ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus thuringiensis, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВОВИРУСНОЙ И АНТИКАНДИДОЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2010 года по МПК C12N1/20 A61K45/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии и касается нового штамма Bacillus thuringiensis (Bt), обладающего противовирусной активностью, в частности, относительно высокопатогенного вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (A/H5N1) и антикандидозной активностью, в частности, относительно Candida albicans 620.

Известно, что бактерии вида Bacillus thuringiensis (Bt), способные формировать параспоральные кристаллические включения белковой природы [1], обладают избирательным антагонистическим действием в отношении микроорганизмов [2, 3].

Антибиотическое действие Bt более всего проявляется относительно бактерий, дрожжей и грибов. Известна также противовирусная активность штаммов Bt, используемая в основном против фитопатогенов, вредителей сельскохозяйственных растений [4].

Известен консорциум микроорганизмов, включающий Bacillus licheniformis, штаммы родов Saccharomycetes, Azotobacteria, штаммы P. bacteria, К. bacteria и Bacillus thuringiensis, который обладает противовирусной активностью (патент Китая №1274702, МПК C12N 1/00, опубл. 29.11.2000).

Известен штамм бактерий Bacillus thuringiensis ВКПМ В-9790, проявляющий фунгицидную активность, инсектицидную активность против личинок колорадского жука и личинок листоедов и подавляющий вирулентные свойства фитопатогенных бактерий Erwinia carotovora (патент РФ №2347809, МПК A01N 63/00, опубл. 27.02.2009 г.).

Наиболее близким аналогом (прототипом) является штамм VNPB 17-3 бактерий Bacillus thuringiensis (патент США №6528480, МПК A01N 63/00, опубл. 04.03.2003 г.), содержащий белковый токсин, обладающий противовирусным действием против вируса табачной мозаики.

Однако все вышеприведенные аналоги и прототип не обладают ингибирующим действием против высокопатогенного вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (A/H5N1), а также антикандидозной активностью.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является выявление новых бактериальных штаммов, обладающих ингибирующей активностью в отношении вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (A/H5N1) и антикандидозной активностью.

Указанный технический результат достигается за счет получения двух бактериальных штаммов В. thuringiensis Долины гейзеров с близкими противовирусными и антикандидозными свойствами, обладающих ингибирующим действием относительно высокопатогенного вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (A/H5N1) и против возбудителя кандидозов Candida albicans 620.

Штаммы депонированы в коллекции микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора) под коллекционными номерами: В. thuringiensis В-1065 и В. thuringiensis В-1083.

Выявление наличия антагонистической активности штаммов Bacillus thuringiensis В-1065 и Bacillus thuringiensis В-1083 относительно патогенного штамма Candida albicans и против вируса птичьего гриппа A/H5N1 проводится впервые, следовательно, можно сделать вывод о соответствии предлагаемых штаммов критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень».

Источник выделения штаммов

Кристаллообразующие, содержащие эндоспоры бактерии В. thuringiensis В-1065 и В. thuringiensis В-1083 были выделены из образцов почвы Долины гейзеров (Камчатка) при их высеве на полную агаризованную среду со значением pH 7,0 и при температуре инкубирования 28-30°С.

Морфология штаммов

Штамм В. thuringiensis В-1065 на агаризованной среде А формирует влажные, ослизненные, белесые, высокие, непрозрачные, блестящие колонии. Клетки штамма капсулированные, палочковидные, размером 1-1.2×2-8 мкм, прямые или слабо изогнутые, расположены по 1-2 или в цепочках, параспоральные включения округлой формы плотно прилегают к эллиптической споре в виде шляпки гриба. Расположение параспоральных включений на споре свободное, диаметр кристалла, как правило, превышает диаметр споры. В отличие от большинства типовых штаммов Bt споры и параспоральные включения исследуемого штамма остаются соединенными после разрушения спорангия.

