СЕМЕНА ПОДСОЛНЕЧНИКА С ВЫСОКИМ СОДЕРЖАНИЕМ ДЕЛЬТА-ТОКОФЕРОЛА Российский патент 2010 года по МПК A01H5/00 A01H5/10 A23D9/02 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к семенам с высоким содержанием дельта-токоферола. Масло, которое экстрагируют из этих семян, обладает высокой устойчивостью к окислению, и это является оптимальным для применения в продуктах питания и промышленности (биологическое топливо и замасливатели). Это масло и его побочные продукты можно применять для экстракции дельта-токоферола, что находит широкое применение в пищевой, косметической и фармацевтической промышленности.

Предпосылки создания изобретения

Токоферолы представляют собой основные встречающиеся в естественных условиях компоненты с антиоксидантной активностью, присутствующие в масле из семян растений. Благодаря их жирорастворимости, они переходят в масло в процессе экстракции и проявляют важное антиоксидантное действие как в разлитом в бутылки масле, так и в пищевых продуктах, содержащих растительные масла (F.B.Padley и др., Occurrence and characteristics of oils and fats в: The Lipid Handbook, под ред. F.D.Gunstone, J.L.Harwood и F.B.Padley, London; изд-во Chapman & Hall, 1994, cc.47-223). Из известных четырех типов токоферолов (альфа-, бета-, гамма- и дельта-токоферол) максимальной антиоксидантной активностью in vitro, т.е. вне организма человека, обладают бета-, гамма- и дельта-токоферол, в то время как альфа-токоферол проявляет существенно более низкую активность по сравнению с тремя другими токоферолами (G.Pongracz и др., Tocopherole. Antioxidanten der Natur, Fat Science and Technology, 97, 1995, cc.90-104).

В стандартных семенах подсолнечника присутствует фракция токоферолов, в которой доминирует альфа-токоферол, на долю которого приходится примерно 95% от общего содержания токоферолов, остальное составляют бета-токоферол и гамма-токоферол, на долю которых приходится менее 5% от общего содержания токоферолов (F.B.Padley и др., 1994, выше). Из-за преобладания в семенах подсолнечника альфа-токоферола масло из этих семян характеризуется более низким уровнем защиты от окисления по сравнению с другими растительными маслами, экстрагируемыми из семян с более высоким содержанием бета-, гамма- и/или дельта-токоферола, которые обладают более высокой антиоксидантной активностью in vitro. В таблице представлены данные о составе токоферолов в основных маслах из семян растений.

Усредненный состав токоферолов в основных маслах из семян растений Масло % токоферола альфа бета гамма дельта Хлопковое 43 2 55 0 Арахисовое 44 2 52 2 Рапсовое 26 9 64 1 Сафлоровое 90 8 2 0 Подсолнечное 95 4 1 0 Льняное 1 0 99 0 Кукурузное 20 3 73 4 Касторовое 6 6 23 65 Соевое 6 1 66 27

Преобладание альфа-токоферола в семенах подсолнечника является практически повсеместным, и к настоящему времени описано всего 4 линии подсолнечника с измененными уровнями токоферолов, которые можно сгруппировать в два класса:

а. Высокое содержание гамма-токоферола. Этим показателем характеризуются две линии, которые содержат более 85% токоферолов в форме гамма-токоферола, остальное приходится на долю альфа-токоферола. Одна из этих линий, обозначенная как LG-17, разработана в России (Y.Demurin, Genetic variability oftocopherol composition in sunflower seeds, Helia, 16, 1993, сс.59-62), а вторая линия создана в Испании и обозначена как Т2100 (L. Velasco и др., Registration of T589 and T2100 sunflower germplasms with modified tocopherol profiles, Crop Science, в печати).

б. Среднее содержание бета-токоферола. Этим показателем характеризуются две линии, семена которых содержат от 30 до 50% токоферолов в форме гамма-токоферола, остальное приходится на долю альфа-токоферола. Одна из этих линий, обозначенная как LG-15, разработана в России (Y.Demurin, выше), а вторая, обозначенная как Т585, создана в Испании (L.Velasco и др., в печати, выше).

