Водорастворимый пигмент меланин из базидиального гриба Inonotus obliquus, обладающий противовирусной активностью Российский патент 2023 года по МПК A61K36/06 A61K31/785 C12N1/14 A61P31/12 A61P31/18 

Изобретение относится к противовирусному средству на основе меланина, полученного из высшего базидиального гриба Inonotus obliquus (чага) и может быть использовано в биотехнологии, фармацевтической промышленности и медицине.

Все виды меланиновых пигментов являются длинноцепочечными полимерами с гигантским молекулярным весом и сложной жидкокристаллической структурой. Известны сообщения о практическом использовании синтетических, полусинтетических и выделенных из биологических источников меланинов в медицине, косметологии, а благодаря их полупроводниковым свойствам, в технике и электронике.

Меланины, выделенные из микроорганизмов, показывают сходные свойства с меланинами животного происхождения. Это фармакологически активные вещества, обладающие антиоксидантными, антитоксическими, противовоспалительными, иммуностимулирующими свойствами, защищающими от фотодинамических повреждений и др.

Меланины - аморфные высокомолекулярные вещества, не растворимые в воде, минеральных кислотах, органических растворителях; хорошо растворимы в щелочах, а затем выпадают в осадок при подкислении растворов, что используется для их выделения.

По предшественникам меланины разделяют на эумеланины, феомеланины и алломеланины. Эумеланины (черные) и феомеланины (желтые, красные и коричневые) распространены у животных, алломеланины (черные) - в растениях, грибах, бактериях. Предшественник эумеланинов - тирозин, из него в организме получаются пигменты, содержащие С, H, N и О. Предшественники алломеланинов - дифенолы (пирокатехин и др.), из них образуются меланины, не содержащие азота.

Содержащиеся в грибах пигменты меланины - самые мощные биопротекторы, защищающие живую клетку от неблагоприятных внешних и внутренних воздействий. Это также и самые сильные природные антиоксиданты. Меланины способны нейтрализовать различные свободные радикалы, возникающие в живой клетке под действием проникающей радиации, ультрафиолетового облучения, различных токсинов и ферментов патогенных бактерий. У многих медицинских грибов, прежде всего у трутовиков, содержание меланинов высоко и может достигать 30% сухой массы и даже более. Часть грибных меланинов способна переходить в раствор и может всасываться в желудочно-кишечном тракте, разноситься кровью по организму и защищать живые клетки от разрушительного действия свободных радикалов (http://www.amrita.net.ua/pi/products_id/329).

Установлено, что меланин из чаги Inonotus obliquus и некоторых других трутовых грибов обладает фото- и радиопротекторным, антиоксидантным и генопротекторным свойствами [Щерба В.В., Бабицкая В.Г., Курченко В.П., Иконникова П.В., Кукулянская Т.А. Антиоксидантные свойства меланиновых пигментов грибного происхождения // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. - Т. 36. - №5. - С. 569-574; Сушинская Н.В., Курченко В.П., Горовой Л.Ф., Сенюк О.Ф. Получение и использование в медицине меланинов из трутовых грибов // Успехи медицинской микологии. - 2005. - Т. 6. - С. 255-259].

Известно противовирусное средство на основе водорастворимых меланинов, полученных химическим синтезом из следующих компонентов: L-дезоксидопамин, цистеин, L- дезоксидопамин/глутатион, L-тирозин, серотонин, допамин, адреналин и норадреналин (Патент США №5057325, МПК А61К 31/195, опубл. 1991 г.). Указанное противовирусное средство может защитить в условиях in vitro лимфоциты человека от вируса иммунодефицита (ВИЧ 1 и ВИЧ-2).

