СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА Российский патент 2010 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в кардиологии и терапии.

Известны способы разделения на фракции липопротеинов (ЛП) крови методом аналитического ультрацентрифугирования крови (А.Н.Климова, Н.Г.Никульчева. "Липиды, липопротеины и атеросклероз", 1995, Питер, пресс, с.98-102) и разделения на фракции ЛП в полиакриламидном геле (Н.Н.Шацкая. Биохимические исследования в оценке состояния сердечно-сосудистой системы. В кн.: Методы исследований в профпатологии. М., 1988, с.95-97).

Известны также способы разделения на фракции ЛП путем электрофореза в геле агарозы (Фенотипирование гиперлипопротеинемий на основе электрофореза липопротеинов в геле агарозы, Лаб. дело, 1980, №5, с.287-290);

RU 2099693 C1, 20.12.1997. RU 2102767 C1, 20.01.1998. SU 1334087 A1, 30.08.1987. US 5547873 A, 20.08.1996.

Недостатком данных способов является то, что они не позволяют выявить все фракции ЛП крови, включая ХМ, ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП и ЛП(а), а служат для разделения на фракции ХМ, ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП от комплекса альбумина с неэстерифицированными жирными кислотами.

Известен также способ определения фракций липопротеинов крови у больных ишемической болезнью сердца (RU №2200950 С2 G01N 33/49, 20.03.2003 Бюл. №8.)

Данный способ является наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату и выбран в качестве прототипа.

Недостатком способа-прототипа является малая точность, так как он не позволяет выявить минорные фракции ЛП. Это связано с тем, что фракция ЛП(а) является наиболее атерогенной и для ранней диагностики заболевания особенно важно выявление минорной фракции ЛП(а), наряду с максимально полным определением фракций других ЛП крови.

Задачей предлагаемого изобретения является повышение точности и чувствительности способа.

Указанная задача решается разделением на фракции липопротеинов крови у больных ишемической болезнью сердца (ИБС) электрофорезом в геле агарозы путем дополнительной обработки 0,3 мл 0,1% раствора Тритона X-100 и инкубации 15 мин при 20°С, последующей инкубацией сыворотки крови больного с раствором судана Б в течение 1 ч в темном термостате при 40°С и затем внесения пробы в лунку в геле агарозы с площадью основания 4×20 мм для электрофореза с последующей фиксацией электрофореграмм, их высушиванием, денситометрией, и при одновременном снижении уровня ЛП(а) на 40% и более, а общего холестерина на 20% и более по сравнению с исходным уровнем прогноз течения заболевания считают благоприятным, способствующим переходу стенокардии напряжения из функционального класса III-IV в функциональный класс I-II, а при снижении уровня ЛП(а) менее 40%, а общего холестерина менее 20% по сравнению с исходным прогноз считают неблагоприятным.

Новым в предлагаемом изобретении является дополнительная инкубация 0,3 мл пробы сыворотки крови пациента с 0,1 мл 0,1% раствора детергента Тритона Х-100 при 20°С в течение 15 мин, что позволяет выявлять минорные фракции ЛП крови одновременно с определением общего холестерина крови до и после лечения ишемической болезни сердца.

Исследование ЛП разных классов при диагностике ишемической болезни сердца (ИБС) рекомендовано Всероссийским научным обществом кардиологов согласно положению рекомендаций Европейского общества по изучению атеросклероза - «Диагностика и коррекция нарушений липидного обмена с целью профилактики и лечения атеросклероза» (г.Москва, 2005 г.; Клиническая лабораторная диагностика, №10, 2008 г., с.21-32).

В настоящее время перспективными являются методы исследования липидов с детергентами /Тритон Х-100 и др./. В лабораторной практике все больше используются прямые или гомогенные методы определения липопротеинов (ЛП) и их липидов. Такие методы основаны на использовании различных детергентов, способных блокировать или солюбилизировать классы ЛП для специфического выделения ЛПВП, ЛПНП и других фракций ЛП.

