СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА Российский патент 2003 года по МПК G01N33/92 G01N33/48 

Способ относится к области медицины и может быть использован в кардиологии и терапии.

Известны способы прогнозирования течения ИБС путем оценки уровня липопротеинов (ЛП) крови (А.Н. Климов, Н.Г. Никульчева // "Липиды, липопротеиды и атеросклероз", 1995, Питер. пресс, стр. 98-102) и разделения на фракции ЛП в полиакриламидном геле (Н.Н. Шацкая // "Биохимические исследования в оценке состояния сердечно-сосудистой системы". В кн. "Методы исследований в профпатологии", М., 1988, стр. 95-97).

Описанные способы не позволяют выявить все фракции ЛП крови, включая ХМ, ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП и ЛП (а), а служат для разделения на фракции ХМ, ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП от комплекса альбумина с неэстерифицированными жирными кислотами.

Описан также способ разделения на фракции ЛП путем электрофореза в геле агарозы (Лабораторные методы исследования. Под редакцией В.В. Меньшикова. М. : Медицина, 1987, с. 248-249).

Данный способ является наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату (прототипом). Однако указанный способ недостаточно точен, так как не позволяет выявить модифицированные ЛП (а), кроме ЛПНП, ЛПОНП с одновременным определением общего холестерола сыворотки крови. Это связано с исследованием малого образца сыворотки крови, не подготовленного для выявления модифицированных ЛП. Концентрация ЛП (а) в крови очень низкая. В способе-прототипе лунка для внесения исследуемого образца сыворотки крови готовится в объеме металлического (стального) бруска с площадью основания 2•20 мм и высотой 10 мм, что не позволяет внести достаточно большой объем сыворотки крови или преципитатов сыворотки крови для исследования.

Целью способа является повышение точности способа.

Указанная цель достигается техническим решением, представляющим собой проведение дополнительной обработки сыворотки крови 7% ПЭГ-6000, 7% ПЭГ-6000 преципитат сыворотки крови инкубируют с красителем суданом Б при температуре 40^oС в темном термостате и проводят исследование 7% ПЭГ-6000 преципитата сыворотки крови, в 2 раза по объему превышающего таковой по сравнению со способом-прототипом с последующей денситометрией фракций ЛП сыворотки крови с их количественной оценкой.

Новым в данном способе является дополнительная обработка сыворотки крови 7% ПЭГ-6000, инкубация 7% ПЭГ-6000 преципитата сыворотки крови с красителем суданом Б в течение часа в темном термостате при температуре 40^oС и заготовка лунки в геле агарозы для внесения исследуемого образца сыворогки крови, в 2 раза по объему превышающего таковой в способе-прототипе. Лунка изготавливается с помощью стального бруска с площадью основания 4•20 мм, а не 2•20 мм, как в способе-прототипе. Затем проводится денситометрия ЛП.

Следовательно, только комплексная модернизация способа-прототипа позволяет получить желаемый результат.

Для получения ПЭГ-6000 преципитата сыворотки крови используется 7% ПЭГ-6000. Известно, что 8% ПЭГ-6000 является предельной концентрацией для получения преципитатов сыворотки крови, содержащих иммунные комплексы и не содержащих грубодисперсных белков сыворотки крови. Применение 6% ПЭГ-6000 не позволяет полностью осадить иммунные комплексы сыворотки крови. Поэтому для повышения точности способа экспериментальным путем была выбрана 7% концентрация ПЭГ-6000, позволяющая с одной стороны полностью осадить иммунные комплексы (ИК) сыворотки крови с гарантией отсутствия грубодисперсных (высокомолекулярных) белков сыворотки крови, а с другой стороны позволяющая полностью осадить ИК, присутствующие в сыворотке крови. Так в случае концентрации ИК в сыворотке крови, равной 2,5 г/л, эта же концентрация ИК выявлялась в 7% ПЭГ-6000 преципитате крови с результатом ±3%, что связано с увеличением числа манипуляций, а не с изменением концентрации ИК в преципитатах сыворотки крови.

Дополнительная инкубация 7% ПЭГ-6000 преципитата сыворотки крови с красителем суданом Б повышает сродство красителя к ЛП крови, а увеличение объема, взятого для исследований образца крови, позволяет выявить модифицированные ЛП(а), содержащиеся в крови больных ишемической болезнью сердца (ИБС) в очень низких концентрациях, что позволяет повысить точность способа и получить желаемый результат. Предлагаемый способ позволяет выявлять следующие классы модифицированных ЛП: ЛПНП, ЛПОНП и ЛП(а) (мЛПНП, мЛПОНП, мЛП(а)) и проводить последующую денситометрию фракций модифицированных ЛП сыворотки крови с их количественной оценкой.