Штамм В. thuringiensis В-1083 на агаризованной среде А формирует матовые, мелкозернистые, непрозрачные, белесые колонии. Клетки штамма капсулированные, палочковидные, как правило, подвижные, прямые или слабо изогнутые, размером 1-1.2×2-8 мкм, расположены по 1-2 или в цепочках. Параспоральные включения округлые, соединены со спорой не плотно, просматривается наличие связующих их структур, центральные оси споры и кристалла совпадают.

Биохимические признаки штаммов

Штаммы В. thuringiensis В-1065, В. thuringiensis В-1083 способны к анаэробному росту, выделяют кислоту из глюкозы и мальтозы, но не из арабинозы, ксилозы, маннита и лактозы, не образуют индол, не дезаминируют фенилаланин, не утилизируют аргинин и цитрат. Штаммы обладают каталазной, лецитиназной, желатиназной, липазной, амилолитической активностями, растут в присутствии 0,001% лизоцима. Важно отметить, что исследуемые штаммы согласно результатам косвенных тестов на патогенность не имеют гемолитической, фибринолитической и плазмокоагулазной активностей.

Хранение штаммов

Субкультуры штаммов хранят периодическими пересевами на агаризованную среду A (0,7% пептона “Difco”, 0,4% рыбного гидролизата, 0,5% NaCl, 1,7% агара, pH 7,0-7,2) и в 15% растворе глицерина при низкотемпературном замораживании при минус 65°С [5].

Посевной материал получают при выращивании штаммов на жидких или агаризованных средах: LB (0,25% LB “Difco”, 1,7% агара) и среде А (0,7% пептона “Difco”, 0,4%) рыбного гидролизата, 0,5% NaCl, 1,7% агара). Значение pH всех сред составляет 7,0-7,2.

Ниже приведены данные по исследованию антагонистической активности препаратов на основе водорастворимых метаболитов штаммов В. thuringiensis В-1065 и В. thuringiensis В-1083 против возбудителя кандидозов Candida albicans 620. Для исследования антагонистической активности штаммов использовали препараты, приготовленные на основе культуральной жидкости штаммов В. thuringiensis В-1065 и В. thuringiensis В-1083.

Пример 1. Испытание антикандидозного действия препарата, приготовленного на основе культуральной жидкости (КЖ) штамма Bacillus thuringiensis В-1065

Приготовление бактериального препарата на основе КЖ штамма В-1065. С использованием культуры исследуемого штамма, наработанной на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°С, готовили суспензию клеток с концентрацией 1-5×10⁷ кл./мл. Суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 25 мл среды LB и культивировали в течение 2-х суток на термостатированной качалке (КТ 104, Россия) при температуре 28-30°С и скорости вращения 190 об/мин до стадии активной споруляции клеток. Полученную КЖ выдерживали в течение 4-х суток в холодильнике при температуре 4-6°С, микроскопировали методом фазового контраста (микроскоп Axioskop 40, “Карл Цейсе”, Германия) и для испытания антимикробного действия отбирали субкультуры, где уровни споруляции и образования кристаллов достигали 70-95%). После этого клетки осаждали центрифугированием при 10000 об/мин (центрифуга Beckman, США) в течение 20 мин, надосадочную жидкость отбирали стерильным шприцем и фильтровали через Whatman фильтр с размерами пор 0,2 мкм, полученный препарат хранили при минус 20°С.

Определение антимикробного действия препарата. В асептических условиях к 2,9 мл отфильтрованной КЖ Bacillus thuringiensis В-1065 добавляли по 0,1 мл суспензии С.albicans с концентрацией клеток 3,9×10⁷ кл./мл и инкубировали при температуре 28-30°С в течение 48 часов. Наличие антикандидозной активности полученного препарата оценивали визуально по осветлению опытного варианта КЖ относительно контроля культуры С.albicans, куда препарат штамма В. thuringiensis В-1065 не добавляли, и при титровании опытной и контрольной КЖ на плотной питательной среде.

В результате совместного инкубирования штамма С.albicans и КЖ штамма В. thuringiensis В-1065 в течение 24 часов при температуре 28-30°С численность клеток С.albicans снижалась по сравнению с таковой в контроле на 2 порядка (с 5,9×10⁶ до 3,9×10⁴ кл./мл). Через 48 часов культивирования жизнеспособные клетки С.albicans в опытном варианте полностью отсутствовали.