При использовании таких методов изоляция других классов ЛП не требует дополнительных операций и концентрацию холестерина (ХС) в классах ЛП можно определить напрямую в сыворотке крови общепринятыми ферментными методами в той же кювете («Клиническая лабораторная диагностика, №10, 2008 г., с.21-32).

Увеличение концентрации ЛП abnormal или ЛП(а) в крови считают независимым фактором риска атеросклероза. При содержании в крови ЛП(а) более 300 мкг/мл при норме 0-300 мкг/мл риск возникновения коронарного атеросклероза увеличивается вдвое, а при одновременном повышении уровня ЛП(а) ХС и ХС ЛПНП - в 5 раз (J.A. M.A. - 2001. - Vol.285. - p.2486-2497, Eur. Heart. J. - 2003. - Vol.24, - p.1601-1610).

В настоящее время особое внимание уделяется исследованию ЛП(а), в связи с чем разрабатываются способы лабораторной диагностики, позволяющие исследовать этот липопротеин крови. Он относится к апо-В-содержащим липопротеинам, богатым холестеролом (ХС). ЛП(а) идентичен "тонущим" пре-β-ЛП (sinking pre-β-Lp), имеющим при электрофорезе подвижность пре-β-ЛП. ЛП(а) содержат 27% белка, 8% углеводов и 65% липидов, из которых ЭХС составляют 59%, НЭХС - 14%, ФЛ - 14%.

Белковым компонентом ЛП(а) является высокогликозилированный полипептид - апо(а), имеющий близкое структурное сродство к плазминогену - одному из факторов системы свертывания-противосвертывания крови. При росте концентрации ЛП(а) в крови нарушаются процессы микроциркуляции в кровеносных артериях с возможным образованием микротромбов.

Благодаря наличию в структуре апо(а) сиаловых кислот, ЛП(а) более отрицательно заряжен по сравнению с β-ЛП в электрическом поле, лучше растворим в воде, может взаимодействовать с ионами металлов (кальция). Этот липопротеин гетерогенен. Все это свидетельствует об особой роли ЛП(а) в атерогенезе.

ЛП(а) могут взаимодействовать с ЛПНП-рецепторами, оказывая слабое влияние на активность ГМК-КоА редуктазы, на эстерификацию ХС. Период полураспада ЛП(а) длинее, чем у ЛПНП и составляет 3,3 сут. Содержание ЛП(а) в крови в норме не превышает 30 мг/л. При высокой концентрации в крови ЛП(а) выявляется в местах поражения сосудов в области скопления фибриногена. Повышенная концентрация ЛП(а) часто сочетается с II^a, II^б типами гиперлипопротеинемий. Поэтому в клинической практике крайне важно определение ЛП(а), одновременно с определением белков острой фазы воспаления. Установлено, что большинство гиполипидемических препаратов не влияет на повышенный уровень ЛП(а). Мировые популяционные исследования показали, что ЛП(а) представляет собой самостоятельный и независимый фактор риска ИБС - наиболее тяжелого проявления атеросклероза.

Фракция ЛП(а) гетерогенна. Установлено, что при электрофорезе ЛП(а) находятся в области β-глобулинов, но до 5% ЛП(а) при этом могут выявляться в области α-глобулинов.

По причине такой выраженной гетерогенности достаточно сложно оценить при электрофорезе всю фракцию ЛП(а), а тем более ее минорные подфракции, которые могут остаться на линии старта, если размер их частиц достаточно велик. Поэтому использование общепринятого в исследованиях последнего пятидесятилетия детергента Тритон Х-100 для обработки сыворотки крови, а именно липопротеинов крови, ведущее к частичной делипидизации ЛП и увеличению их подвижности при электрофорезе позволяет выявить минорные фракции ЛП(а). Поскольку ЛП(а) наиболее атерогенен, очень важно на ранних стадиях заболевания выявлять максимальное содержание ЛП(а) в крови каждого пациента. Это позволяет диагностировать ИБС еще до стадии значительных изменений других клинико-лабораторных показаний, повышает точность диагностики заболевания. В свою очередь таким пациентам рано назначается патогенетически обоснованная терапия. Не менее важно выявление минорных фракций ЛП(а) для оценки эффективности терапии заболевания и прогнозирования течения ИБС.