Путем скрещивания линий LG-15 и LG-17 российские и югославские исследователи получили рекомбинанты с несколько повышенными уровнями дельта-токоферола, при этом максимальный уровень этого токоферола составлял 25% от общего содержания токоферолов, присутствующих в семени (Y.Demurin и др., Genetic variability oftocopherol composition in sunflower seeds as a basis of breeding for improved oil quality. Plant Breeding, 115, 1996, сс.33-36). Обобщая известные данные, можно заключить, что максимальные, известные к настоящему времени уровни индивидуальных токоферолов в семенах подсолнечника составляют:

- 95% альфа-токоферола (встречающийся в естественных условиях состав);

- 50% бета-токоферола;

- 95% гамма-токоферола;

- 25% дельта-токоферола.

Краткое изложение сущности изобретения

Одним из объектов настоящего изобретения являются семена подсолнечника с высоким содержанием дельта-токоферола, в которых от 26 до 80% от общего содержания токоферолов приходится на долю дельта-токоферола, а содержание других токоферолов следующее: от 0,5 до 45% от общего содержания токоферолов приходится на долю альфа-токоферола, от 0 до 60% от общего содержания токоферолов приходится на долю бета-токоферола, от 0 до 70% от общего содержания токоферолов приходится на долю гамма-токоферола. В некоторых из этих семян содержание дельта-токоферола всегда превышает 50, 65 и 75% от общего содержания токоферолов. Признак высокого содержания дельта-токоферола в семенах подсолнечника является наследуемым (самоопыление) и экспрессируется стабильно независимо от условий окружающей среды.

Другим объектом настоящего изобретения является подсолнечное масло, экстрагируемое из этих семян с помощью любого метода, и которое в естественных условиях без какого-либо добавления извне, характеризуется высоким содержанием дельта-токоферола (26-80% от общего содержания токоферолов приходится на долю дельта-токоферола).

Еще одним важным объектом настоящего изобретения являются растения подсолнечника, продуцирующие семена, характеризующиеся высоким содержанием дельта-токоферола (26-80% от общего содержания токоферодов).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к зародышевой плазме подсолнечника (Heliantus annus L.), который характеризуется высоким содержанием дельта-токоферола в семенах. На долю этого токоферола приходится от 26 до 80% от общего содержания токоферола в семенах. Такие высокие уровни дельта-токоферола не продуцируются растениями подсолнечника в естественных условиях и их получают с помощью комплексного процесса, включающего два цикла искусственной индукции мутаций и последующую идентификацию мутантных растений и закрепление мутантного признака. Признак высокого содержания дельта-токоферола, который является объектом настоящего изобретения, является наследуемым и всегда воспроизводится независимо от условий культивирования.

Для получения генетически модифицированных растений, семена которых характеризуются высокой концентрацией дельта-токоферола, осуществляли длительный процесс генетического усовершенствования, направленный на генетическое изменение пути биосинтеза токоферола. Этот процесс состоял из 4 стадий: (1) индукция искусственных мутаций в семенах стандартного сорта подсолнечника; (2) идентификация особей с изменениями в пути биосинтеза токоферола в результате индуцированных мутаций и закрепление мутантных признаков; (3) новый процесс индукции искусственных мутаций особей, которые уже несут первый уровень изменения в пути биосинтеза токоферола; (4) идентификация особей, у которых изменения пути биосинтеза токоферола, отличаются от изменений, характерных для исходных особей, последующее закрепление нового мутантного признака.

Первый процесс мутагенеза или искусственной индукции мутаций заключался в том, что обрабатывали семена стандартного сорта подсолнечника продуктом, обладающим способностью к мутагенезу или, другими словами, способностью индуцировать мутации в растительной ДНК. С учетом ожидаемой низкой частоты мутаций в генах, ответственных за путь биосинтеза токоферола, после обработки мутагеном осуществляют не сопровождающийся разрушением растения анализ состава токоферолов в нескольких тысячах отдельных семян.

Для того чтобы обнаруженные мутации имели какую-либо коммерческую применимость, они должны быть наследуемыми и экспрессироваться независимо от условий окружающей среды, в которых растения культивируют. По этой причине проводили процесс отбора, направленный на закрепление мутантных признаков и подтверждение их стабильности в различных условиях окружающей среды. После этого процесса несколько первоначально выявленных мутаций были отбракованы, а один мутант с высоким содержанием гамма-токоферола (95% от общего содержания токофероов в семенах) был закреплен. Для этого мутанта, обозначенного как IAST-1, установлено, что он характеризуется генетическим базисом, отличным от других линий с высоким содержанием гамма-токоферола. Так, при скрещивании линий IG-17 и Т2100 с линиями со стандартным составом токоферолов получали F2-потомство, у которого не происходило расщепление по признаку промежуточных уровней гамма-токоферола (Demurin и др., выше; L.Velasco и J.M.Fernandez-Martinez, Identification and genetic characterization in sunflower germplasm, Helia, в печати), а у F2-потомства, полученного в результате скрещиваний мутанта IAST-1 и линий со стандартным составом токоферолов, происходило выраженное расщепление по признаку промежуточных уровней гамма-токоферола.