Однако в публикации отсутствуют сведения о противовирусной активности заявленного средства в отношении других вирусов, в частности, вирусов гриппа.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является противовирусное средство на основе водорастворимых меланинов (патент РФ №2480227, МПК А61К 36/06, опубл. 27.04.2013 г.). В качестве меланина средство содержит водорастворимый меланин, полученный экстракцией из чаги - природного базидиального гриба Inonotus obliquus и обладающий противовирусной активностью в отношении вируса гриппа, простого герпеса 2-го типа, иммунодефицита (ВИЧ-1) и осповакцины в концентрации от 0,002 мг/мл до 25 мг/мл. Водный раствор меланина из чаги в концентрации от 0,002 мг/мл до 0,2 мг/мл обладает активностью против вируса иммунодефицита (ВИЧ-1). В концентрации от 0,125 мг/мл до 1,56 мг/мл средство обладает активностью против вируса осповакцины. В концентрации от 0,02 мг/мл до 0,25 мг/мл средство обладает активностью против вируса гриппа. В концентрации от 0,006 мг/мл до 25,0 мг/мл средство обладает активностью против вируса простого герпеса 2 типа.

Однако природная чага является ограниченным источником сырья для получения меланинов, не отвечает в полной мере требованиям стандартизации, т.к. чага из разных регионов обладает разной биологической активностью, а также имеет недостаточно высокую противовирусную активность.

Из культивируемых грибов чага согласно исследованиям белорусских ученых [Щерба В.В., Бабицкая В.Г., Иконникова Н.В., Бисько Н.А. Факторы регуляции синтеза меланиновых пигментов местного штамма Inonotus obliquus. Успехи медицинской микологии, 2005, 6, 263-265] показала себя лучшим продуцентом меланинов среди трутовых грибов. Терапевтический индекс у меланина культивируемого березового гриба в случае A/H1N1pdm09н выше в 2,5 раза по сравнению с природным березовым грибом. Меланин культивируемого березового гриба является многообещающим веществом для разработки природных лекарств [Ильичева Т.Н., Ананько Г.Г., Косогова Т.А., и др. Противовирусная активность меланина из чаги (Inonotus obliquus), полученного на основе культивирования штамма F-1244, выделенного в чистую культуру. Химия растительного сырья, 2020, (2), 283-289. doi: 10.14258/JCPRM.2020025167

Техническим результатом предлагаемого изобретения является расширение сырьевой базы для получения меланина с более стандартизированными характеристиками по сравнению с природными источниками сырья (чагой), а также получение противовирусного средства на основе меланина, обладающего более высокой активностью против вирусов иммунодефицита человека и гриппа.

Указанный технический результат достигается тем, что водорастворимый пигмент меланин из базидиального гриба Inonotus obliquus, обладающий противовирусной активностью, согласно изобретения, указанный меланин получен щелочным гидролизом и очисткой из биомассы штамма базидиального гриба Inonotus obliquus F-1375, наработанной на питательной глюкозо-триптонной среде (ГТС), содержащей 10-20 мМолей тирозина, имеет индекс SI селективности от 33 до 192, характеризующий активность меланина против вируса иммунодифицита человека ВИЧ-1 в концентрации от 1,0 до 5,0 мкг/мл и индекс нейтрализации от 0,75 до 3,5 lg, характеризующий активность меланина против штаммов вируса гриппа (A/California/pdm09 (H1N1), A/Aichi/2/68 (H3N2) и A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) в концентрации 0,5 мг/мл.

Питательная среда для культивирования биомассы штамма базидиального гриба Inonotus obliquus F-1375 и последующего получения из нее меланина имеет следующий полный состав на 1 литр раствора при рН 7-8:

Тирозин 10-20 мМоль Глюкоза 30 г Триптон 10 г KH₂PO₄ 1,1 г K₂HPO₄×3H₂O 4,4 г MgSO₄×7H₂O 0,25 г Вода остальное

Синтез пигмента меланина происходит из аминокислоты тирозина под влиянием фермента тирозиназы в клетках эпидермиса меланоцитах.