Все сказанное свидетельствует о крайней важности разработки способов лабораторной диагностики, позволяющих наиболее полно выявлять ЛП(а), включая и минорные фракции ЛП(а) (Клиническая лабораторная диагностика, №10, 2008, с.21-32).

Существенные признаки, характеризующие изобретение, проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и не очевидные для специалиста.

Идентичной совокупности признаков не обнаружено при изучении патентной и научно-медицинской литературы.

Данное изобретение может быть использовано в практическом здравоохранении для повышения точности диагностики у больных ИБС.

Таким образом, следует считать данное техническое решение соответствующим условиям патентоспособности: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Метод основан на электрофоретической подвижности модифицированных липопротеидов и одновременном определении общего холестерина крови.

Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенных чертежей.

На фиг.1 представлены результаты электрофоретического разделения на фракции ЛП сыворотки крови: а - в группе контроля способом-прототипом, б - в группе контроля предлагаемым способом.

На фиг.2 (а, б) представлены результаты электрофоретического разделения на фракции ЛП сыворотки крови больных ИБС до лечения.

На фиг.3 (а, б) представлены результаты электрофоретического разделения на фракции ЛП сыворотки крови больных ИБС после лечения.

На фиг.4 (а, б) представлены результаты электрофоретического разделения на фракции ЛП сыворотки крови больных ИБС с гиперхолестеролемией.

На фиг.5 (а, б) представлены результаты электрофоретического разделения на фракции ЛП сыворотки крови больного по способу-прототипу и предлагаемому способу.

На фиг.6 (а, б, в) представлены результаты электрофоретического разделения на фракции ЛП сыворотки крови по предлагаемому способу у больного ИБС после лечения, а также до и после лечения у другого пациента с ИБС.

Способ осуществляется следующим образом, поэтапно:

1) приготовление раствора судана Б: 400 мг судана Б растворяют в 20 мг этиленгликоля на кипящей водяной бане в течение 50 минут, фильтруют, хранят в стеклянной посуде;

2) приготовление геля агарозы: 320 мг агарозы А фирмы "Sigma" растворяют в 20 мл воды для кипячения, затем помещают в термостат при 55°С; добавляют 20 мл раствора альбумина (1 г альбумина в 200 мл вероналмединалового буфера, pH 8,6). 3 мл геля агарозы наносят на обезжиренное горизонтально установленное предметное стекло, помещают металлический стальной стержень - брусок 4×20 мм (высотой 10 мм), который после застывания геля убирают магнитом;

3) к 0,3 мл пробы сыворотки крови пациента добавляют 0,1 мл 0,1% раствора Тритона Х-100, инкубируют 15 мин при 20°С, добавляют 0,15 мл раствора судана Б, помещают на 1 час в темный термостат при 40°С, затем добавляют 0,2 мл горячего раствора геля агарозы, смешивают, подогревают при 55°С и подогретым вносят в лунку геля агарозы размером 4×20×10 мм;

4) предметное стекло помещают в камеру для электрофореза слоем агарозы вниз, электрофорез проводят в холодильной камере при температуре 4°С при напряжении 100 В и силе тока 40-45 мА;

5) электрофореграмму фиксируют в 5% растворе уксусной кислоты в течение одного часа, затем высушивают между листами фильтровальной бумаги, непрерывно смачивая 96% этиловым спиртом;

6) денситометрию проводят на микрофотометре МФ-4.

Общий холестерин крови определяют стандартизированным методом в динамике. Предварительная обработка сыворотки крови раствором Тритон Х-100 не влияет на выполнение анализа.