Пример 2. Испытание антикандидозного действия препарата, приготовленного на основе культуральной жидкости штамма Bacillus thuringiensis В-1083

Приготовление бактериального препарата на основе культуральной жидкости штамма В-1083. С использованием культуры исследуемого штамма, наработанной на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°С, готовили суспензии клеток с концентрацией 1-5×10⁷ кл./мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 25 мл среды LB и культивировали в течение 2-х суток на термостатированной качалке при температуре 28-30°С и скорости вращения 190 об/мин до стадии активной споруляции клеток. Полученную культуральную жидкость выдерживали в течение 4-х суток в холодильнике при температуре 4-6°С, микроскопировали методом фазового контраста и для испытания антимикробного действия отбирали субкультуры, где эффективность споруляции и эффективность образования кристаллов достигали 70-95%. После этого клетки осаждали центрифугированием при 10000 об/мин в течение 20 мин, надосадочную жидкость отбирали стерильным шприцем и фильтровали через Whatman фильтр с размерами пор 0,2 мкм.

Определение антимикробного дейстия препарата. В асептических условиях к 2,9 мл отфильтрованной КЖ Bacillus thuringiensis В-1083 добавляли по 0,1 мл суспензии С.albicans (3,9×10⁷ кл./мл) и инкубировали при температуре 28-30°С в течение 48 часов. Наличие антикандидозной активности полученного препарата оценивали визуально по осветлению опытного варианта КЖ относительно контроля культуры С.albicans, куда препарат штамма В. thuringiensis В-1083 не добавляли, и при титровании КЖ на плотной питательной среде.

В результате совместного инкубирования штамма С.albicans и КЖ штамма В. thuringiensis В-1083 в течение 24 часов при температуре 28-30°С титр клеток С.albicans падал по сравнению с титром в контроле на 3 порядка (с 6,0×10⁶ до 3,0×10³ кл./мл). Через 48 часов культивирования жизнеспособные клетки С.albicans в опытном варианте полностью отсутствовали.

Таким образом, препараты, приготовленные на основе культуральной жидкости исследуемых штаммов Bacillus thuringiensis В-1083 и Bacillus thuringiensis В-1065 Долины гейзеров, показали более высокую активность против патогена Candida albicans по сравнению с аналоговым штаммом Bacillus thuringiensis.

Ниже приведены данные исследования токсичности и противовирусной активности водорастворимых метаболитов штаммов В. thuringiensis В-1065, В. thuringiensis В-1083 относительно вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (A/H5N1).

Пример 3. Исследование токсичности и противовирусной активности препаратов на основе водорастворимых метаболитов штаммов В. thuringiensis В-1065 и В. thuringiensis В-1083

Получение препарата на основе культуральной жидкости. С использованием культур исследуемых штаммов, наработанных на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°С, готовили суспензии клеток с концентрацией 1×10⁷ кл./мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки (КТ 104, Россия). Для приготовления препаратов использовали клеточные культуры бацилл, находящиеся в вегетативной стадии развития. Отсутствие процесса споруляции и формирования параспоральных включений контролировали при микроскопировании культур методом фазового контраста.

Для приготовления препарата на основе культуральной жидкости полученную КЖ штамма центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр с размерами пор 0,2 мкм и использовали для испытания в качестве противовирусного препарата. Хранили препарат до использования при температуре минус 20°С.

Получение препарата на основе лизатов клеток. Осадки клеток, полученные после центрифугирования и освобожденные от надосадочной жидкости, ресуспендировали в 4 мл дистиллированной Н₂O и обрабатывали до 15 раз на УЗ-дезинтеграторе (амплитуда 18) в течение 30” с интервалом 30”, добиваясь максимально полного разрушения клеток. Отсутствие спор и параспоральных кристаллов, степень разрушения клеток в суспензии после обработки УЗ контролировали с помощью фазово-контрастной микроскопии. После УЗ-обработки разрушенные клетки осаждали центрифугированием при 8000 об/мин на микроцентрифуге, супернатант отбирали и стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр с размерами пор 0,2 мкм. Полученный препарат хранили до использования при температуре минус 20°С.

