СПОСОБ УВЕЛИЧЕНИЯ БИОСИНТЕЗА ЭКДИСТЕРОИДОВ В РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТАХ Российский патент 2010 года по МПК A01N59/00 

Изобретение относится к биоорганической химии и химии природных и физиологически активных веществ и может быть использовано в медицине, в сельском хозяйстве, для получения необходимых количеств чистых гормонов, профессиональном спорте, для синтеза различных стероидных соединений, при поиске новых перспективных источников экдистероидов, изучения распространения экдистероидов в растительном мире.

Известны способы повышения содержания биологически активных веществ при обработке растений растворами различных соединений.

Известен способ обработки растворами микроэлементов валерианы лекарственной (патент РФ 2230720, МКИ⁷ С05D 9/02, опубл. 2004.06.20). В известном изобретении для выращивания растений используется водный раствор калия дихромата, марганца сульфата, железа сульфата, кобальта нитрата, меди сульфата, аммония молибдата, натрия вольфрамата, никеля сульфата, магния сульфата, азотной кислоты. Недостатком известного аналога является ограниченное применение его к одному виду растений. Вторым недостатком является отсутствие эффективности при его использовании для повышения содержания экдистероидов.

Известен способ обработки чайного куста микроэлементами - Cu, Mn, Zn и Fe. (Белоус О.Г. Автореф. дис.на соиск. уч. степ. канд. с.-х. наук, Краснодар: Кубан. гос. аграр. ун-т. 2001, 24 с). Показано положительное влияние усиления питания микроэлементами на формирование урожая и репродуктивных органов. Недостатком известного аналога является то, что некорневые подкормки не оказывают существенного влияния на биохимические показатели пищевого растения - содержание экстрактивных веществ и танина.

Известен способ обработки растений микроэлементами В и Mn (Ионова Л.П. Влияние внекорневой подкормки микроэлементами бором и марганцем на водный режим и фотосинтез сои //Естеств. науки. 2003, № 6, с.32-34, 192). В указанной работе показано, что внекорневая подкормка микроэлементами положительно влияет на накопление хлорофилла и продуктивность фотосинтеза сои. Недостатком известного аналога является отсутствие влияния примененного состава микроэлементов на ценные вещества сои - белки, обусловливающие питательную ценность этих растений.

Известны средство и способ повышения содержания экдистероидов в растениях, выбранные в качестве прототипа (Патент РФ 2279803, опубл. 2006.06.20, A01N 59/00, A01N 43/38). С целью повышения содержания экдистероидов использованы растворы сульфата марганца, в концентрациях 2.5-100 мМ. Недостатком способа является применение растворов только одной соли. Вторым недостатком является использование растворов широкого диапазона концентраций сульфата марганца, включая и достаточно высокие для микроэлементов 1×10^-1 и 1×10^-2 М, ингибирующие как прорастание семян, так рост и развитие растений. Третьим недостатком является применение указанных растворов лишь к одному виду многолетнего растения, взятого из природы во взрослом состоянии. Четвертым недостатком является обработка растворами лишь за день до сбора сырья, поскольку увеличение содержания экдистероидов происходит после обработки в течение основных фаз вегетации. Кроме того, применение растворов соли сульфата марганца вызывает незначительное увеличение содержания экдистероидов - на 1.69 мг/г сухой массы растения через 7 суток после корневой и внекорневой обработки и на 1.44-1.63 мг/г через 1 сутки после обработки.

Задачей настоящего изобретения является разработка качественного состава и подбор концентрации микроэлементов с целью увеличения биосинтеза экдистероидов в растительных объектах.

Поставленная задача решается тем, что способ повышения биосинтеза экдистероидов в растительных объектах включает обработку растения водными растворами солей металлов, но в отличие от прототипа растения обрабатывали через 12 дней после всходов опрыскиванием надземной части или подкормкой подземной части растений водным раствором соли марганца с концентрацией 1×10^-4 М, а сбор сырья производили в фазе цветения через 20 дней после обработки.

Целесообразно также обрабатывать растения водными растворами солей кобальта и молибдена с концентрациями 1×10^-4 M. Возможно также производить предварительную обработку семян растений водными растворами солей кобальта, марганца или молибдена с концентрацией 1×10^-4 М.

Технический результат достигается тем, что способ увеличения биосинтеза экдистероидов в растительных объектах, включающий обработку растений в определенные сроки и при эффективной норме расхода средством, согласно изобретению, для повышения биологически активных веществ:

а) водным раствором соли марганца 1×10^-4 М;

б) водным раствором соли молибдена 1×10^-4 М;

в) водным раствором соли кобальта 1×10^-4 М,

обработку растительных объектов осуществляли на 12 день после всходов (в фазе вегетации) различными приемами:

а) предпосевной обработкой семян;

б) внекорневой обработкой растений;

в) корневой обработкой растений.

Выбор примененных солей обусловлен присутствием в их составе микроэлементов - марганца, кобальта и молибдена, а также их участием в биосинтезе вторичных метаболитов терпеноидной природы - экдистероидов.