Метод основан на измерении оптической плотности холестерола и его эфиров с реактивом Либермана-Бурхарда. Большая часть холестерола находится в сыворотке крови в этерифицированном виде, продукт реакции холестерола с указанным реактивом поглощает свет в той же области спектра и имеет несколько больший коэффициент экстинции, чем продукт реакции свободного холестерола. Для учета этого различия, а также частичного учета маричных эффектов (влияния белков и билирубина на результаты анализа) калибровка метода проводится по калибровочной сыворотке, содержание холестерола в которой определено референтным методом Абеля-Кендала.

Приготовление реактива Либермана-Бурхарда:

600 мл уксусного ангидрида и 300 мл уксусной кислоты наливают в двухлитровую колбу, помещают в ледяную баню и перемешивают на магнитной мешалке, затем приливают 100 мл охлажденной серной кислоты. Через 30 мин колбу удаляют из ледяной бани, ставят на мешалку и добавляют 20 г сульфата нария, перемешивают до полного растворения соли 4-5 часов. Реактив стабилен 2 недели.

Ход анализа

1. В сухие пробирки разливают по 5 мл реактива Либермана-Бурхарда, помещают в ледяную баню.

2. В первую пробирку наливают 0,2 мл дистилированной воды (по стенке, медленно в течение 10 мин). Осторожно встряхивают и помещают в водяную баню.

3. С интервалом в 2 мин в остальные пробирку приливают по 0,2 мл исследуемой сыворотки, встряхивают, помещают в водяную баню.

4. Через 25 мин после добавления воды в первой пробирке измеряют оптическую плотность ее содержания против воды. Далее измеряют исследуемые пробы при длине волны (625±10) нм.

5. Рассчитывают концентрацию холестерина в сыворотке крови по сравнению с калибровочной.

Для растворов продуктов реакции Либермана-Бурхарда закон Бугера-Ламберта-Бера соблюдается в пределах 0-400 мг/дл холестерола.

Количественную оценку фракций при денситометрии проводят следующим образом: определяют площадь каждого пика на хроматограмме по формуле S=h·B1/2h, где S - площадь пика, h - высота пика, B1/2h - ширина пика на половине его высоты.

Расчет проводится автоматически по соответствующей программе и конечным результатом является процентное содержание каждой фракции ЛПНП, ЛПОНП, ЛПВП и ЛП(а), если она есть по отношению ко всей сумме фракций, принятой за 100%.

При проведении повторного исследования после лечения величина фракций ЛП(а) до лечения принимается за 100% и рассчитывается процентное значение величины снижения фракции ЛП(а) после проведенной терапии ИБС.

В группе контроля в случае использования способа-прототипа (n=10) (фиг.1а) и предлагаемого способа (n=12) (фиг.1б) выявлены ХМ, ЛПНП, ЛПОНП, ЛПВП - это нормальная липидограмма. Оценен уровень общего холестерола крови, который составил у первых 10 пациентов (4,6±0,2) ммоль/л и у второй группы пациентов, n=12 (4,7±0,2) ммоль/л. Нами обследованы 2 группы больных ИБС до и после лечения по 10 пациентов для способа-прототипа - I группа и 30 пациентов - II группа для предлагаемого способа.

Диагноз пациентов: ИБС, стенокардия напряжения, ФК III-IV.

У пациентов I группы до лечения выявились ХМ, ЛПНП, ЛПОНП, ЛПВП (фиг.2а, б). Уровень холестерина сыворотки крови составил у них (7,4±0,5) ммоль/л. После лечения при электрофорезе ЛП фракции ЛПНП и ЛПОНП стали менее интенсивными (фиг.3а и б).

Уровень общего холестерола сыворотки крови после лечения составил (5,7±0,4) ммоль/л.

Диагноз после лечения: ИБС, стенокардия напряжения, ФК II-III. Заключение: прогноз течения ИБС благоприятный, но недостаточно точный.