После генетического выделения мутанта IAST-1 осуществляли второй процесс мутагеназа с использованием семян этого мутанта с целью получения дополнительного изменения, касающегося высоких уровней других токоферолов. После этого второго цикла мутагенеза также осуществляли аналитический крупномасштабный процесс для идентификации мутантов наряду с процессом закрепления мутантов и подтверждения независимости их экспрессии от условий культивирования. Полученные при осуществлении второго цикла мутагенеза мутации, предлагаемые в изобретении, идентифицировали и закрепляли, при этом было установлено, что в присутствии указанных мутаций семена характеризуются высокими концентрациями дельта-токоферола, составляющими от 26 до 80% от общего содержания токоферолов в семенах. Это высокое соотношение дельта-токоферола в семенах является наследуемым признаком и стабильно экспрессируется независимо от условий культивирования растений.

Вариант осуществления изобретения

Первый цикл мутагенеза

Семена подсолнечника из популяции сорта Peredovik со следующим составом токоферолов в семенах: 96% альфа-токоферола, 3% бета-токоферола и 1% гамма-токоферола, замачивали в дистиллированной воде на 4 ч при температуре 20°С. После этого семена переносили в раствор мутагена этилметилсульфоната (ЭМС) в концентрации 70 мМ в 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,0 и выдерживали в течение 2 ч при постоянном перемешивании при 60 об/мин. После обработки мутагеном семена (M1-поколение) промывали в течение 16 ч проточной водой и затем высевали в поле.

Индивидуально собирали урожай растений M1-поколения и их семена (М2-поколение) индивидуально анализировали в отношении состава токоферолов с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения (ЖХВР) согласно протоколу, разработанному F.Goffman с соавторами (Quantitative determination of tocopherols in single seeds ofrapeseed [Brassica napus L.], Fest/Lipid, 101, 1999, сс.142-145). Из всех 1080 проанализированных растений M1-поколения одно в результате расщепления характеризовалось высокими уровнями гамма-токоферола, причем максимальное содержание гамма-токоферола составляло 95% от общего содержания токоферолов. Семена с таким уровнями гамма-токоферола продуцировались растениями, которые единообразно экспрессировали этот признак. Путем скрещивания растений, полученных из семян с содержанием гамма-токоферола 95%, с семенами растений стандартных сортов подсолнечника в семенах F2-поколения происходила выраженная сегрегация по признаку содержания гамма-токоферола, включающая наличие уровней гамма-токоферола, которые являлись промежуточными по сравнению с уровнями, характерными для обоих родителей. Это очень выраженное расщепление является совершенно неожиданным, с учетом того, что для ранее разработанных продуктов с аналогичными уровнями гамма-токоферола (Demurin и др., выше; L. Velasco и J.M.Fernandez-Martinez, выше) не описана какая-либо сегрегация по признаку промежуточных уровней гамма-токоферола после скрещивания со стандартными сортами подсолнечника. Полученный таким образом мутант был обозначен как IAST-1.

Второй цикл мутагенеза

Семена мутантного подсолнечника линии IAST-1 со следующим составом токоферолов в семенах: 5% альфа-токоферола и 95% гамма-токоферола, замачивали в дистиллированной воде на 4 ч при температуре 20°С. После этого семена переносили в раствор мутагена азида натрия в концентрации 4 мМ в 0,1 М натрий-цитратном буфере, pH 3,0 и выдерживали в течение 2 ч при постоянном перемешивании при 60 об/мин. После обработки мутагеном семена (M1-поколение) промывали в течение 16 ч проточной водой и затем высевали в поле.

