют среду, содержащую дополнительно отходы мукомольного производства, например отруби пшеничные или ржаные в виде жидкого гидролизата, приготовленного выдерживанием 10 - 15%-ной водной суспензии отрубей при температуре 70 - 75^oC, pH 5,0 - 6,0 при перемешивании, причем полученный гидролизат подают на стадию выращивания после осветления центрифугированием с отбором осветленной части в количестве 60 - 70 об.% в соотношении парафины - осветленный гидролизат 1:25 - 1:40, образующийся при осветлении гидролиза концентрат объединяют с потоком суспензии биомассы перед сушкой в количестве не более 7% его общего расхода или используют при получении кормовой добавки. Недостатком этого способа является сложность подготовки питательной среды, а также необходимость глубокого гидролиза зерноотходов со значительным расходом гидролитических ферментов и использованием лишь осветленной части гидролизата.

Известен способ получения биомассы [2], включающий выращивание дрожжей в условиях аэрации на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода отруби и/или муку злаков, подвергнутые ферментативной обработке с помощью амилолитических или протеолитических ферментов, таких как пектофоетидин, целловиридин, α -амилаза, глюкоамилаза, амилосубтилин, протеаза, пепсин-трипсин. Недостатком способа является то, что при выращивании дрожжей рода Кандида требуется достаточно глубокий гидролиз применяемых субстратов, что сопряжено со значительным расходом дорогостоящих ферментов, кроме того, проведение процесса ферментолиза при pH 7,0 - 7,4 способствует неконтролируемому росту бактериальной микрофлоры.

Наиболее близким по технической сущности к заявленному способу является способ получения кормовой белковой добавки [3], предусматривающий приготовление питательной среды, содержащей в качестве источника углерода отходы мукомольного производства и молотое зерно, из которых по отдельности готовят 9 - 15%-ную водную суспензию и выдерживают при 60 - 70^oC в течение 1 - 6 ч, смешивают полученные суспензии в соотношении 1:0,2 -5,0 и выдерживают в течение 1 - 4 ч при 60 - 70^oC, ферментацию проводят при pH 5 - 7,0, 34 - 36^oC в присутствии минеральных солей при дополнительном введении к дрожжам биомассы бактерий, продуцирующих амилолитические ферменты, при этом используют дрожжи Кандида, а биомассу бактерий вводят в количестве 0,5 - 10% от большего расхода суспензии при ферментации. Недостатком способа является необходимость достаточно длительного выдерживания (до 10 ч) суспензии субстрата на стадии его предобработки, что может вести к неконтролируемому росту микрофлоры и существенному инфицированию процесса ферментации; недостатком является также тот факт, что оптимальные значения pH среды для выращивания дрожжевых и бактериальных культур различны, в связи с чем снижается продуктивность процесса; кроме того, для выделения бактериальной биомассы необходимо специальное оборудование, а использование оборудования, предназначенного для выделения дрожжей, приводит к значительным потерям биомассы.

Предлагаемое изобретение решает научно-техническую задачу, направленную на увеличение экономической эффективности переработки растительных отходов, в частности некондиционного зерносырья и отходов мукомольного производства, в белковые продукты.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в повышении степени конверсии растительного сырья, повышении скорости роста культуры и сокращении длительности процесса.

Данный технический результат достигается тем, что в способе получения биомассы микроорганизмов в процессе приготовления питательной среды осуществляют ферментативный гидролиз субстрата с использованием в качестве биокатализатора мультиэнзимной композиции при слабом нагревании в слабокислой среде, после чего полученную суспензию целиком используют для выращивания микроорганизмов. При этом в качестве источника углерода используют крахмал и целлюлозосодержащее сырье, в частности некондиционное зерно и отходы мукомольного производства. Ферментативный гидролиз проводят в два этапа - сначала разжижают водную суспензию растительного сырья за счет использования его амилолитических ферментов в течение 10 - 40 мин при температуре 50 - 65^oC и pH 4,5 - 5,5; затем в суспензию в качестве биокатализатора добавляют мультиэнзимную композицию в количестве 10^-2 - 10^-5% на сухой вес сырья. При этом процесс желательно вести в течение 20 - 180 мин при температуре 50 - 70^oC, pH 4,5 - 6,5. Полученную суспензию целиком используют в качестве углеродсодержащего компонента питательной среды для выращивания микроорганизмов, продуцирующих амилолитические и гидролитические ферменты; при этом в качестве мультиэнзимной композиции используют смесь ферментов, состоящую из целловиридина Г3х и амилоризина П10х или амилосубтилина Г3х в соотношении 1:1-10 по массе. Выращивание микроорганизмов осуществляют в условиях непрерывного перемешивания и аэрации, при температуре культивирования 30 - 34^oC, pH 5,0 - 6,0 (поддерживается титрованием 6 - 12%-ного раствора гидроокиси аммония), аэрации 0,5 - 1,0 м³/м³/ч.