По всей вероятности экзогенное внесение их дополнительно стимулирует биосинтез этих стероидов.

Заявленный способ апробирован на растениях смолевок - многолетней Silene frivaldszkyana и однолетней Silene linicola.

Растения культивировали в 2007-2008 годах в оранжерейно-тепличном комплексе Сибирского ботанического сада Томского государственного университета (СибБС ТГУ).

Пример 1. Контроль. 100 штук семян смолевки посеяли в ящик (50×20×10 см) с грунтом при температуре воздуха 20-22°С. Через 5-7 дней появлялись всходы. Сырье собирали в фазе цветения, высушивали при температуре 25-28°С. 1.0 г высушенного сырья заливали 20 мл 70% этилового спирта, извлечение экдистероидов проводили при 55°С в течение 1 часа. Затем осуществляли вторичную экстракцию. Объединенные экстракты концентрировали с помощью ротационного испарителя до 3-5 мл. Содержание экдистероидов определяли хроматоспектрофотометрическим методом. На препаративные пластинки наносили в качестве сорбентов 5 г силикагеля марки LS 5/40, 5 г марки LL254 5/40, 7 г окиси алюминия, 0.5 г химически чистого гипса и 24 мл воды. Пластинки сушили при температуре 110°С в сушильном шкафу. На пластинку наносили 0.1-0.2 мл концентрированного экстракта. Хроматографическое разделение проводили восходящим способом в системе растворителей хлороформ-этанол-ацетон (25, 15 и 5 мл соответственно). Зоны локализации экдистероидов отмечали в УФ-свете УФ-облучателя на фоне эталона - 20-гидроксиэкдизона. Адсорбированные смесью сорбентов искомые соединения элюировали 10 мл 95% этилового спирта. Оптическую плотность полученного фильтрата снимали на спектрофотометре SHYMADZU UV-1800. Содержание экдистероидов рассчитывали методом калибровки. В надземной части растений содержание экдистероидов составило 4.7 мг/г сухого растения, в семенах 7.0 мг/г сухого растения. Определение влияния растворов солей на всхожесть семян проводили растворами солей различной концентрации 1×10^-6 - 1×10^-1 М (0.001-100 мМ). Установлено, что наиболее оптимальной концентрацией для всех солей оказалась 1×10^-4 М.

Пример 2. Предпосевная обработка. 100 штук семян смолевки заливали 5 мл водного раствора соли MnSO₄ в концентрации 1×10^-4 М. Обработку проводили в течение 15 часов за 1 день до посева. Затем подсушили семена на воздухе.

Посев семян, выращивание растений, сушку, экстрагирование, анализ содержания экдистероидов осуществляли как в примере 1.

Приготовление растворов:

0.1 М (10^-1 М) - 1.51 г MnSO₄ растворили водой до 100 мл;

0.0001 М (10^-4 М) раствор - взяли 1 мл 0.1 М раствора и разбавили до 1000 мл водой. Содержание экдистероидов в надземной части в фазе цветения составило 4.7 мг/г сухого растения (таблица 1). Предпосевная обработка семян раствором МnSО₄ не оказала никакого влияния на уровень экдистероидов.

Пример 3. Предпосевная обработка. 100 штук семян смолевки заливали 5 мл водного раствора соли (NН₄)₆Мо₇O₂₄ в концентрации 1×10^-4 М. Обработку, посев семян, выращивание растений, сушку, экстрагирование, количественный анализ экдистероидов осуществляли как в примере 1.

Приготовление растворов:

0.1 М (10^-1 М) - 11.64 г (NН₄)₆Мо₇O₂₄ растворили водой до 100 мл;

0.0001 М (10^-4 М) раствор - взяли 1 мл 0.1 М раствора и разбавили до 1000 мл водой.

Содержание экдистероидов в надземной части в фазе цветения составило 8.4 мг/г сухого растения. Предпосевная обработка семян раствором (NН₄)₆Мо₇O₂₄ приводит к увеличению их содержания на 3.7 мг/г.

Пример 4. Предпосевную обработку семян смолевки проводили водным 1×10^-4 М раствором соли Со(NО₃)₂ в концентрации 1×10^-4 М аналогично как в примере 2.

Приготовление растворов:

0.1 М (10^-1 М) - 1.83 г Со(NO₃)₂ растворили водой до 100 мл;

0.0001 М (10^-4 М) раствор - взяли 1 мл 0.1 М раствора и разбавили до 1000 мл водой.

Посев семян, выращивание растений, сушку, экстрагирование, анализ осуществляли как в примере 1. Содержание экдистероидов в надземной части в фазе цветения составило 9.6 мг/г сухого растения. Предпосевная обработка семян раствором Со(NO₃)₂ приводит к увеличению их содержания в на 4.9 мг/г.