В случае снижения уровня модифицированных ЛП(а) у больных ИБС после лечения на 50% и более прогнозирование течения ИБС считают благоприятным. Впервые прогнозирование течения ИБС оценивалось по изменению уровня модифицированных ЛП(а) после денситометрии электрофореграммы модифицированных ЛП крови.

Каждый вновь введенный в формулу изобретения признак выполняет функцию повышения точности и эффективности способа.

Отличительные признаки проявили в заявленной совокупности новые свойства.

Идентичной совокупности признаков в известных решениях не обнаружено.

Данный способ возможно использовать в клинической практике.

Таким образом, данное решение соответствует критериям изобретения: "новизна", "практическая применимость", "изобретательский уровень".

В настоящее время особое внимание уделяется исследованию модифицированных ЛП(а), в связи с чем разрабатываются способы лабораторной диагностики, позволяющие исследовать этот липопротеин крови, относящийся к апо-В-содержащим липопротеинам, богатым холестеролом (ХС). ЛП(а) идентичен "тонущим" пре-β-ЛП (sinking pre-β-Lp), имеющим при электрофорезе подвижность пре-β-ЛП. ЛП(а) содержат 27% белка, 8% углеводов и 65% липидов, из которых ЭХС составляют 59%, НЭХС - 14%, ФЛ -14%.

Белковым компонентом ЛП(а) является высокогликозилированный полипептид - апо(а), имеющий близкое структурное сродство к плазминогену - одному из факторов системы свертывания - противосвертывания крови. При росте концентрации как ЛП(а), так и его модифицированных форм в крови нарушаются процессы микроциркуляции в кровеносных артериях с возможным образованием микротромбов.

Благодаря наличию в структуре апо(а) сиаловых кислот, ЛП(а) более отрицательно заряжен по сравнению с β-ЛП в электрическом поле, лучше растворим в воде, может взаимодействовать с ионами металлов (кальция). Этот липопротеин и его модифицированные формы гетерогенны. Все это свидетельствует об особой роли мЛП(а) в атерогенезе.

Модифицированные ЛП(а) могут взаимодействовать с ЛПНП-рецепторами, оказывая слабое влияние на В, Е - активность ГМК - Ко А редуктазы, на эстерификацию ХС. Период полураспада ЛПа) длиннее, чем у ЛПНП и составляет 3,3 суток. Содержание ЛП(а) в крови в норме не превышает 30 мг/л и обычными методами исследования ЛП(а) определить невозможно. При высокой концентрации в крови ЛП(а) выявляется в местах поражения сосудов в области скопления фибриногена. Повышенная концентрация ЛП(а) часто сочетается с II^а, II^б типами гиперлипопротеидемий, при которых достаточно часто выявляются модифицированные ЛП. Поэтому в клинической практике крайне важно определение ЛП(а) и его модифицированных форм. Установлено, что большинство гиполипидемических препаратов не влияет на повышенный уровень ЛП(а). Результаты мировых популяционных исследований показали, что ЛП(а) представляет собой самостоятельный и независимый фактор риска ИБС - наиболее тяжелого проявления атеросклероза. У здоровых лиц в 7% ПЭГ-6000 преципитатах крови ЛП отсутствуют. Модифицированные ЛПНП, ЛПОНП, ЛП(а) могут появляться в их составе при атеросклерозе.

Все сказанное свидетельствует о крайней важности разработки способов лабораторной диагностики, позволяющих выявлять ЛП(а).

В настоящее время в широкой клинической лабораторной практике отсутствуют способы определения ЛП(а). В то же время популярность способа электрофоретического разделения на фракции ЛП крови в геле агарозы обусловлена его высокой чувствительностью, простотой осуществления и достаточной адекватностью получаемых результатов (Лаб. дело, 1980, 5, стр. 287-290).

Метод основан на электрофоретической подвижности ЛП крови.

Изобретение будет понятно из следующего описания приложенных фигур.