Подготовка к тестированию штамма вируса и культуры клеток. Для оценки противовирусной эффективности полученных препаратов Bt использовали высокопатогенный вирус гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (A/H5N1) из коллекции ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, наработанный на 10-суточных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). Концентрация вируса в вирусаллантоисной жидкости (ВАЖ) составляла 9,5 lgЭИД₅₀/мл (50% эмбриональных инфицирующих доз в мл). Для тестирования токсичности и противовирусной активности препаратов использовали перевиваемую культуру клеток MDCK, полученных из коллекции культур клеток ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. В стерильном месте суспензию с известной концентрацией клеток разводили предварительно подогретой до температуры 37°С средой Axcevir-MDCK, фирмы Stem Alpha (Франция) до концентрации 1×10⁵ кл./мл и по 100 мкл вносили в лунки 96-луночных планшетов. Планшеты с клетками помещали в термостат при температуре 37°С, 5% СO₂ и 100% влажности на 2-3 суток до образования монослоя.

Определение токсичности препарата. Для определения токсических доз препараты разводили в 2, 10, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000 раз средой Axcevir-MDCK, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета с клетками MDCK и ставили в термостат при температуре 37°С, 5% СO₂ и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов. Для определения противовирусной активности препаратов использовали максимально переносимые концентрации (МПК).

Определение противовирусной активности препаратов. Для определения противовирусной активности препаратов готовили десятикратные разведения ВАЖ от 1 до 8 с использованием среды Axcevir-MDCK, содержащей 2 мкг/мл трипсина. В монослой культуры клеток MDCK вносили по 50 мкл выбранного разведения препарата и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°С в атмосфере 5% СO₂ в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.

Ниже приведены примеры 4, 5, 6 и 7 конкретного применения заявляемых штаммов.

Пример 4. Испытание противовирусного действия препарата №35, приготовленного на основе культуральной жидкости штамма Bacillus thuringiensis В-1065

Подготовка бактериального препарата №35. С использованием культуры штамма Bacillus thuringiensis В-1065, наработанной на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°С, готовили суспензию клеток с концентрацией 1-5×10⁷ кл./мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки. Для приготовления препарата использовали клеточные культуры, находящиеся в вегетативной стадии развития. Отсутствие процесса споруляции и формирования параспоральных включений контролировали при микроскопировании культуры методом фазового контраста.

Для приготовления препарата полученную КЖ штамма В. thuringiensis В-1065 центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр с размерами пор 0,2 мкм. Полученный препарат №35 хранили до использования при температуре минус 20°С.

Определение токсичности препарата №35. Для определения токсических доз препарат разводили в 2, 10, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000 раз средой Axcevir-MDCK, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета с клетками MDCK и ставили в термостат при температуре 37°С, 5% CO₂ и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов. Препарат №35 был нетоксичен на клеточной культуре MDCK при всех используемых разведениях. Для оценки противовирусной активности препарата №35 использовали его разведение в 2 раза.

Определение противовирусной активности препарата №35. Для определения противовирусной активности препарата готовили десятикратные разведения ВАЖ от 1 до 8 с использованием среды Axcevir-MDCK, содержащей 2 мкг/мл трипсина. В монослой культуры клеток MDCK вносили по 50 мкл/лунку препарата, разведенного в 2 раза средой Axcevir-MDCK, и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°С в атмосфере 5% CO₂ в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.

При высокой инфекционности вируса на клетках MDCK (титр в lgТЦД₅₀/мл составил 9,5) ее нейтрализация под влиянием препарата №35 составляла 8 lg.