Тирозиназа играет решающую роль в начальной стадии синтеза меланина, катализируя окисление L-тирозина (L-Tyr) в 3,4-дигидроксифенилаланин (ДОФА) и окисление ДОФА в допахинон [Solano F., Briganti S., Picardo M., Ghanem G. Hypopigmenting agents: An updated review on biological, chemical and clinical aspects. Pigment Cell Research, 2006, 19(6), P. 550-571. doi: 10.1111/j.l600-0749.2006.00334.x; 580; Sugimoto K., Nomura K., Nishimura Т., et al. Syntheses of alpha-arbutin-alpha-glycosides and their inhibitory effects on human tyrosinase. J. Biosci. Bioeng. 2005, 99(3), 272-276. doi: 10.1263/jbb.99.272.; Yan Z.F., Yang Y., Tian F.H., et al. Inhibitory and acceleratory effects of Inonotus obliquus on tyrosinase activity and melanin formation in B16 melanoma cells. Evid Based Complement Alternat Med., 2014, 2014, 259836. doi: 10.1155/2014/259836].

Проведено оптимизирование питательной среды путем добавления к жидкой глюкозо-триптонной среде (ГТС) аминокислоты тирозина. Полученные образцы меланина были испытаны на противовирусный эффект в отношении разных штаммов вируса гриппа и вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1).

Ниже приведены примеры заявляемых составов противовирусного средства.

Пример 1. Средство содержит водный раствор меланина из штамма базидиального гриба Inonotus obliquus F-1375 в концентрации 0,5 мг/мл, обладающий активностью против вируса гриппа (A/Aichi/2/68 (H3N2); A/chiken/Kurgan/05/2005 (H5N1); А/California/pdm09 (H1N1).

Пример 2. Средство содержит водный раствор меланина из штамма базидиального гриба Inonotus obliquus F-1375 в концентрации 1,0 мкг/мл, обладающий активностью против ВИЧ-1.

Пример 3. Средство содержит водный раствор меланина из штамма базидиального гриба Inonotus obliquus F-1375 в концентрации 1,3 мкг/мл, обладающий активностью против ВИЧ-1.

Пример 4. Средство содержит водный раствор меланина из штамма базидиального гриба Inonotus obliquus F-1375 в концентрации 4,0 мкг/мл, обладающий активностью против ВИЧ-1.

Пример 5. Средство содержит водный раствор меланина из штамма базидиального гриба Inonotus obliquus F-1375 в концентрации 5,0 мкг/мл, обладающий активностью против ВИЧ-1.

Пример 6. Получение биомассы мицелия на основе штамма Inonotus obliquus F-1375 в жидкой среде в стационарных условиях

Культивирование гриба

В работе использовали штамм базидиального гриба I. obliquus F-1375, депонированного в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (р.п. Кольцово, Новосибирская обл., Россия).

Глюкозо-триптонная среда (ГТС) содержала следующие компоненты (г/л): глюкоза - 30; триптон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; KH₂PO₄ - 1,1; K₂HPO₄×3H₂O - 4,4; MgSO₄×7H₂O - 0,25; вода - 1 л, значение рН 7-8. Агаризованная среда содержала жидкую среду ГТС, 20 г агар-агара из расчета на 1 л раствора [Штамм базидиального гриба Inonotus obliquus - продуцент пигмента меланина, обладающего противовирусной и противоопухолевой активностью. Патент RU 2716590 С1, опубл. 12.03.2020].

Первый этап культивирования проводили на чашках Петри, затем в стационарных условиях во флаконах объемом 500 мл, содержащих по 50 мл ГТС. Из колоний в чашках Петри стерильным пробочным сверлом диаметром 5 мм вырезали блоки и вносили по 1 шт. во флаконы объемом 500 мл с жидкой средой ГТС объемом 50 мл. В среду ГТС вносили добавку тирозин (L-Tyr) в ГТС в концентрациях 2, 10 и 20 мМ.

Длительность получения субстанции меланина

Весь цикл выращивания гриба - 57 сут:

9 сут - выращивание в чашках Петри при комнатной температуре,

48 сут - культивирование во флаконах при электрическом освещении при комнатной температуре, затем хранили в бытовом холодильнике и выделяли меланин.