В качестве засевного материала используют, в частности, суточные культуры дрожжей Endomycopsis fibuligera ВКПМ-У-2173 или гриба Aspergillus niger ВКПМ-F-710, выращенные в качалочных колбах на питательной среде следующего состава, г/л:
Меласса - 50,0
Калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,8
Аммоний сернокислый - 1,5
Засевной материал вносят в ферментер в количестве 3 - 7 об.%. Endomycopsis fibuligera выделен из сельскохозяйственных отходов селекционным путем. Aspergillus niger получен селекционным путем под воздействием мутагенного фактора - нитрозометилмочевины.

Выбор ферментных препаратов в мультиэнзимной композиции обусловлен тем, что растительное сырье, в частности зерно и отходы мукомольного производства, представляют собой многокомпонентную систему, включающую крахмал, белки, целлюлозу и др. Предлагаемая композиция позволяет в сравнительно мягких условиях (температура 50 - 70^oC, pH 4,5 - 6,0, время 20 - 180 мин) провести деструкцию сырья до определенных значений редуцирующих веществ в среде, необходимых для начала роста микроорганизмов, способных продуцировать амилолитические и гидролитические ферменты. Температурный интервал обусловлен тем, что при снижении температуры ниже 50^oC и увеличении выше 70^oC скорость ферментативных реакций как самого сырья, так и дополнительно вводимой мультиэнзимной композиции резко снижается. То же касается и другого важного фактора - pH среды.

Предлагаемый способ существенно отличается от известных аналогов и прототипа. В известных способах основная задача заключалась в том, чтобы достичь максимальной деградации полимерных материалов растительного сырья до мономерных компонентов, поскольку на стадии ферментации использовали дрожжи рода Кандида, способные расти лишь на продуктах глубокого гидролиза растительного сырья. Этим объясняется значительный расход ферментных препаратов на стадии ферментолиза, необходимость отделения жидкой фазы от негидролизуемого остатка, а также необходимость инактивации ферментов перед подачей питательной среды на стадию выращивания дрожжей, поскольку эти ферменты достаточно легко гидролизуют и полимерные компоненты клеточных стенок микроорганизмов, что приводит к значительному снижению выхода биомассы от используемого сырья и снижению в ней содержания белка. В предлагаемом способе в мягких условиях осуществляется подготовка сырья для его дальнейшего использования культурами микроорганизмов, продуцирующих амилолитические и гидролитические ферменты. При этом достигается более высокая степень конверсии растительного сырья, повышается скорость роста продуцента и тем самым снижается продолжительность процесса.

Предлагаемый способ поясняют следующие примеры.

Пример 1. 400 г дерти смешивают с 2400 мл воды (гидромодуль 1:6). Устанавливают pH 5,5, суспензию при постоянном перемешивании выдерживают при 55^oC в течение 20 мин, после чего в нее добавляют 100 мл раствора, содержащего 0,04 г мультиэнзимной композиции, составленной из целловиридина Г3х и амилоризина П10х в соотношении 1:1 по массе (1•10^-2% на сухую массу сырья) и при постоянном перемешивании выдерживают суспензию при pH 5,0 - 5,5, температуре 50 - 55^oC в течение 30 мин. Затем субстрат подают в ферментер с рабочим объемом 5,0 л, добавляют 2000 мл воды с необходимыми микроэлементами (до 8% на сухую массу субстрата). Вносят 250 мл суспензии дрожжей Endomycopsis fibuligera У-2173 (5 об.%). Выращивание дрожжей ведут при pH 5,0 - 5,5, температуре 30 - 32^oC, скорости разбавления среды 0,15 ч^-1 и аэрации 1 м³/м³/ч. Получено 280 г сухого белкового продукта (выход от субстрата 70%). Содержание сырого протеина в готовом продукте - 42% (содержание сырого протеина в дерти - 8%).

Пример 2. 250 г пшеничных отрубей смешивают с 2500 мл воды (гидромодуль 1:10). Устанавливают pH 5,5, суспензию выдерживают при 60^oC в течение 30 мин при постоянном перемешивании, после чего добавляют 100 мл раствора, содержащего 2,5•10^-3 г мультиэнзимной композиции, составленной из целловиридина Г3х и амилоризина П10х в соотношении 1:5 по массе (1•10^-3% на сухую массу сырья) и при постоянном перемешивании выдерживают суспензию при температуре 60^oC в течение 60 мин. Затеи субстрат подают в ферментер с рабочим объемом 5,0 л, добавляют 2000 мл воды с необходимыми микроэлементами (разбавление до 5% субстрата по сухой массе). Выращивание дрожжей Endomycopsis fibuligera У-2173 ведут при pH 5,0 - 5,5, температуре 30 - 32^oC, скорости разбавления среды 0,12 ч^-1 и аэрации 0,5 м³/м³/ч. Выход белкового продукта 65% от субстрата, содержание сырого протеина в продукте 35,0% (содержание сырого протеина в пшеничных отрубях 15%).