Пример 5. Внекорневая обработка. 100 штук семян смолевки посеяли в ящик (50×20×10 см) с грунтом при температуре воздуха 20-22°С. Через 5-7 дней появлялись всходы. Орошение 50 мл раствора MnSO₄ с концентрацией 1×10^-4 М осуществляли распылителем, что приводило к равномерному его распределению на поверхности надземной части растений на 12-й день после всходов. Сырье собирали в фазе цветения через 20 дней после обработки, высушивали при температуре 25-28°С. Экстракцию и количественное определение экдистероидов проводили аналогично как в примере 1. Содержание экдистероидов в надземной части составило 9.4, а в семенах 8.1 мг/г сухого растения. Внекорневая обработка растений водным раствором соли МnSO₄ приводит к увеличению содержания экдистероидов в надземной части на 4.7 и в семенах на 1.1 мг/г.

Пример 6. Внекорневая обработка. Посев семян смолевки проводили как в примере 1. Внекорневую обработку растений водным раствором соли (NH₄)₆Мо₇O₂₄ 1×10^-4 М проводили аналогично как в примере 5. Выращивание растений, сушку, экстрагирование осуществляли аналогично как в примере 1. Содержание экдистероидов составило 1.8 мг/г сухого растения.

Внекорневая обработка растений водным раствором соли (NН₄)₆Мо₇O₂₄ приводит к уменьшению их содержания на 2.9 мг/г.

Пример 7. Внекорневая обработка. Посев семян смолевки проводили как в примере 1. Внекорневую обработку растений 1×10^-4 М водным раствором соли Со(NО₃)₂ проводили аналогично как в примере 5. Выращивание растений, сушку, экстрагирование осуществляли аналогично как в примере 1. Содержание экдистероидов в надземной части составило 13.5, а в семенах 13.6 мг/г сухого растения. Внекорневая обработка растений водным раствором соли Со(NО₃)₂ приводит к увеличению их содержания в надземной части на 8.8, а в семенах на 6.6 мг/г.

Пример 8. Корневая обработка. Посев семян смолевки проводили как в примере 1. На 12-й день после всходов растения полили 150 мл водного раствора соли MnSO₄ с концентрацией 1×10^-4 М. Выращивание растений, сушку, экстрагирование, количественное определение содержания экдистероидов осуществляли аналогично как в примере 1. Содержание экдистероидов в надземной части составило 11.1 мг/г сухого растения. Внекорневая обработка 7 растений водным раствором соли MnSO₄ приводит к увеличению содержания стероидов на 6.4 мг/г.

Пример 9. Корневая обработка. Посев семян смолевки проводили как в примере 1. Корневую обработку растений 1×10^-4 М водным раствором соли (NН₄)₆Мо₇O₂₄ проводили аналогично как в примере 8. Выращивание растений, сушку, экстрагирование, количественное определение содержания экдистероидов осуществляли аналогично как в примере 1. Содержание экдистероидов составило 0.7 мг/г сухого растения. Внекорневая обработка растений водным раствором соли (NН₄)₆Мо₇O₂₄ приводит к уменьшению их содержания на 4.0 мг/г.

Пример 10. Корневая обработка. Посев семян смолевки проводили как в примере 1. Корневую обработку растений 1×10^-4 М водным раствором соли Со(NO₃)₂ проводили аналогично как в примере 8. Выращивание растений, сушку, экстрагирование, количественное определение содержания экдистероидов осуществляли аналогично как в примере 1. Содержание экдистероидов в надземной части растений составило 7.1 мг/г сухого растения. Внекорневая обработка растений водным раствором соли Со(NO₃)₂ приводит к увеличению их содержания на 2.4 мг/г.

Показатели надземной части растений Silene linicola (фаза цветения) приведены в Таблице 1.

Таким образом, подобраны предпочтительные условия (соли микроэлементов, концентрация, варианты обработки) для заявляемого способа увеличения биосинтеза экдистероидов в растительных объектах.

Таблица 1 Некоторые показатели надземной части растений Silene linicola (фаза цветения) Микроэлементы Способ обработки Сухая масса, г/1 растение Содержание 20Е, (мг/г) Контроль - 0.21 4.7 Мn Предпосевная 0.18 4.7 Внекорневая 0.23 9.4 Корневая 0.23 11.1 Мо Предпосевная 0.23 8.4 Внекорневая 0.16 1.8 Корневая 0.03 0.7 Со Предпосевная 0.17 9.6 Внекорневая 0.26 13.5 Корневая 0.27 7.1

Растения, например, растения смолевки, на 12 день после всходов опрыскивают или подкармливают водным раствором соли марганца или кобальта с концентрацией 1×10^-4 М. Такая обработка растений обеспечивает увеличение в них биосинтеза экдистероидов. Предпосевная обработка семян растений водным раствором соли кобальта или молибдена в упомянутой концентрации дает дополнительный эффект. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ увеличения биосинтеза экдистероидов в растительных объектах, включающий обработку растения водными растворами солей металлов, отличающийся тем, что растения обрабатывают через 12 дней после всходов опрыскиванием надземной части или подкормкой подземной части растений водным раствором соли марганца или кобальта с концентрацией 1×10^-4 M.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что производится предварительная обработка семян растений водными растворами солей кобальта или молибдена с концентрациями 1×10^-4 М.