У 22 пациентов II группы с гиперхолестеролеминей выявлены при электрофорезе ЛПНП, ЛПОНП, ЛПВП, ЛП(а), ХМ (фиг.4а и б).

У остальных 8 пациентов группы фракция ЛП(а) не выявлена. Уровень общего холестерола у пациентов всей второй группы составил (8,7±0,6) ммоль/л.

После лечения ИБС у 10 пациентов выявлялась следовая трудноопределяемая фракция ЛП(а), у 20 пациентов ЛП(а) не выявлялась.

Уровень общего холестерола сыворотки крови после лечения составил во всей группе (6,0±0,5) ммоль/л. Диагноз после лечения у пациентов этой группы (29 человек): ИБС, стенокардия напряжения, ФК II. Заключение: прогноз течения ИБС благоприятный. Пациенты этой группы представлены в клинических примерах. У одного пациента второй группы при снижении общего холестерола крови после лечения уровень ЛП(а) в сыворотке крови оставался достаточно высоким. Динамики после лечения выявлено не было. Прогноз течения ИБС у этого пациента расценивался как неблагоприятный.

Ложноположительных и ложноотрицательных случаев нами не выявлено, т.к. оценивались только объективные критерии эффективности проводимой терапии ИБС: результаты велоэргометрии, частота приступов стенокардии и соответственно доза принятого глицерина, а также результаты лабораторных методов исследования, выраженные количественно.

Пример 1. Больной В., 54 года, история болезни №187, поступил в отделение ИБС и атеросклероза НИИ кардиологии г.Томска. Жалобы при поступлении на боли в области сердца и за грудиной колющего характера с иррадиацией под лопатку. Боли возникали при физической нагрузке и снимались нитроглицерином. АД 160/90 мм рт.ст. Пульс в покое 66 уд. в мин. Велоэргометрия была прекращена при нагрузке 50 Вт по объективным причинам.

Результаты лабораторного исследования: ХС общий 7,8 ммоль/л, триацилглицериды 1,8 ммоль/л, ХС ЛПВП 1,0 ммоль/л.

Результаты электрофоретического исследования ЛП крови по способу-прототипу представлены на фиг.5а, а по предлагаемому способу на фиг.5б. Фракция ЛП(а) присутствует.

Диагноз при поступлении: ишемическая болезнь сердца, стенокардия напряжения, ФК III-IV.

После проведенного лечения результаты лабораторного исследования: ХС общий 5,6 ммоль/л, триацилглицериды 1,6 ммоль/л, ХС ЛПВП 1,3 ммоль/л.

Результаты электрофоретического исследования ЛП крови по предлагаемому способу представлены на фиг.6а.

Фракция ЛП(а) отсутствует, фракция ЛПНП слабо выражена.

Диагноз при выписке: ишемическая болезнь сердца, стенокардия напряжения, ФКII. Заключение: лечение эффективное. Прогноз течения ИБС благоприятный.

Пример 2. Больной П., 65 лет, история болезни №148, поступил в отделение ИБС и атеросклероза НИИ кардиологии г.Томска с жалобами на давящие боли в области сердца и за грудиной, иррадиирующие под лопатку и в шейную область. На ЭКГ значительных изменений не выявлено. Велоэргометрия была прекращена при нагрузке 50 Вт по причине возникшей боли за грудиной. Боли купируются нитроглицерином. На ЭКГ появилась косовосходящая депрессия сегмента ST в отведениях V4-V6. АД 150/110 мм рт.ст., пульс в покое 68 уд. в мин.

Результаты лабораторного исследования: ХС общий 8,3 ммоль/л, триацилглицериды 1,8 м моль/л, ХС ЛПВП 1,0 м моль/л.

Результаты электрофоретического исследования ЛП крови до лечения по предлагаемому способу представлены на фиг.66. Результаты денситометрии ЛП: ЛПНП - 56%, ЛПОНП - 20%, ЛПВП - 15%, ЛП(а) - 7%.