Индивидуально собирали урожай растений M1-поколения и их семена (М2-поколение) индивидуально анализировали в отношении состава токоферолов с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения (ЖХВР) согласно протоколу, разработанному F.Goffman с соавторами (см. выше). Из всех 1241 проанализированных растений M1-поколения одно в результате расщепления характеризовалось высокими уровнями дельта-токоферола, причем максимальное содержание дельта-токоферола составляло 55% от общего содержания токоферолов. Семена с такими уровнями дельта-токоферола продуцировались растениями, которые единообразно экспрессировали этот признак, при этом концентрации дельта-токоферола составляли от 26 до 80% от общего содержания токоферолов, присутствующих в семенах. Эти уровни сохранялись в последующих поколениях. Новую мутантную линию подсолнечника, в семенах которой продуцировались уровни дельта-токоферола, составляющие от 26 до 80% от общего содержания токоферолов, обозначили как IAST-3.

Семена подсолнечника генетически модифицировали с помощью двух циклов искусственной индукции мутаций, в каждом случае с последующей идентификацией мутантных особей, которые несли требуемый признак. Модифицированные семена характеризуются тем, что в них от 26 до 80% токоферолов присутствует в форме дельта-токоферола. Этот уровень дельта-токоферолов определяется генотипом семян, модифицированных по этому признаку, и является независимым от условий культивирования. Из семян выращивают генетически модифицированные растения подсолнечника, которые продуцируют в результате самоопыления семена с высокими уровнями дельта-токоферола. Из семян экстрагируют масло с высокой концентрацией дельта-токоферола. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Растение подсолнечника (Heliantus annus L.), отличающееся тем, что это растение выращивают из семян, полученных с помощью способа, который предусматривает
(1) индукцию мутагеном искусственных мутаций в семенах стандартного сорта подсолнечника;
(2) идентификацию особей с изменениями в пути биосинтеза токоферола в результате индуцированных мутаций и закрепление мутантных признаков;
(3) новый процесс индукции искусственных мутаций у особей, которые уже несут первый уровень изменения в пути биосинтеза токоферола;
(4) идентификация особей, у которых изменения в пути биосинтеза токоферола отличаются от изменений, характерных для исходных особей, последующее закрепление нового мутантного признака
и тем, что, являясь самоопыляемыми, эти растения дают семена подсолнечника, в которых от 26 до 80% от общего содержания токоферолов приходится на долю дельта-токоферола.

2. Семя подсолнечника, отличающееся тем, что получено способом, который предусматривает
(1) индукцию мутагеном искусственных мутаций в семенах стандартного сорта подсолнечника;
(2) идентификацию особей с изменениями в пути биосинтеза токоферола в результате индуцированных мутаций и закрепление мутантных признаков;
(3) новый процесс индукции искусственных мутаций у особей, которые уже несут первый уровень изменения в пути биосинтеза токоферола;
(4) идентификация особей, у которых изменения в пути биосинтеза токоферола отличаются от изменений, характерных для исходных особей, последующее закрепление нового мутантного признака и тем, что в них от 26 до 80% от общего содержания токоферолов приходится на долю дельта-токоферола.

3. Семя подсолнечника по п.2, отличающееся тем, что оно имеет следующее содержание других токоферолов: от 0,5 до 45% от общего содержания токоферолов приходится на долю альфа-токоферола; от 0 до 60% от общего содержания токоферолов приходится на долю бета-токоферола; от 0 до 70% от общего содержания токоферолов приходится на долю гамма-токоферола.

4. Семя подсолнечника по п.2, отличающееся тем, что содержание дельта-токоферола всегда превышает 65% от общего содержания токоферолов в семенах.

5. Семя подсолнечника по п.2, отличающееся тем, что содержание дельта-токоферола всегда превышает 75% от содержания всех токоферолов в семенах.

6. Семя подсолнечника по п.2, отличающееся тем, что, являясь самоопыляемым, оно стабильно экспрессирует от 50 до 80% дельта-токоферола от общего содержания токоферолов, независимо от условий окружающей среды.

7. Семя подсолнечника по п.2, отличающееся тем, что после его обработки с помощью любой процедуры экстракции масла из него получают масло с содержанием дельта-токоферола от 50 до 80%.

8. Подсолнечное масло, экстрагированное с помощью любой процедуры из семян с высоким содержанием дельта-токоферола по п.2, отличающееся тем, что в естественных условиях без какого-либо добавления извне содержит высокий уровень дельта-токоферола, составляющий от 26 до 80% от общего содержания токоферолов.