Выделение меланина из культуральной жидкости (КЖ)

Содержимое флаконов процеживали через капроновый и бумажный фильтры, определяли объем, рН и оптическую плотность фильтратов при длине волны 465 нм. КЖ подкисляли до рН 1,5-2,0, центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 мин в центрифуге Centra CL3 («Thermo IEC», США), надосадочную жидкость отбрасывали, осадок растворяли в 0,1 М NaOH, доводили до рН 1,5-2,0, центрифугировали (переосаждение повторяли трижды, затем осадок промывали дважды 0,1 н HCl с последующим центрифугированием, очищенный осадок растворяли в деионизованной воде, доводили рН до 7,0-8,0 и сушили во взвешенной стеклянной чашке Петри при 30°С в сушильном шкафу ШС-80-01 СПУ производства ОАО «Смоленское специализированное конструкторско-технологическое бюро систем программного управления», г. Смоленск (Россия) в течение ночи. Чашки Петри взвешивали на весах OHAUS Pioneer РА64 (США).

Выделение меланина из биомассы мицелия

Биомассу мицелия отделяли от КЖ капроновым фильтром, взвешивали на весах SHINKO AJH (Япония), измельчали скальпелем и добавляли 2%-ную NaOH в соотношении 1:10. Гидролиз биомассы мицелия проводили в 2%-ной NaOH в течение 3 ч в водяной бане при 100°С.

Для проверки принадлежности выделенных пигментов к меланинам проводили три качественных теста на присутствие в их молекуле хиноидных и фенольных структур. Для проведения качественных реакций к 5 мл 0,1%-ного раствора пигмента в 0,1 М NaOH. приливали либо 0,5 мл 10%-ной Н₂О₂ (положительная реакция - обесцвечивание раствора), либо 0,1 мл 0,1 М KMnO₄ (положительная реакция - раствор зеленеет, при дополнительном добавлении 0,5 мл 0,1 М KMnO₄ раствор обесцвечивается, в осадок выпадают коричневые хлопья), либо 0,1 мл 5%-ного раствора FeCl₃ (положительная реакция - образуются крупные коричневые хлопья, в растворе с избытком хлорида железа осадок растворяется).

Спектры 0,01%-ных препаратов меланина при 240-700 нм регистрировали на цифровом спектрофотометре UV5Nano («Mettler Toledo», Швейцария).

Добавление очищенного L-тирозина в концентрации 10 мМ и 20 мМ приводили к двукратному увеличению выхода меланина по сравнению с контролем (таблица 1).

Эти образцы были взяты для оценки противовирусной активности в отношении ВИЧ-1 и штаммов вируса гриппа.

Пример 7. Оценка полученных образцов меланина в отношении ВИЧ-1

В качестве чувствительных к ВИЧ-1 клеток использовали лимфоидную культуру клеток человека МТ-4, полученную из коллекции клеточных культур ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Клетки МТ-4 культивировали на среде RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки, 2 mM Г-глютамина и 20 мкг/мл гентамицина. В работе использовали лабораторный штамм ВИЧ-1 субтипа А (при репродукции на МТ-4 вызывает 100% гибель клеток) из лабораторной коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Определение токсичности исследуемых препаратов проводили методом МТТ в 96-луночном планшете. В лунки планшета вносили по 40000 клеток МТ-4 в 100 мкл полной среды RPMI-1640. Исследовали препараты в начальной концентрации 500 мкг/мл с 2-кратным шагом разведения, по 3 повтора для каждого разведения препарата. Инкубирование клеток МТ-4 с исследуемыми разведениями препарата проводили 5 суток в CO2 инкубаторе при температуре 37°С и 5% CO₂. По результату тестирования токсичности препаратов для культуры клеток МТ-4 определяли для каждого препарата ТС₅₀ (концентрация, при которой жизнеспособными остаются 50% клеток). Исследование способности препаратов ингибировать размножение ВИЧ-1 проводили с начальной концентрации, равной ТС₅₀. Подавление репродукции ВИЧ исследуемыми препаратами оценивали путем определения изменения концентрации живых клеток МТ-4, инфицированных ВИЧ-1. Определение концентрации живых клеток проводили в 96-луночном планшете методом МТТ.