Способ осуществляется следующим образом поэтапно:
1) приготовление раствора судана Б: 400 мг судана Б растворяют в 20 мг этиленгликоля на кипящей водяной бане в течение 50 минут, фильтруют, хранят в стеклянной посуде;
2) приготовление геля агарозы: 320 мг агарозы А фирмы "Sigma" растворяют в 20 мл воды при кипячении, затем помещают в термостат при 55^oС; добавляют 20 мл раствора альбумина (1 г альбумина в 200 мл веронал-мединалового буфера, рН 8,6). 3 мл геля агарозы наносят на обезжиренное горизонтально установленное предметное стекло, помещают металлический стальной стержень-брусок 20х4 мм (высотой 10 мм), который после застывания геля убирают магнитом;
3) к 1 мл сыворотки крови добавляют 40 мл 7% ПЭГ-6000, инкубируют 1 час при 20^oС, центрифугируют 40 мин при 18000 g. Осадок дважды промывают фосфатным буфером с рН= 7,25. 0,25 мл раствора преципитата используют для электрофоретического исследования;
4) к 0,25 мл 7% ПЭГ-6000 преципитата сыворотки крови добавляют 0,15 мл раствора судана Б, помещают на 1 час в темный термостат при 40^oС, затем добавляют 0,2 мл горячего раствора геля агарозы, смешивают, подогревают при 55^oС и подогретым вносят в желобок геля агарозы;
5) предметное стекло помещают в камеру для электрофореза слоем агарозы вниз, электрофорез проводят в течение часа в холодильной камере при температуре 4^oС при напряжении 100 В и силе тока 40-45 мА;
6) электрофореграмму фиксируют в 5% растворе уксусной кислоты в течение одного часа, затем высушивают между листами фильтровальной бумаги, непрерывно смачивая 96% этиловым спиртом;
7) денситометрию проводят на микрофотометре МФ-4.

Количественную оценку фракций при денситометрии проводят следующим образом: определяют площадь каждого пика на хроматограмме по формуле
S=h•B1/2h,
где S - площадь пика, h - высота пика, B1/2h - ширина пика на половине его высоты.

Расчет проводится автоматически по соответствующей программе и конечным результатом является процентное содержание каждой фракции ЛП, если она есть, по отношению ко всей сумме фракций, принятой за 100%.

Общий холестерин крови определяют унифицированным методом в динамике.

Метод основан на измерении оптической плотности вещества, образующегося при взаимодействии холестерола и его эфиров с реактивом Либермана-Бурхарда. Большая часть холестерола находится в сыворотке крови в этерифицированном виде. Продукт реакции холестерола с указанным реактивом поглощает свет в той же области спектра и имеет несколько больший коэффициент экстинкции, чем продукт реакции свободного холестерола. Для учета этого различия, а также частичного учета матричных эффектов (влияния белков и биллирубина на результаты анализа) калибровка метода проводится по калибровочной сыворотке, содержание холестерола в которой определено референсным методом Абеля-Кендала.

Приготовление реактива Либермана-Бурхарда.

600 мл уксусного ангидрида и 300 мл уксусной кислоты наливают в двухлитровую колбу, помещают в ледяную баню и перемешивают на магнитной мешалке, затем приливают 100 мл охлажденной серной кислоты. Через 30 мин колбу удаляют из ледяной бани, ставят на мешалку и добавляют 20 г сульфата натрия, перемешивают до полного растворения соли 4-5 часов. Реактив стабилен 2 недели.

Ход анализа
1. В сухие пробирки разливают по 5 мл реактива Либермана-Бурхарда, помещают в водяную баню.

2. В первую пробирку наливают 0,2 мл дистиллированной воды (по стенке, медленно в течение 10 минут). Осторожно встряхивают и помещают в водяную баню.

3. С интервалом в 2 мин в остальные пробирки приливают по 0,2 мл исследуемой сыворотки, встряхивают, помещают в водяную баню.

4. Через 25 мин после добавления воды в первой пробирке измеряют оптическую плотность ее содержимого против воды. Далее измеряют исследуемые пробы при длине волны 625±10 нм.

5. Рассчитывают концентрацию холестерина в сыворотках крови по сравнению с калибровочной.

Для растворов продуктов реакции Либермана-Бурхарда чакон Бугера-Ламберта-Бера соблюдается в пределах 0-400 мг/дл холестерола.

При проведении повторного исследования после лечения величина фракции модифицированных ЛП(а) до лечения принимается за 100% и рассчитывается процентное значение величины снижения фракции модифицированных ЛП(а) после проведенной терапии ИБС.