Пример 5. Испытание противовирусного действия препарата №59, приготовленного на основе лизатов клеток штамма Bacillus thuringiensis В-1065

Подготовка бактериального препарата №59. С использованием культуры штамма Bacillus thuringiensis В-1065, наработанной на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°С, готовили суспензию клеток с концентрацией 1×10⁷ кл./мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки. Для приготовления препарата №59 использовали клеточные культуры бацилл, находящиеся в вегетативной стадии развития. Полученную культуральную жидкость центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге. После центрифугирования надосадочную жидкость убирали, а осадок клеток ресуспендировали в 4 мл дистиллированной воды и 15 раз обрабатывали на УЗ-дезинтеграторе (амплитуда 18) в течение 30” с интервалом 30”. При этом степень разрушения клеток штамма Bacillus thuringiensis В-1065 составила 80%. Отсутствие спор и параспоральных кристаллов, степень разрушения клеток в суспензии после обработки УЗ контролировали с помощью фазово-контрастной микроскопии. После УЗ-обработки разрушенные клетки осаждали центрифугированием при 8000 об/мин на микроцентрифуге, супернатант отбирали и стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр, с размерами пор 0,2 мкм. Полученный препарат хранили до использования при температуре минус 20°С.

Определение токсичности препарата №59. Для определения токсических доз препарат разводили в 2, 10, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000 раз средой Axcevir-MDCK, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета с клетками MDCK и ставили в термостат при температуре 37°С, 5% CO₂ и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов. Препарат №59 был нетоксичен на клеточной культуре MDCK при всех используемых разведениях, для оценки противовирусной активности использовали его разведение в 2 раза.

Определение противовирусной активности препарата №59. Для определения противовирусной активности препарата готовили десятикратные разведения ВАЖ от 1 до 8 с использованием среды Axcevir-MDCK, содержащей 2 мкг/мл трипсина. В монослой культуры клеток MDCK вносили по 50 мкл/лунку препарата, разведенного в 2 раза средой Axcevir-MDCK, и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°С в атмосфере 5% CO₂ в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.

При высокой инфекционности вируса на клетках MDCK (титр в lgТЦД₅₀/мл составил 9,5) ее нейтрализация под влиянием препарата №59 составляла 7 lg.

Пример 6. Испытание противовирусного действия препарата №37, приготовленного на основе культуральной жидкости штамма Bacillus thuringiensis В-1083

Подготовка бактериального препарата №37. С использованием культуры штамма Bacillus thuringiensis В-1083, наработанной на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°С, готовили суспензию клеток с концентрацией 1-5×10⁷ кл./мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки. Для приготовления препаратов использовали клеточные культуры бацилл, находящиеся в вегетативной стадии развития. Отсутствие процесса споруляции и формирования параспоральных включений контролировали при микроскопировании культуры методом фазового контраста.

Для приготовления препарата №37 на основе культуральной жидкости полученную КЖ штамма центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге (JA-21, Beckman, США). Надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр с размерами пор 0,2 мкм. Полученный препарат хранили до использования при температуре минус 20°С.

Определение токсичности препарата. Для определения токсических доз препарат №37 разводили в 2, 10, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000 раз средой Axcevir-MDCK, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета с клетками MDCK и ставили в термостат при температуре 37°С, 5% CO₂ и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов. Препарат был нетоксичен на клеточной культуре MDCK при всех используемых разведениях. Для оценки противовирусной активности препарата №37 использовали его разведение в 2 раза.

Определение противовирусной активности препарата №37. Для определения противовирусной активности препарата №37 готовили десятикратные разведения ВАЖ от 1 до 8 с использованием среды Axcevir-MDCK, содержащей 2 мкг/мл трипсина. В монослой культуры клеток MDCK вносили по 50 мкл/лунку препарата, разведенного в 2 раза средой Axcevir-MDCK, и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°С в атмосфере 5% СO₂ в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.

При высокой инфекционности вируса на клетках MDCK (титр в lgТЦД₅₀/мл составил 9,5) ее нейтрализация под влиянием препарата №37 составляла 7 lg.