Клетки инфицировали постоянной дозой вируса, соответствующей 300 CCID50. Инкубирование клеток МТ-4 с исследуемыми разведениями препарата и вирусом проводили 5 суток в СО₂ инкубаторе при температуре 37°С и 5% СО₂. По результату определения концентрации живых клеток в экспериментальных и контрольных лунках определяли 50% противовирусную активность препарата (IC₅₀ - концентрация препарата, при которой ингибируется размножение ВИЧ-1 и защищены от ВИЧ остаются 50% клеток). Дополнительно определяли способности препарата блокировать размножение ВИЧ по степени снижения репродукции вирусного белка р24 в культуральной жидкости. Для количественного определения белка р24 ВИЧ-1 использовали иммуноферментные наборы ВектоВИЧ-1 р24-антиген-подтверждающий тест производства ЗАО ВекторБест.Учет и обработку полученных результатов проводили с помощью программы SoftMax Pro 4,0.

Статистический анализ результатов проводили в MS Excel 2010. Достоверность результатов оценивали с применением t-критерия Стьюдента. Различие считали достоверным при вероятности 95% (р≤0,05).

Пример 8. Результаты противовирусной активности образцов меланина в отношении ВИЧ-1

В таблице 2 представлены данные о противовирусной активности в отношении ВИЧ-1 и токсичности для клеток МТ-4 исследуемых препаратов меланина.

Цитотоксичность препаратов меланина оценивали по их влиянию на лимфоидные клетки человека культуры МТ-4. После пяти дней культивирования клеток при добавлении в питательную среду разных концентраций препаратов меланина было показано, что токсичность меланина варьировала от 164 мкг/мл до 250 мкг/мл. Антиретровирусная активность, определяемая двумя различными методами, была выявлена для всех исследуемых препаратов меланина. В таблице 2 представлены обобщенные данные по активности образцов меланина в отношении ВИЧ-1.

Меланин, выделенный из чаги, культивируемой на свету при добавлении тирозина, обладал наибольшей противовирусной активностью в отношении подавления репродукции ВИЧ-1 в клетках человека. Данный препарат имел средние характеристики по цитотоксичности, а его индекс селективности равнялся 192. При расчете показателя отношения TC₅₀/IC₅₀ использовали данные по концентрации меланина, способной блокировать репродукцию ВИЧ-1, полученные методом ИФА, так как этот метод позволяет выполнить количественную оценку концентрации вирусного белка, присутствующего в культуральной жидкости при культивировании инфицированных ВИЧ-1 клеток МТ-4.

Пример 9. Испытание образцов на противогриппозную активность

Для определения токсичности и противовирусной активности образцов меланина использовали перевиваемую линию клеток MDCK, полученную из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Клетки выращивали в среде DMEM (ООО «Биолот», Санкт-Петербург) в присутствии 10% инактивированной сыворотки крови плодов коровы (ООО «Биолот», Санкт-Петербург) и антибиотиков (пенициллин 11 МЕ/мл, стрептомицин 100 мкг/мл). Клеточную суспензию вносили в 96-луночные планшеты по 100 мкл в лунку с концентрацией 1,0-1,5×10⁵ кл./мл. Планшеты с клетками помещали в термостат при температуре 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности на 2-3 суток до образования клеточного монослоя.

В работе использовали штаммы вируса гриппа А: штамм вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) с инфекционным титром 7,25±0,49 lg ТЦД₅₀/мл; штамм адаптированного к лабораторным мышам вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) с инфекционным титром 4,50±0,69 lg ТЦД₅₀/мл; штамм пандемического вируса гриппа человека A/California/pdm09 (H1N1) с инфекционным титром 5,00±0,57 lg ТЦД₅₀/мл. Все используемые штаммы были получены из Государственной коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Концентрацию вируса каждого субтипа определяли путем титрования в культуре клеток MDCK при культивировании в течении 3 суток в термостате при температуре 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности. Титры вируса рассчитывали методом Спирмена-Кербера, выражали в десятичных логарифмах 50%-х тканевых цитопатических доз в 1 мл (lg ТЦД₅₀/мл) и представляли в виде М±I₉₅ (где М - среднее значение, I₉₅ - 95%-й доверительный интервал) и сравнивали по методу Спирмена-Кербера [Закс Л. Статистическое оценивание. М.: Статистика, 1976. - 598 с.; Mahy B.W.J., Kangro Н.О. Virology Methods Manual. - London: Academic Press, 1996. - 374 P.].