В группе контроля в случае использования способа-прототипа (n=10) и предлагаемого способа (n=12) липопротеины не выявлены (фиг.1 и фиг.2). Оценен уровень общего ХС крови, который составил у первых 10 пациентов 4,3±0,2 ммоль/л и у второй группы пациентов 5,1±0,3 ммоль/л. Нами обследованы 2 группы больных ИБС до и после лечения по 10 пациентов для способа-прототипа - I группа и 32 пациентов - II группа для предлагаемого способа
Диагноз пациентов: ИБС, стенокардия напряжения, ФК III-IV.

У пациентов I группы до лечения выявились мЛПНП, мЛПОНП (фиг.3, 4). Уровень ХС сыворотки крови составил у них 7,8±0,5 ммоль/л. После лечения при электрофорезе фракции мЛПОНП и мЛПНП стали менее интенсивными (фиг.5, 6).

Уровень общего ХС сыворотки крови после лечения составил 5,9±0,4 ммоль/л. Диагноз после лечения: ИБС, стенокардия напряжения, ФК II-III. Заключение: прогноз течения ИБС благоприятный, но недостаточно точный.

В случае же использования дополнительно к способу-прототипу только добавочной инкубации исследуемого образца Суданом Б 1 час в темном термостате при температуре 40^oС и внесении его в лунку 2•20 мм, либо только увеличении объема лунки до 4•20 мм без дополнительной инкубации пробы фракции мЛПНП и мЛПОНП выявлялись несколько лучше, чем в контроле, а мЛП(а) определялась в виде следовой полосы, что не позволяло ее денситометрировать и, следовательно, оценивать количественно (фиг.7, 8).

После лечения ИБС у 6 пациентов выявлялась следовая трудно определяемая фракция модифицированных ЛП(а), у 20 пациентов мЛП(а) не выявлялась.

Уровень общего ХС сыворотки крови после лечения составил во всей группе 6,4±0,5 ммоль/л. Диагноз после лечения у пациентов этой группы (27 человек): ИБС, стенокардия напряжения, ФК II. Заключение: прогноз течения ИБС благоприятный. Пациенты этой группы представлены в клинических примерах. У одного пациента второй группы при снижении общего холестерола крови после лечения уровень ЛП(а) в сыворотке крови остался достаточно высоким. Динамики после лечения выявлено не было. Прогноз течения ИБС у этого пациента расценивался как неблагоприятный.

Ложноположительных и ложноотрицательных случаев нами не выявлено, т.к. оценивались только объективные критерии эффективности проводимой терапии ИБС: результаты велоэргометрии, частота приступов стенокардии и соответственно доза принятого нитроглицерина, а также результаты лабораторных методов исследования, выраженные количественно.

Пример 1. Больной П., 57 года, история болезни 194, поступил в отделение ИБС и атеросклероза НИИ кардиологии г. Томска. Жалобы при поступлении на боли в области сердца колющего характера, иррадиирующие в левую подлопаточную область. Боли возникали после физической и эмоциональной нагрузки, снимались нитратами пролонгированного действия. Велоэргометрия была прекращена при нагрузке 50 Вт по причине усиления загрудинных болей. АД 150/110 мм рт. ст., пульс в покое 66 уд. в мин. Боли купируются нитроглицерином.

Результаты лабораторного исследования:
ХС общий - 7,6 ммоль/л
Триацилглицериды - 1,2 ммоль/л
ХС ЛПВП - 1,1 ммоль/л.

Результаты электрофоретического исследования ЛП 7% ПЭГ-6000 преципитата сыворотки крови но способу-прототипу представлены на фиг.9, а по предлагаемому способу на фиг.10. Выявлены фракции мЛПНП, мЛПОНП и мЛП(а).

Диагноз при поступлении: ишемическая болезнь сердца, стенокардия напряжения, ФК III-IV.

После проведенного лечения результаты лабораторного исследования:
ХС общий - 5,5 ммоль/л
Триацилглицериды - 1,1 ммоль/л
ХС ЛПВП-1,6 ммоль/л.

При электрофоретическом исследовании модифицированных ЛП 7% ПЭГ-6000 преципитата сыворотки крови по предлагаемому способу фракции ЛП не выявлены. Фиг.11 содержит только линию старта.

Заключение: отсутствие мЛП(а) свидетельствует о значительном улучшении состояния больного. Фракция мЛПНП ослаблена.