Пример 3. 250 г ржаной муки смешивают с 250 г пшеничных отрубей (гидромодуль 1: 6,6). Устанавливают pH 5,5, суспензию выдерживают при температуре 60^oC в течение 40 мин, после чего в нее добавляют 100 мл раствора, содержащего 5•10^-4 г мультиэнзимной композиции, составленной из целловиридина Г3х и амилосубтилина Г3х в соотношении 1:10 по массе (в количестве 1•10^-4% на сухую массу субстрата), при постоянном перемешивании выдерживают суспензию при температуре 70^oC в течение 90 мин. Затем субстрат подают в ферментер, разбавляют водой с микроэлементами до 10% субстрата по сухой массе. Вносят 250 мл суспензии дрожжей Endomycopsis fibuligera У-2173. Выращивание ведут при pH 5,0 - 5,5, 30 - 32^oC, скорости разбавления среды 0,15 ч^-1, аэрации 1 м³/м³/ч. Выход 71% белкового продукта от субстрата. Содержание сырого протеина в готовом продукте 37,0% (содержание сырого протеина в ржаной муке 13,1%, а в пшеничных отрубях 15%).

Пример 4. 400 г ржаных отрубей смешивают с 3200 мл воды (гидромодуль 1: 8). Суспензию выдерживают при pH 5,5, температуре 50^oC в течение 30 мин, после чего в нее добавляют раствор мультиэнзимной композиции, составленной из целловиридина Г3х и амилоризина П10х в соотношении 1:3 по массе (1•10^-5% на сухую массу сырья), суспензию выдерживают при pH 5,5, температуре 50^oC в течение 180 мин. Выращивание дрожжей Endomycpsis fibuligera У-2173 ведут при pH 5,0 - 5,5, 30 - 32^oC, скорости разбавления среды 0,15 ч^-1, аэрации 1 м³/м³/ч. Выход белкового продукта 65% от субстрата, содержание сырого протеина 36% (содержание сырого протеина в ржаных отрубях 15%).

Способ получения биомассы микроорганизмов включает приготовление питательной среды, содержащей в качестве источника углерода крахмал и целлюлозосодержащее растительное сырье, в частности некондиционное зерно и отходы мукомольного производства, засев штаммов микроорганизмов с последующим проведением ферментации. В процессе приготовления питательной среды осуществляют ферментативный гидролиз субстрата с использованием в качестве биокатализатора мультиэнзимной композиции при слабом нагревании в слабокислой среде, после чего полученный гидролизат используют для выращивания микроорганизмов. Технический результат заключается в повышении степени конверсии растительного сырья, повышении скорости роста культуры. Получаемый продукт может быть использован в качестве кормовой добавки в сельском хозяйстве. 6 з.п. ф-лы.

1. Способ получения биомассы микроорганизмов, включающий приготовление питательной среды, содержащей источник углерода, засев штаммов микроорганизмов с последующим проведением ферментации, отличающийся тем, что в процессе приготовления питательной среды осуществляют ферментативный гидролиз субстрата с использованием в качестве биокатализатора мультиэнзимной композиции при слабом нагревании в слабокислой среде, после чего полученный гидролизат используют для выращивания микроорганизмов. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве источника углеродного питания используют крахмал и целлюлозосодержащее сырье, в частности некондиционное зерно и отходы мукомольного производства. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что питательную среду после ферментативного гидролиза субстрата охлаждают до температуры, оптимальной для выращивания микроорганизмов. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве мультиэнзимной композиции используют смесь ферментов, состоящую из целловиридина ГЗх и амилоризина П10х или амилосубтилина ГЗх в соотношении 1 : 1 - 10 по массе. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что мультиэнзимную композицию вносят в суспензию в количестве 1 • 10^-2 - 1 • 10^-5% на сухую массу сырья. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что процесс предпочтительно ведут в течение 20 - 180 мин при 50 - 70^oC, pH среды 4,5 - 5,5. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что для выращивания используют предпочтительно микроорганизмы, продуцирующие амилолитические и гидролитические ферменты, в частности дрожжи Endomycopsis fibuligera ВКПМ-У-2173 или гриб Aspergillus niger ВКПМ-F-710.