Пример 7. Испытание противовирусного действия препарата №53, приготовленного на основе лизатов клеток штамма Bacillus thuringiensis В-1083

Приготовление бактериального препарата №53. С использованием культуры штамма Bacillus thuringiensis В-1083, наработанной на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°С, готовили суспензию клеток с концентрацией 1-5×10⁷ кл./мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки. Для приготовления препарата №53 использовали клеточные культуры бацилл, находящиеся в вегетативной стадии развития. Полученную культуральную жидкость центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге. После центрифугирования надосадочную жидкость убирали, а осадок клеток ресуспендировали в 4 мл дистиллированной воды и обрабатывали 10 раз на У3-дезинтеграторе (амплитуда 18) в течение 30” с интервалом 30”. При этом степень разрушения клеток штамма Bacillus thuringiensis В-1053 составила 90%. Отсутствие спор и параспоральных кристаллов, степень разрушения клеток в суспензии после обработки УЗ контролировали с помощью фазово-контрастной микроскопии. После У3-обработки суспензию разрушенных клеток центрифугировали при 8000 об/мин на микроцентрифуге, супернатант отбирали, стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр с размерами пор 0,2 мкм. Полученный препарат №53 хранили до использования при температуре минус 20°С.

Определение токсичности препарата. Для определения токсических доз препарат №53 разводили в 2, 10, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000 раз средой Axcevir-MDCK, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета и ставили в термостат при температуре 37°С, 5% CO₂ и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов. Препарат был нетоксичен на клеточной культуре MDCK при всех используемых разведениях. Для оценки противовирусной активности препарата №37 использовали его разведение в 2 раза.

Определение противовирусной активности препарата №53. Для определения противовирусной активности препарата готовили десятикратные разведения ВАЖ от 1 до 8 с использованием среды Axcevir-MDCK, содержащей 2 мкг/мл трипсина. В монослой культуры клеток MDCK вносили по 50 мкл/лунку препарата, разведенного в 2 раза средой Axcevir-MDCK, и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°С в атмосфере 5% CO₂ в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.

При высокой инфекционности вируса на клетках MDCK (титр в lgТЦД₅₀/мл составил 9,5) ее нейтрализация под влиянием препарата №37 составляла 7 lg.

Таким образом, впервые было показано, что препараты, приготовленные на основе культуральной жидкости и лизатов штаммов Bacillus thuringiensis В-1065, Bacillus thuringiensis В-1083 Долины гейзеров, эффективно подавляли размножение высокопатогенного вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (A/H5N1) на клетках MDCK и проявили высокую активность против патогенного штамма Candida albicans 620.

Источники информации

1. Feitelson J.S., Payne J., Kim I. // Biotechnology. - 1992. - V.10. - P.271-275.

2. Юдина Т.Г., Бурцева Л.И. // Микробиология. - 1997. - Т.66. - №1. - С.25-31.

3. Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты / Под ред. Глупова В.В. - М.: Круглый год, 2001. - 716 с.

4. Ahern М., Verschueren S., van Sinderen D. // FEMS Microbiol. Letters. - 2003. - V.220. - P.127-131.

5. Методы общей бактериологии /Под ред Ф.Герхарда и др. - М.: Мир, 1983. - С.528.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Штаммы Bacillus thuringiensis депонированы в коллекции микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора) под коллекционными номерами: В. thuringiensis В-1065 и В. thuringiensis В-1083. Штаммы обладают противовирусной активностью и антикандидозной активностью. Препараты, приготовленные на основе культуралной жидкости и лизатов штаммов В. thuringiensis В-1065 и В. thuringiensis В-1083, эффективно подавляют размножение высокопатогенного вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (A/H5N1) и проявляют высокую активность против возбудителя кандидозов - патогенного штамма Candida albicans 620. 2 н.п. ф-лы.

1. Штамм бактерий Bacillus thuringiensis, обладающий противовирусной и антикандидозной активностью, депонированный в коллекции микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора» под регистрационным номером В-1065.

2. Штамм бактерий Bacillus thuringiensis, обладающий противовирусной и антикандидозной активностью, депонированный в коллекции микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора» под регистрационным номером В-1083.