Диагноз при выписке: ишемическая болезнь, стенокардия напряжения, ФК - II. Заключение: прогноз течения ИБС благоприятный, о чем свидетельствует уменьшение функционального класса стенокардии напряжения с III-IV до II.

Пример 2. Больной И., 53 лет, история болезни 175, поступил в отделение ИБС и атеросклероза НИИ кардиологии г. Томска с жалобами на боли в области сердца, иррадиирующие под лопатку, возникающие при физической нагрузке. ВЭМ прекращена при нагрузке 50 Вт по причине загрудинной боли и одышки. АД 150/110 мм. рт. ст., пульс в покое 64 уд. в мин. Боли купируются нитроглицерином.

Результаты лабораторного исследования:
ХС общий - 7,2 ммоль/л
Триацилглицериды - 1,5 ммоль/л
ХС ЛПВП - 0,9 ммоль/л
Результаты электрофореза 7% ПЭГ-6000 преципитата сыворотки крови выявили наличие мЛПНП, мЛПОНП и мЛП(а) (фиг.12). Результаты денситометрии мЛП: мЛПНП - 52%, мЛПОНП - 40%, мЛП(а) - 8%.

Диагноз при поступлении: ИБС, стенокардия напряжения, ФК III-IV.

После проведенного лечения результаты лабораторного исследования:
ХС общий - 5,1 ммоль/л
Триацилглицериды - 1,6 ммоль/л
ХС ЛПВП - 1,3 ммоль/л.

Результаты электрофоретического исследования мЛП крови по предлагаемому способу после лечения представлены на фиг.13.

Результаты денситометрии мЛП: мЛПНП - 54%, мЛПОНП - 44%, мЛП(а) - 2%.

Диагноз при выписке: ИБС, стенокардия напряжения, ФК II. Снижение уровня мЛП(а) на 75%, а ХС - на 30% по сравнению с исходным свидетельствовало об эффективности лечения ИБС. Заключение: прогноз течения ИБС благоприятный, о чем свидетельствует уменьшение функционального класса стенокардии напряжения с III-IV до II.

Итак, при применении способа-прототипа прогноз течения ИБС основывался на уровне ХС общего крови и клинических данных, поэтому был недостаточно точным (см. фиг.7 и 8).

Способ применен у 42 пациентов с ИБС и 22 пациентов группы сравнения (контроль) с нейроциркуляторной дистонией.

При снижении уровня мЛП(а) на 50% и более и ХС общего сыворотки крови на 25% и более прогноз течения ИБС был оценен как благоприятный, о чем свидетельствовало изменение функционального класса (ФК) стенокардии напряжения, а при изменении только одного из показателей был установлен неблагоприятный прогноз течения ИБС (переход стабильного течения в нестабильную форму стенокардии).

Ложноположительных случаев прогнозирования течения ИБС при использовании предлагаемого нами способа не наблюдалось. При этом предлагаемый способ прост в исполнении и интерпретации полученных результатов.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для диагностики течения ишемической болезни сердца (ИБС). Способ обеспечивает повышение точности прогноза течения ИБС. Проводят исследование липидов сыворотки крови. При этом дополнительно определяют до и после лечения модифицированные ЛП(а) путем инкубации 7% ПЭГ-6000 преципитата сыворотки крови с раствором судана Б в течение 1 ч в темном термостате при 40^oС и затем внесения пробы в лунку в геле арагозы с площадью основания 4•20 мм для электрофореза и при снижении уровня мЛП(а) на 50% и более по сравнению с исходным уровнем прогноз течения заболевания считают благоприятным, способствующим переходу стенокардии напряжения ФК III-IV в ФК I-II, а при снижении уровня мЛП(а) менее 50% по сравнению с исходным уровнем прогноз считают неблагоприятным. 13 ил.

Способ прогнозирования течения ишемической болезни сердца путем исследования липидов сыворотки крови, отличающийся тем, что дополнительно определяют до и после лечения модифицированные ЛП(а) путем инкубации 7% ПЭГ-6000 преципитата сыворотки крови с раствором судана Б в течение 1 ч в темном термостате при 40^oС и затем внесения пробы в лунку в геле арагозы с площадью основания 4•20 мм для электрофореза и при снижении уровня ЛП(а) на 50% и более по сравнению с исходным уровнем прогноз течения заболевания считают благоприятным, способствующим переходу стенокардии напряжения ФК III-IV в ФК I-II, а при снижении уровня мЛП(а) менее 50% по сравнению с исходным уровнем прогноз считают неблагоприятным.