Пример 10. Результаты противовирусой активности образцов меланина в отношении разных штаммов вируса гриппа

Результаты испытания образцов на противогриппозную активность в отношении 3-х штаммов вируса гриппа (A/Aichi/2/68 (H3N2); A/chiken/Kurgan/05/2005 (H5N1); А/California/ pdm09 (H1N1) представлены в таблице 3.

Таким образом результаты, представленные в примерах 6-10 показывают достижение заявляемого технического результата состоящего в получении водорастворимого меланина из штамма базидиального гриба Inonotus obliquus F-1375, обладающего более высокой активностью против вирусов иммунодефицита человека и гриппа по показателям индекса селективности (ВИЧ-1) и индекса нейтрализации (вирус гриппа) по сравнению с прототипом. Кроме того, обеспечивается расширение сырьевой базы для получения меланина с более стандартизированными характеристиками по сравнению с природными источниками сырья (чагой), т.к. получение меланина из биомассы штамма базидиального гриба Inonotus obliquus F-1375 позволяет боле точно контролировать характеристики как биомассы указанного гриба, так и конечного продукта.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения водорастворимого пигмента меланина из базидиального гриба Inonotus obliquus, обладающего противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа и ВИЧ-1. Способ получения водорастворимого пигмента меланина из базидиального гриба Inonotus obliquus, обладающего противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа и ВИЧ-1, включает использование в качестве базидиального гриба Inonotus obliquus штамм F-1375, культивирование его на жидкой агаризованной питательной глюкозо-триптонной среде, содержащей агар-агар, глюкозу, дрожжевой экстракт, триптон, KH₂PO₄, K₂HPO₄×3 H₂O, MgSO₄×7 H₂O и воду до получения биомассы мицелия гриба в культуральной жидкости, гидролиз указанных компонентов с последующей очисткой, сушкой и получением водорастворимого пигмента меланина, при этом жидкая агаризованная питательная глюкозо-триптонная среда дополнительно содержит тирозин, при следующем количественном содержании указанных компонентов на 1 л раствора при рН 7-8: агар-агар 20 г, тирозин 10-20 мМоль, глюкоза 30 г, дрожжевой экстракт 5 г, триптон 10 г, KH₂PO₄ 1,1 г, K₂HPO₄×3 H₂O 4,4 г, MgSO₄×7 H₂O 0,25 г, вода остальное. Вышеописанный способ обеспечивает двукратное увеличение выхода меланина, а также получение противовирусного средства на основе меланина, обладающего более высокой активностью против вирусов иммунодефицита человека и гриппа. 3 табл., 10 пр.

Способ получения водорастворимого пигмента меланина из базидиального гриба Inonotus obliquus, обладающего противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа и ВИЧ-1, включающий использование в качестве базидиального гриба Inonotus obliquus штамм F-1375, культивирование его на жидкой агаризованной питательной глюкозо-триптонной среде, содержащей агар-агар, глюкозу, дрожжевой экстракт, триптон, KH₂PO₄, K₂HPO₄×3 H₂O, MgSO₄×7 H₂O и воду до получения биомассы мицелия гриба в культуральной жидкости, гидролиз указанных компонентов с последующей очисткой, сушкой и получением водорастворимого пигмента меланина, отличающийся тем, что жидкая агаризованная питательная глюкозо-триптонная среда дополнительно содержит тирозин, при следующем количественном содержании указанных компонентов на 1 л раствора при рН 7-8:

агар-агар 20 г тирозин 10-20 мМоль глюкоза 30 г дрожжевой экстракт 5 г триптон 10 г KH₂PO₄ 1,1 г K₂HPO₄×3 H₂O 4,4 г MgSO₄×7 H₂O 0,25 г вода остальное