Диагноз при поступлении: ишемическая болезнь сердца, стенокардия напряжения, ФК III-IV.

После проведенного лечения результаты лабораторного исследования: ХС общий 6,0 ммоль/л, триацилглицериды 1,5 ммоль/л, ХС ЛПВП 1,3 ммоль/л.

Результаты электрофоретического исследования ЛП крови по предлагаемому способу после лечения представлены на фиг.6в.

Результаты денситометрии ЛП: ЛПНП - 56%, ЛПОНП - 25%, ЛПВП - 17%, ЛП(а) - 2%.

Диагноз при выписке: ишемическая болезнь сердца, стенокардия напряжения, ФКII. Снижение уровня ЛП(а) на 58%, а общего холестерина на 25% по сравнению с исходным свидетельствовала об эффективности лечения ИБС. Заключение: лечение эффективное, прогноз течения ИБС благоприятный.

Итак, при применении способа-прототипа прогноз течения ИБС основывался на уровне общего холестерина сыворотки крови и клинических данных, поэтому был недостаточно точным. Способ применен у 40 пациентов и 22 пациентов группы сравнения с диагнозом нейроциркуляторная дистония. При снижении уровня ЛП(а) на 40% и более и общего холестерола сыворотки крови на 20% и более прогноз течения ИБС был оценен как благоприятный, о чем свидетельствовало изменение функционального класса (ФК) стенокардии напряжения, а при изменении только одного из показателей был установлен неблагоприятный прогноз течения ИБС (переход стабильного течения в нестабильную форму стенокардии).

Ложноположительных случаев прогнозирования течения ИБС при использовании предлагаемого нами способа не наблюдалось. При этом предлагаемый способ прост в исполнении и интерпретации полученных результатов.

Изобретение относится к области медицины, а именно к кардиологии и терапии. Для прогнозирования течения ишемической болезни сердца до и после лечения определяют в сыворотке крови общий холестерин и ЛП(а) путем дополнительной обработки 0,3 мл 0,1% раствора Тритона Х-100 и инкубации 15 мин при 20°С. Последующую инкубацию сыворотки крови больного проводят с раствором судана Б в течение 1 ч в темном термостате при 40°С. Пробы вносят в лунку в гель агарозы с площадью основания 4×20 мм для электрофореза с последующей фиксацией электрофореграмм, их высушиванием и денситометрией. При одновременном снижении уровня общего холестерина на 20% и более и ЛП(а) на 40% и более по сравнению с исходным уровнем прогноз течения заболевания считают благоприятным, способствующим переходу стенокардии напряжения из функционального класса III-IV в функциональный класс I-II. При снижении общего холестерина менее 20%, а уровня ЛП(а) менее 40% по сравнению с исходным прогноз считают неблагоприятным. Способ повышает чувствительность и точность прогнозирования течения ишемической болезни сердца. 6 ил.

Способ прогнозирования течения ишемической болезни сердца путем исследования сыворотки крови, отличающийся тем, что до и после лечения определяют в сыворотке крови общий холестерин и ЛП(а), путем дополнительной обработки 0,3 мл 0,1%-ного раствора Тритона Х-100 и инкубации 15 мин при 20°С, последующей инкубацией сыворотки крови больного с раствором судана Б в течение 1 ч в темном термостате при 40°С, и затем внесения пробы в лунку в геле агарозы с площадью основания 4×20 мм для электрофореза и последующей фиксацией электрофореграмм, их высушиванием, денситометрией и при одновременном снижении уровня общего холестерина на 20% и более и ЛП(а) на 40% и более по сравнению с исходным уровнем прогноз течения заболевания считают благоприятным, способствующим переходу стенокардии напряжения из функционального класса III-IV в функциональный класс I-II, а при снижении общего холестерина менее 20%, а уровня ЛП(а) менее 40% по сравнению с исходным прогноз считают неблагоприятным.